Reacción de griess optimizada para UV-Vis y determinación a vista desnuda de primaquina antipalúdica

Resumen

Este protocolo describe un nuevo método colorimétrico para la detección de primaquinas antipalúdicas (PMQ) en orinas sintéticas y sueros humanos.

Resumen

Primaquina (PMQ), un importante medicamento antipalúdico, ha sido recomendado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) para el tratamiento de infecciones potencialmente mortales causadas por P. vivax y ovale. Sin embargo, PMQ tiene efectos adversos no deseados que conducen a la hemólisis aguda en pacientes con deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD). Hay una necesidad de desarrollar métodos simples y confiables para la determinación de PMQ con el propósito de la supervisión de dosis. A principios de 2019, hemos informado de un enfoque basado en UV-Vis y a simple vista para la cuantificación colorimétrica PMQ. La detección se basó en una reacción similar a la Griess entre PMQ y anilines, que puede generar productos azoicos de color. El límite de detección para la medición directa de PMQ en orina sintética está en el rango nanomolar. Además, este método ha demostrado un gran potencial para la cuantificación de PMQ a partir de muestras de suero humano a concentraciones clínicamente relevantes. En este protocolo, describiremos los detalles técnicos relativos a las síntesis y caracterización de los productos azo de color, la preparación del reactivo y los procedimientos para la determinación de PMQ.

Introducción

PMQ es uno de los fármacos antipalúdicos más importantes, funciona no sólo como un esquizontocida tisular para prevenir la recaída sino también como un gametocitocidio para interrumpir la transmisión de la enfermedad^1,2,3,4. La hemólisis intravascular es uno de los efectos secundarios preocupantes de La PMQ, que se vuelve extremadamente grave en aquellos deficientes en G6PD. Se sabe que el trastorno genético G6PD se distribuye en todo el mundo con una frecuencia genética entre el 3 y el 30% en las zonas endémicas de la malaria. La gravedad de la debilidad de PMQ depende del grado de deficiencia de G6PD, así como de la dosis y de la duración de la exposición a PMQ^5,6. Para reducir el riesgo, la OMS ha recomendado una dosis única baja (0,25 mg de base/kg) de PMQ para el tratamiento del paludismo. Sin embargo, esto todavía se desafia por las variaciones en la sensibilidad a los medicamentos del paciente^5,7. El control de la dosis es necesario para evaluar la farmacocinética después de la administración de PMQ, lo que puede afectar el ajuste de dosis para un tratamiento exitoso con toxicidad limitada.

La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es la técnica más utilizada para la determinación clínica de PMQ. Endoh et al. informaron de un sistema HPLC con un detector UV para la cuantificación de PMQ sérica utilizando una columna de gel de polímero C-18⁸. En su sistema, las proteínas séricas se precipitaron primero con acetonitrilo, y luego el PMQ en el sobrenadante se separó para HPLC. La curva de calibración fue lineal en el rango de concentración de 0,01-1,0 g/mL⁸. Otro método basado en un HPLC de fase inversa con detección UV a 254 nm se ha informado para la cuantificación de PMQ y sus principales metabolitos⁹. La curva de calibración para PMQ era lineal en el rango entre 0,025-100 g/ml. Se utilizó una extracción adicional líquido-líquido con hexano mezclado y acetato de etilo como fase orgánica para la separación de PMQ con una recuperación porcentual alcanzada al 89%^9. Más recientemente, Miranda y otros desarrollaron un método UPLC con detección UV a 260 nm para el análisis de PMQ en formulaciones de comprimidos con un límite de detección a 3 g/mL¹⁰.

Aunque los métodos HPLC exhiben una sensibilidad prometedora en la determinación de fármacos y la sensibilidad puede mejorarse aún más si el HPLC está equipado con un espectrómetro de masas, todavía hay algunas desventajas. Las mediciones directas de fármacos en fluidos biológicos suelen ser inaccesibles por HPLC, ya que muchas biomoléculas pueden influir en gran medida en el análisis. Se requieren extracciones adicionales para eliminar moléculas endógenas antes del análisis de HPLC^11,12. Además, la detección de PMQ por un detector HPLC-UV se realiza típicamente en su longitud de onda de absorción máxima (260 nm);; sin embargo, hay muchas moléculas endógenas en fluidos biológicos con una fuerte absorbancia a 260 nm (por ejemplo, aminoácidos, vitaminas, ácidos nucleicos y pigmentos urocromos), interfiriendo así con la detección UV PMQ. Es necesario desarrollar métodos simples y rentables para la determinación de PMQ con una sensibilidad y selectividad razonables.

La reacción griess fue presentada por primera vez en 1879 como una prueba colorimétrica para la detección de nitrito^13,14,15,16. Recientemente, esta reacción ha sido ampliamente explorada para detectar no sólo nitrito, sino también otras moléculas biológicamente relevantes^17,18,19,20. Hemos informado previamente del primer estudio sistemático de una reacción inesperada de Griess con PMQ(Figura 1). En este sistema, PMQ es capaz de formar azos de color cuando se combina con anilinas sustituidas en presencia de iones de nitrito en condiciones ácidas. Hemos encontrado además que el color de los azos variaba de amarillo a azul al aumentar el efecto de donación de electrones del sustituito en anilinas²¹. Se ha desarrollado un método colorimétrico basado en absorción UV para la cuantificación de PMQ a través de la reacción optimizada entre 4-metoxianilina y PMQ. Este método ha demostrado un gran potencial para la detección sensible y selectiva de PMQ en fluidos biorelevantes. Aquí, nuestro objetivo es describir los procedimientos detallados para la determinación de PMQ basados en esta estrategia colorimétrica.

Protocolo

1. Síntesis de Azos de colores

1. En un matraz inferior redondo de 25 ml (RBF), disolver anilina (0,1 mmol) y bisfosfato de primaquina (45,5 mg, 0,1 mmol) en 10 ml de solución de H₃PO₄ (5% v/v). Coloque el RBF en un baño de hielo, agregue una barra de agitación con el tamaño adecuado en la solución y coloque el RBF en una placa de agitación.
   NOTA: Para la síntesis de azo 3g (Figura 2), utilice 0,2 mmol de bisfosfato de primaquina.
2. Disolver NaNO₂ (6,9 mg, 0,1 mmol) en 1 ml de agua enfriada y luego añadir en la mezcla de reacción en forma de gota. Retire el baño de hielo y mantenga la mezcla de reacción agitada a temperatura ambiente.
3. Supervise la reacción con una placa de cromatografía de capa fina (TLC) recubierta de gel de sílice. Utilice una mezcla de diclorometano (DCM)/metanol (MeOH) (vol/vol a 5:1) como eluyente para TLC. El producto azo exhibe manchas de colores en la placa TLC, que es fácil de distinguir por los ojos desnudos. Detenga la reacción cuando las manchas PMQ desaparezcan en TLC.
4. Ajuste la mezcla de reacción a pH >10 por NaOH (2 M) en un baño de hielo. Utilice un embudo de separación de 50 ml para extraer la mezcla 3 veces con 20 ml de acetato de etilo para cada uno, combinar y concentrar la fase orgánica al vacío utilizando un evaporador rotatorio.
   NOTA: Antes de la extracción, ajuste el valor de pH de las soluciones de reacción por encima de 10. Esto puede mantener la amina primaria como su forma no ionizada, facilitando así la extracción.
5. Purificar los residuos mediante cromatografía flash con gel de sílice de fase inversa bajo presión normal, utilizando MeOH/H₂O como eluyente. Secar la solución del producto a través de la liofilización para dar los productos de azo deseados.
   NOTA: La misma reacción también se puede realizar en soluciones de HCl diluidas (0,2 M).

2. Mediciones UV-Vis y Cálculo Teórico

1. Disolver el azo puro (50 oM) en agua destilada o en una solución de 5% H₃PO₄ (pH 1.1), respectivamente. Registre espectros de absorción UV-vis (250-700 nm) en un espectrofotómetro a temperatura ambiente (25 oC). Exporte los datos como archivos .xls/.xlsx para su posterior análisis.
2. Realice todos los cálculos teóricos para los productos PMQ y azo utilizando el programa Gaussian 16. Utilice la teoría funcional de densidad dependiente del tiempo (TD-DFT) con un conjunto de base 6-31G. Incluir efectos solventes por formalismo del modelo continuo polarizado (PCM) utilizando agua.
   1. Utilice software (por ejemplo, Chemdraw Office) para dibujar las estructuras y luego guardar la estructura como un archivo de entrada gaussiano (.gif).
   2. Abra el archivo gif con Vista Gauss y haga clic en el botón Calcular. Seleccione Configuración de cálculo gaussiano, Opt+Freqy estado de tierra-DFT-B3LYP-6-31G; a continuación, haga clic en Enviar. La optimización de geometría generará un archivo .log.
   3. Siguiendo el procedimiento anterior, utilice Gauss View para abrir este archivo de registro. Haga clic en Calcular configuración de cálculo gaussiano y seleccione energía y TD-SCF-DFT-B3LYP-6-31G-Singlet solamente. A continuación, Enviar. El cálculo de energía generará otro archivo de registro y un archivo de cubo.
   4. Utilice la Vista Gauss para abrir el archivo de registro desde el cálculo de energía. Haga clic en Resultados-UV/Vis para ver la absorción prevista.
   5. Utilice la Vista Gauss para abrir el archivo de cubo. Haga clic en Resultados y seleccione acciones de superficie y contornos y nueva superficie para ver las órbitas.
3. Compare los resultados de la medición experimental y el cálculo gaussiano. Calcule el error de porcentaje entre los valores calculados y medidos, de acuerdo con la siguiente ecuación.
                 Error ? (W_max cal.-W_maxexper.) / W_maxexper. | • 100%
   donde W_max cal. representa la longitud de onda de absorción máxima del cálculo teórico y W_max exper. representa la longitud de onda del resultado experimental.

3. Determinación de PMQ

1. Medición PMQ utilizando una placa de 96 pocillos (Figura5)
   1. Disolver 4-metoxianilina en 0.2 M HCl para una solución de anilina de 200 mM, R1. Disolver el nitrito sódico en agua destilada para obtener una solución de 5 mM, R2. Mantener todas las soluciones en la nevera a 4 oC antes de su uso.
   2. Agregue 100 l de R1 en una placa de 96 pocillos y agregue 50 s de PMQ que contenga la muestra en la placa para mezclar con R1. A continuación, agregue 50 s l de R2 en la placa. Mezcle las soluciones mediante pipeteo repetido.
   3. Mantenga la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos y, a continuación, registre la absorbancia UV-vis a 504 nm. Repita 3x para cada prueba.  El producto azo es estable con exposición a la luz de la habitación; no es necesario mantener la placa bajo la oscuridad.
   4. Exporte los datos como archivos .xls/.xlsx para su posterior análisis.
2. Curva de calibración para la medición directa de PMQ en una muestra de orina
   1. Preparar soluciones PMQ utilizando orina sintética con concentraciones de PMQ a 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 M, respectivamente.
   2. Agregue 100 l de R1 en una placa de 96 pocillos y agregue 50 ml de solución de orina PMQ para mezclar con R1. A continuación, añadir 50 sl de R2 a la mezcla anterior. Mezcle las soluciones mediante pipeteo repetido. Mantenga la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos y, a continuación, registre la absorbancia UV-vis a 504 nm.
   3. Genere una curva de calibración basada en las concentraciones de absorbancia I₅₀₄ y PMQ. Utilice los valores de los pozos sin PMQ como espacio en blanco y reste los valores en blanco de todas las pruebas antes del procesamiento de datos.
   4. Realice un ajuste lineal para generar las ecuaciones lineales como Y - aX + b, donde Y es la intensidad de absorción en 504 nm, X es la concentración de PMQ, a es la pendiente, y b es la intercepción y de la línea lineal.
3. Curva de calibración para la medición directa de PMQ en una muestra de suero humano
   1. Preparar soluciones PMQ utilizando suero humano con concentraciones de PMQ a 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, M respectivamente.
   2. Agregue 100 l de R1 en una placa de 96 pocillos y agregue 50 ml de solución sérica PMQ para mezclar con R1. Agregue 50 s l de R2 a la mezcla anterior y mezcle las soluciones mediante pipeteo repetido. Mantenga la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego registre la absorbancia UV-vis a 504 nm. Exporte los datos como archivo .xls/.xlsx para su posterior análisis.
   3. Genere una curva de calibración basada en las concentraciones de absorbancia I₅₀₄ y PMQ. Utilice los valores de los pozos sin PMQ como espacio en blanco y reste los valores en blanco de todas las pruebas antes del procesamiento de datos.
   4. Realice un ajuste lineal para generar las ecuaciones lineales como Y - aX + b, donde Y es la intensidad de absorción en 504 nm, X es la concentración de PMQ, a es la pendiente, y b es la intercepción y de la línea lineal.
4. Extracción de PMQ del suero
   1. Agregue una cierta cantidad de PMQ en el suero humano para simular el suero que contiene PMQ. Para la extracción de PMQ, añadir 6 ml de mezcla de acetato de etilo/hexano (7:1 v/v) en 2 ml de suero que contiene PMQ en un tubo centrífugo de 15 ml.
   2. Añadir al sistema de extracción 100 ml de solución de hidróxido de sodio (2 M). Agitar violentamente el tubo usando un mezclador de vórtice durante 30 s. Recoger la capa orgánica y concentrarla usando un evaporador rotatorio al vacío.
   3. Vuelva a disolver el residuo con 200 ml de agua destilada y elimine los componentes lipídicos insolubles mediante filtración a través de una membrana en forma de disco con un tamaño de poro de 220 nm. Utilice la solución final para la prueba.
5. Determinar PMQ a partir del suero con extracción
   1. Siga los pasos 3.2 o 3.3 para generar la curva de calibración para PMQ en agua destilada. Extraiga PMQ de los sueros que contienen PMQ según el paso 3.4.
   2. Agregue 100 s de R1 y 50 l de solución PMQ en una placa de 96 pocillos. Agregue 50 sl de R2 a la mezcla anterior y mezcle las soluciones mediante pipeteo repetido.
   3. Mantenga la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos y registre la absorbancia UV-vis a 504 nm. Utilice los pozos con R1 y R2 pero sin PMQ como controles. Exporte los datos como archivos .xls/.xlsx para su posterior análisis.
   4. Restar los valores de control de los valores de absorbancia I₅₀₄ para cada prueba y, a continuación, utilice el resultado para los cálculos de concentración de acuerdo con la ecuación de revestimiento de la curva de calibración.
      NOTA: El límite de detección (LOD) para PMQ en todos los casos se puede calcular según un método estándar^22. El cálculo se basó en la función de calibración: LOD a 3,3 o SD/b, donde SD es la desviación estándar del espacio en blanco y b es la pendiente de la línea de regresión

Resultados

Para optimizar las condiciones de reacción(Figura 2), se utilizaron varias anilinas para acoplarse con PMQ a través de la reacción Griess. Hemos logrado una serie de azos con diferentes colores. Se ha encontrado que las anilinas con un sustituito de donación de electrones pueden causar un cambio rojo en el espectro de absorción UV-vis. Los cálculos teóricos se llevaron a cabo a través de la teoría funcional de la densidad dependiente del tiempo (TD-DFT). Como se presenta en

Discusión

Hemos descrito un método colorimétrico para la cuantificación conveniente de PMQ. Es potencialmente el método actual más simple y rentable. Lo que es más importante, este método ofrece la medición de PMQ basada en ojos desnudos sin utilizar ningún equipo.

La reacción Griess optimizada para la detección de PMQ puede generar un azo de color rojo con una absorción máxima a 504 nm. La influencia potencial de la absorción UV-vis de biomoléculas endógenas es limitada, lo que hace que...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Methoxyaniline	Aladdin	K1709027
2,4-Dimethoxyaniline	Heowns	10154207
3,4-Dimethoxyaniline	Bidepharm	BD21914
4-Methylaniline	Adamas-beta	P1414526
4-Nitroaniline	Macklin	C10191447
96-wells,Flat Botton	Labserv	310109008
Gaussian@16 software	Gaussian, Inc		Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux
Hydrochloric acid	GCRF	20180902
Marvin sketch (software)	CHEMAXON		free edition: 15.6.29
Phosphoric acid	Macklin	C10112815
Primaquine bisiphosphate	3A Chemicals	CEBK200054
Sodium nitrite	Alfa Aesar	5006K18R
Sulfonamides	TCI(shanghai)	GCPLO-BP
Varioskan LUX Plate reader	Thermo Fisher		Supplied with SkanIt Software 4.1