Оптимизированная реакция Griess для UV-Vis и Голый глаз Определение противомалярийных Primaquine

Резюме

Этот протокол описывает новый колористетрический метод для обнаружения противомалярийных примахин (ПМЗ) в синтетических мочах и сыворотках человека.

Аннотация

Primaquine (ПМЗ), важный противомалярийный препарат, был рекомендован Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) для лечения опасных для жизни инфекций, вызванных P. vivax и ovale. Тем не менее, ПМЗ имеет нежелательные побочные эффекты, которые приводят к острому гемолизу у пациентов с дефицитом глюкозы-6-фосфат дегидрогеназы (G6PD). Существует необходимость в разработке простых и надежных методов определения ПМЗ с целью мониторинга дозировки. В начале 2019 года мы сообщили о УФ-Вис и невооруженным глазом подход для PM' колористельной количественной оценки. Обнаружение было основано на Griess-подобной реакции между ПМЗ и анилинами, которые могут генерировать цветные продукты азо. Предел обнаружения для прямого измерения ПМЗ в синтетической моче находится в наномолярном диапазоне. Кроме того, этот метод показал большой потенциал для количественной оценки ПМЗ из образцов сыворотки человека в клинически значимых концентрациях. В этом протоколе мы опишите технические детали, касающиеся синтеза и характеристики цветных продуктов азо, подготовки реагента, а также процедур определения ПМЗ.

Введение

ПМЗ является одним из наиболее важных противомалярийных препаратов, он работает не только как шизонтоцид тканей для предотвращения рецидива, но и как геймтоцитоцид, чтобы прервать передачу болезни^1,2,3,4. Внутрисосудистый гемолизявляется является одним из связанных побочных эффектов ПМЗ, который становится чрезвычайно серьезным в тех, дефицит G6PD. Известно, что генетическое заболевание G6PD распространяется по всему миру с частотой генов между 3-30% в эндемичных по малярии районах. Тяжесть слабости ПМЗ зависит от степени дефицита G6PD, а также дозы и продолжительности воздействия ПМЗ^5,6. Для снижения риска ВОЗ рекомендовала для лечения малярии одну низкую дозу (0,25 мг базы/кг) ПМЗ. Тем не менее, это по-прежнему оспаривается изменения в чувствительности пациента наркотиков^5,7. Мониторинг дозы необходим для оценки фармакокинетики после введения ПМЗ, что может повлиять на корректировку дозировки для успешного лечения с ограниченной токсичностью.

Высокопроизводительная жидкая хроматография (HPLC) является наиболее широко используемым методом клинического определения ПМЗ. Эндох и др. сообщили о системе HPLC с УФ-детектором для количественной оценки сыворотки с помощью колонки полимерного геля C-18⁸. В их системе белки сыворотки сначала осаждались ацетонитрилом, а затем ПМЗ в супернатанте был отделен для HPLC. Кривая калибровки была линейной над диапазоном концентрации от 0,01-1,0 мкг/мл^8. Другой метод, основанный на обратной фазе HPLC с УФ-обнаружением на уровне 254 нм, был зарегистрирован для количественной оценки ПМЗ и его основных метаболитов^9. Кривая калибровки для ПМЗ была линейной в диапазоне от 0,025-100 мкг/мл. Дополнительная жидко-жидкая экстракция со смешанным гексаном и этиловым ацетатом в качестве органической фазы использовалась для разделения ПМЗ с процентным восстановлением, достигаемым до 89%^9. Совсем недавно, Миранда и др. разработали метод UPLC с УФ-обнаружения на 260 нм для анализа ПМЗ в таблетках формулировки с пределом обнаружения на 3 мкг /мл¹⁰.

Хотя методы HPLC демонстрируют многообещающую чувствительность в определении наркотиков и чувствительность может быть дополнительно улучшена, если HPLC оснащен масс-спектрометр, Есть еще некоторые недостатки. Прямые измерения лекарственных средств в биологических жидкостях, как правило, недоступны HPLC, так как многие биомолекулы могут значительно влиять на анализ. Дополнительные экстракции необходимы для удаления эндогенных молекул до анализа HPLC^11,12. Кроме того, обнаружение ПМЗ с помощью детектора HPLC-UV обычно выполняется на максимальной длине волны поглощения (260 нм); однако в биологических жидкостях много эндогенных молекул с сильным абсорбцией на уровне 260 нм (например, аминокислоты, витамины, нуклеиновые кислоты и урохромные пигменты), что мешает обнаружению УФ-излучения ПМЗ. Необходимо разработать простые и экономически эффективные методы определения ПМЗ с разумной чувствительностью и избирательностью.

Реакция Griess впервые была представлена в 1879 году в качестве колориметрического теста для обнаружения нитритов^13,14,15,16. В последнее время эта реакция была широко изучена для обнаружения не только нитрита, но и других биологически значимых молекул^17,18,19,20. Ранее мы сообщали о первом систематическом исследовании неожиданной реакции Грисса с ПМЗ(рисунок 1). В этой системе, ПМЗ способен образовывать цветные азо, когда в сочетании с заменой анилин в присутствии нитритов ионов в кислых условиях. Мы также обнаружили, что цвет азов варьировался от желтого до синего при увеличении эффекта пожертвований электрона на анилин²¹. Уф-виз поглощения на основе колористического метода для количественной оценки ПМЗ был разработан с помощью оптимизированной реакции между 4-метоксианилин и ПМЗ. Этот метод показал большой потенциал для чувствительного и селективного обнаружения ПМЗ в биосоответствующих жидкостях. Здесь мы стремимся описать подробные процедуры определения ПМЗ, основанные на этой колористельной стратегии.

протокол

1. Синтез цветного азоса

1. В 25 мл круглой нижней колбы (RBF), растворить анилин (0,1 ммоль) и примахин бисфосфат (45,5 мг, 0,1 ммоль) в 10 мл H₃PO₄ раствор (5% v/v). Положите RBF на ледяную ванну, добавить перемешать бар с соответствующим размером в раствор, и положить RBF на перемешать пластины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для синтеза азо 3г (рисунок 2),используйте 0,2 ммоль примакина бисфосфата.
2. Растворите NaNO₂ (6,9 мг, 0,1 ммоль) в 1 мл охлажденной воды, а затем добавьте в реакционную смесь dropwise. Удалите ледяную ванну и держите реакционную смесь перемешивание при комнатной температуре.
3. Мониторинг реакции с кремнезема гель покрытием тонкослойной хроматографии (TLC) пластины. Используйте смесь дихлорметана (DCM)/метанола (MeOH) (vol/vol 5:1) в качестве eluent для TLC. Продукт азо имеет цветные пятна на пластине TLC, которую легко различить невооруженным глазом. Остановите реакцию, когда пятна PM' исчезают на TLC.
4. Отрегулируйте реакционную смесь на рГ no10 на NaOH (2 M) на ледяной ванне. Используйте 50 мл разделения воронки для извлечения смеси 3 раза с 20 мл этилового ацетата для каждого, объединить и концентрировать органическую фазу под вакуумом с помощью роторного испарителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед извлечением отрегулируйте значение рН реакционных растворов более 10. Это может поддерживать первичный амин в качестве его неионизированной формы, тем самым облегчая добычу.
5. Очистите остатки с помощью флэш-хроматографии с обратной фазы кремнезема гель под нормальным давлением, используя MeOH/H₂O как eluent. Сухие раствор продукта через лиофилизации, чтобы дать желаемые продукты азо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Такая же реакция может быть выполнена и в разбавленных растворах HCl (0,2 м).

2. УФ-Вис измерения и теоретические расчеты

1. Растворите чистый азо (50 мкм) в дистиллированной воде или в 5% H₃PO₄ раствор (pH 1.1), соответственно. Запись УФ-виз-спектра поглощения (250-700 нм) на спектрофотометре при комнатной температуре (25 градусов по Цельсию). Экспорт данных как файлы .xls/.xlsx для дальнейшего анализа.
2. Выполняйте все теоретические расчеты для самого ПМЗ и продуктов азо с помощью программы Gaussian 16. Используйте функциональную теорию зависимости от времени плотности (TD-DFT) с базовым набором 6-31G. Включить эффекты растворителя с помощью поляризуемой модели континуума (PCM) с использованием воды.
   1. Используйте программное обеспечение (например, Chemdraw Office) для рисования структур, а затем сохраните структуру в качестве гаусского файла ввода (.gif).
   2. Откройте файл GIF с Гаусс Посмотреть и нажмите кнопку Рассчитать. Выберите гауссийский расчет настройки, Opt-Freq, и наземные государства-DFT-B3LYP-6-31G; затем нажмите Отправить. Оптимизация геометрии будет генерировать файл .log.
   3. Следуя вышеупомянутой процедуре, используйте Gauss View, чтобы открыть этот файл журнала. Нажмите Рассчитать-Gaussian Расчет настройки и выбрать энергию и TD-SCF-DFT-B3LYP-6-31G-Singlet только. Затем отправить. Расчет энергии будет генерировать другой файл журнала и кубический файл.
   4. Используйте вид Gauss, чтобы открыть файл журнала из расчета энергии. Нажмите Результаты-УФ/Вис, чтобы увидеть прогнозируемое поглощение.
   5. Используйте вид Gauss, чтобы открыть файл куба. Нажмите Results и выберите поверхностные и контурные поверхностные действия и новую поверхность, чтобы увидеть орбиты.
3. Сравните результаты как экспериментального измерения, так и гауссовского расчета. Рассчитать процентную погрешность между рассчитанными и измеренными значениями, согласно следующему уравнению.
                 Ошибка в г. (W_max cal.-W_maxexper.) / W_максExper. | 100%
   где W_max cal. представляет максимальную длину волны поглощения от теоретического расчета и W_max exper. представляет длину волны от экспериментального результата.

3. Определение ПМЗ

1. Измерение ПМЗ с использованием 96-колодецной пластины(рисунок 5)
   1. Растворите 4-метоксианилин в 0,2 М ЛЦ для анилина для 200 мМ, R1. Растворите нитрит натрия в дистиллированной воде, чтобы получить раствор 5 мМ, R2. Храните все растворы в холодильнике при 4 градусах Цельсия перед использованием.
   2. Добавьте 100 qL R1 в 96-колодую пластину и добавьте 50 л ПМЗ, содержащий образец, в тарелку, чтобы смешаться с R1. Затем добавьте в тарелку 50 л R2. Смешайте растворы путем повторного пипетки.
   3. Держите пластину при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем запишите уф-виз абсорбции на 504 нм. Повторите 3x для каждого теста.  Продукт азо стабилен с воздействием света комнаты; не нужно держать тарелку в темноте.
   4. Экспорт данных как файлы .xls/.xlsx для дальнейшего анализа.
2. Кривая калибровки для прямого измерения ПМЗ в образце мочи
   1. Подготовка растворов ПМЗ с использованием синтетической мочи с концентрациями ПМЗ в 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 мкм, соответственно.
   2. Добавьте 100 qL R1 в 96-колодую пластину и добавьте 50 л раствора мочи ПМЗ, чтобы смешать сястой с R1. Затем добавьте 50 зл R2 в вышеупомянутую смесь. Смешайте растворы путем повторного пипетки. Держите пластину при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем запишите уф-виз абсорбции на 504 нм.
   3. Создайте кривую калибровки на основе концентраций абсорбции I₅₀₄ и ПМЗ. Используйте значения из скважин без PM, как пробел, и вычесть пустые значения из всех тестов до обработки данных.
   4. Выполните линейную подгонку для создания линейных уравнений, как Y и aX'b, где Y является интенсивность поглощения на 504 нм, X является концентрация ПМЗ, является склон, и b является y-перехват линейной линии.
3. Кривая калибровки для прямого измерения ПМЗ в образце сыворотки человека
   1. Подготовьте решения ПМЗ с использованием сыворотки человека с концентрациями ПМЗ по 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, ММ соответственно.
   2. Добавьте 100 qL R1 в 96-колодую пластину и добавьте 50 л раствора сыворотки PM, чтобы смешать с R1. Добавьте 50 кЛ R2 в приведенную выше смесь и смешайте растворы путем повторного пипетки. Держите пластину при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем запишите УФ-виз абсорбции на 504 нм. Экспорт данных как файл .xls/.xlsx для дальнейшего анализа.
   3. Создайте кривую калибровки на основе концентраций абсорбции I₅₀₄ и ПМЗ. Используйте значения из скважин без PM, как пробел, и вычесть пустые значения из всех тестов до обработки данных.
   4. Выполните линейную подгонку для создания линейных уравнений, как Y и aX'b, где Y является интенсивность поглощения на 504 нм, X является концентрация ПМЗ, является склон, и b является y-перехват линейной линии.
4. Извлечение ПМЗ из сыворотки
   1. Добавьте определенное количество ПМЗ в сыворотку человека, чтобы имитировать сыворотку, содержащую ПМЗ. Для извлечения ПМЗ добавьте 6 мл смеси этилового ацетата/гексана (7:1 v/v) в 2 мл сыворотки, содержащей ПМЗ, в 15 мл центрифуги в метро 15 мл.
   2. Добавьте в систему экстракции 100 л гидроксида натрия (2 М). Яростно встряхните трубку с помощью вихревого смесителя на 30 с. Соберите органический слой и сконцентрируйте его с помощью роторного испарителя под вакуумом.
   3. Растворите остатки с 200 л дистиллированной воды и удалите нерастворимые липидные компоненты путем фильтрации через дискообразную мембрану с размером 220 нм пор. Используйте окончательное решение для тестирования.
5. Определить ПМЗ из сыворотки с экстракции
   1. Выполните шаги 3.2 или 3.3 для создания кривой калибровки для ПМЗ в дистиллированной воде. Извлекайте ПМЗ из сывороток, содержащих ПМЗ, в соответствии с шагом 3.4.
   2. Добавьте 100 л раствора R1 и 50 л раствора PM' в 96-колодую пластину. Добавьте 50 кЛ R2 выше смеси, и смешать растворы путем повторного пипетки.
   3. Держите пластину при комнатной температуре в течение 15 минут и запишите уф-виз абсорбции на 504 нм. Используйте скважины с R1 и R2, но без PM' в качестве элементов управления. Экспорт данных как файлы .xls/.xlsx для дальнейшего анализа.
   4. Вычесть значения управления из значений абсорбции I₅₀₄ для каждого теста, а затем использовать результат для расчетов концентрации в соответствии с уравнением лайнера из кривой калибровки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предел обнаружения (LOD) для ПМЗ во всех случаях может быть рассчитан по стандартному методу²². Расчет был основан на функции калибровки: LOD 3.3 SD/b, где SD является стандартным отклонением пустой и b является наклоном регрессионной линии

Результаты

Для оптимизации условий реакции(Рисунок 2), различные анилины были использованы для пары с ПМЗ через реакцию Griess. Мы достигли серии азо с разными цветами. Было установлено, что анилины с электронным заменяющим заменитель может вызвать красный сдвиг в УФ-виз абсорбции спе...

Обсуждение

Мы описали колористетрический метод для удобной количественной оценки ПМЗ. Потенциально это самый простой и экономически эффективный текущий метод. Что еще более важно, этот метод предлагает позволяет невооруженным глазом измерения PM, без использования какого-либо оборудования.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Methoxyaniline	Aladdin	K1709027
2,4-Dimethoxyaniline	Heowns	10154207
3,4-Dimethoxyaniline	Bidepharm	BD21914
4-Methylaniline	Adamas-beta	P1414526
4-Nitroaniline	Macklin	C10191447
96-wells,Flat Botton	Labserv	310109008
Gaussian@16 software	Gaussian, Inc		Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux
Hydrochloric acid	GCRF	20180902
Marvin sketch (software)	CHEMAXON		free edition: 15.6.29
Phosphoric acid	Macklin	C10112815
Primaquine bisiphosphate	3A Chemicals	CEBK200054
Sodium nitrite	Alfa Aesar	5006K18R
Sulfonamides	TCI(shanghai)	GCPLO-BP
Varioskan LUX Plate reader	Thermo Fisher		Supplied with SkanIt Software 4.1