UV-Vis및 말라리아 방지 프리마퀸의 육안 측정을 위한 최적화된 Griess 반응

요약

이 프로토콜은 합성 소변 및 인간 혈청에서 말라리아 프리마퀸 (PMQ) 검출을위한 새로운 색채 방법을 설명합니다.

초록

Primaquine (PMQ), 중요 한 안티 말라리아 약물, 세계 보건 기구에 의해 권장 되었습니다 (WHO) P. vivax와 ovale에의해 발생 하는 생명을 위협 하는 감염의 치료에 대 한. 그러나, PMQ는 포도당-6-인산 탈수소 효소 (G6PD) 결핍을 가진 환자에 있는 심각한 용혈으로 이끌어 내는 원치 않는 역효과가 있습니다. 복용량 모니터링의 목적으로 PMQ 결정에 대 한 간단 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 개발 하는 필요가 있다. 2019년 초, PMQ 색채 정량화를 위한 UV-Vis 및 육안 기반 접근법을 보고했습니다. 검출은 PMQ와 anilines 사이의 Griess와 같은 반응을 기반으로하여 착색 된 아조 제품을 생성 할 수 있습니다. 합성 소변에서 PMQ의 직접 측정에 대한 검출 한계는 나노 몰 범위에 있다. 더욱이, 이 방법은 임상적으로 관련된 농도에서 인간 혈청 샘플로부터 PMQ 정량화에 대한 큰 잠재력을 보여주었다. 이 프로토콜에서는 유색 아조 제품의 합성 및 특성화, 시약 준비 및 PMQ 결정 절차에 대한 기술적 세부 사항을 설명합니다.

서문

PMQ는 가장 중요한 말라리아 약물 중 하나이며, 재발을 방지하기 위해 조직 주혈계뿐만 아니라 질병^전염을방해하는 게임 세포질로도 작동1,^2,3,4. 혈관 내 용혈은 PMQ의 부작용에 관한 중 하나입니다, 이는 G6PD에 그 결핍에 매우 심각해진다. G6PD 유전 무질서는 말라리아 풍토성 지역에 있는 3-30% 사이 유전자 주파수로 세계전반 분포한다는 것을 알려지다. PMQ 약점의 엄격은 G6PD 부족의 정도 뿐만 아니라 복용량 및 PMQ 노출의 내구에 달려^{있습니다5,6.} 위험을 낮추기 위해 WHO는 말라리아 치료를 위해 PMQ의 단일 저용량(0.25 mg 염기/kg)을 권장했습니다. 그러나, 이것은 여전히 환자 약물 감수성^5,7의변화에 의해 도전된다. 용량 모니터링은 PMQ 투여 후 약물 동력학을 평가하는 데 필요하며, 이는 제한된 독성으로 성공적인 치료를 위한 투여 량 조정에 영향을 미칠 수 있다.

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 PMQ 임상 측정에 가장 널리 사용되는 기술입니다. Endoh 등은 C-18 폴리머 겔 컬럼^8을사용하여 혈청 PMQ 정량화를 위한 UV 검출기를 이용한 HPLC 시스템을 보고하. 그들의 시스템에서, 혈청 단백질은 먼저 아세토니트릴로 침전되었고, 그 후 상층부에서PMQ를 HPLC용으로 분리시켰다. 교정 곡선은 0.01-1.0 μg/mL^8의농도 범위에 걸쳐 선형이었습니다. 254 nm에서 UV 검출을 이용한 역상 HPLC에 기초한 또 다른 방법은 PMQ 및 이의 주요 대사산물^9의정량화를 위해 보고되었다. PMQ의 교정 곡선은 0.025-100 μg/mL 사이의 범위에서 선형이었습니다. 유기상으로서 헥산과 에틸 아세테이트를 혼합한 추가의 액체-액체 추출은 89%^9에도달한 백분율 회수와 함께 PMQ 분리를 위해 사용되었다. 최근에는 미란다 외가 3 μg/mL^10의검출 한계를 가진 정제 제형에서 PMQ 분석을 위해 260 nm에서 UV 검출을 하는 UPLC 방법을 개발했습니다.

HPLC 방법은 약물 측정에 유망한 감도를 나타내고 HPLC가 질량 분석기가 장착되어 있는 경우 감도가 더욱 향상될 수 있지만 여전히 몇 가지 단점이 있습니다. 많은 생체 분자가 분석에 크게 영향을 미칠 수 있기 때문에 생물학적 유체의 직접 약물 측정은 일반적으로 HPLC에 의해 접근 할 수 없습니다. 추가 추출은 HPLC 분석^11,12전에 내인성 분자를 제거하는 데 필요합니다. 더욱이, HPLC-UV 검출기에 의한 PMQ 검출은 전형적으로 최대 흡수 파장(260 nm)에서 수행된다. 그러나, 260 nm에서 강한 흡광도를 가진 생물학 액체에 있는 많은 내인성 분자가 있습니다 (예를 들면, 아미노산, 비타민, 핵산 및 비뇨기과 색소), 따라서 PMQ UV 검출을 방해하. 합리적인 감도와 선택성을 갖춘 PMQ 측정을 위한 간단하고 비용 효율적인 방법을 개발할 필요가 있습니다.

Griess 반응은 아질산염^{검출13,14,15,16에}대한 비대검 시험으로서 1879년에 처음 발표되었다. 최근, 이러한 반응은 아질산염뿐만 아니라 다른 생물학적으로 관련된 분자^{17,18,19,20을}검출하기 위해 광범위하게 탐구되고 있다. 우리는 이전에 PMQ를 가진 예기치 않은 Griess 반응의 첫번째 체계적인 연구 결과 보고했습니다(그림 1). 이 시스템에서 PMQ는 산성 조건하에서 아질산 이온이있는 경우 대체 된 음선과 결합 될 때 착색 된 아조스를 형성 할 수 있습니다. 우리는 또한 아조스의 색이^{음질(21)에}대한 대체물의 대체기의 기부 효과를 증가시킬 때 노란색에서 파란색으로 변화한다는 것을 발견했다. PMQ 정량화를 위한 UV-vis 흡수 기반 착색 방법은 4-메톡시아닌산염과 PMQ 사이의 최적화된 반응을 통해 개발되었습니다. 이 방법은 생체 관련 유체에서 PMQ의 민감하고 선택적 검출에 대한 큰 잠재력을 보여주었습니다. 여기서는 이 대색 전략을 기반으로 PMQ 결정에 대한 자세한 절차를 설명하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

1. 유색 아조스의 합성

1. 25 mL 라운드 바닥 플라스크(RBF)에서, 안일린(0.1 mmol)과 프리마퀸 비스포스페이트(45.5 mg, 0.1 mmol)를 H₃PO₄ 용액 10 mL(5% v/v)로 용해시. 얼음 욕조에 RBF를 넣고, 용액에 적절한 크기의 교반 바를 추가하고, 교반 판에 RBF를 넣어.
   참고: 아조 3g (그림 2)의합성을 위해, 프리마퀸 비스포스페이트 0.2 mmol을 사용한다.
2. NaNO₂ (6.9 mg, 0.1 mmol)를 냉각수 1 mL에 녹인 다음 반응 혼합물을 드롭 으로 첨가하십시오. 얼음 욕조를 제거하고 반응 혼합물을 실온에서 교반하십시오.
3. 실리카 겔 코팅 된 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) 플레이트로 반응을 모니터링합니다. 디클로로메탄(DCM)/메탄올(MeOH) 혼합물(vol/vol = 5:1)을 TLC용 용리온으로 사용하십시오. Azo 제품은 TLC 플레이트에 색이 있는 반점을 나타내며, 육안으로 구별하기 쉽습니다. TLC에서 PMQ 반점이 사라지면 반응을 멈춥시다.
4. 얼음 욕조에서 NaOH (2M)에 의해 pH >10로 반응 혼합물을 조정합니다. 50 mL 분리 깔때기를 사용하여 각각 20 mL의 에틸 아세테이트와 혼합물을 3 회 추출하고 회전 증발기를 사용하여 진공 하에서 유기 상을 결합하고 농축하십시오.
   참고: 추출하기 전에 반응 솔루션의 pH 값을 10 이상으로 조정합니다. 이것은 그것의 비 이온화한 양식으로 1 차적인 아민을 유지할 수 있습니다, 따라서 추출을 용이하게.
5. MeOH/H₂O를 용리온으로 사용하여 정상 압력하에서 역상 실리카 젤로 플래시 크로마토그래피로 잔기를 정화합니다. 용이성 화를 통해 제품 용액을 건조하여 원하는 아조 제품을 제공합니다.
   참고: 희석된 HCl 솔루션(0.2 M)에서도 동일한 반응을 수행할 수 있다.

2. UV-Vis 측정 및 이론적 계산

1. 순수 아조(50 μM)를 증류수 또는 5% H₃PO₄ 용액(pH 1.1)에 각각 용해합니다. 실온(25°C)에서 분광광도계에 UV-vis 흡수 분광법(250-700 nm)을 기록합니다. 추가 분석을 위해 데이터를 .xls/.xlsx 파일로 내보냅니다.
2. 가우시안 16 프로그램을 사용하여 PMQ 자체 및 아조 제품에 대한 모든 이론적 계산을 수행합니다. 6-31G 기준 세트를 사용하여 시간 의존 밀도 함수 이론(TD-DFT)을 사용합니다. 물을 사용하여 편광 가능한 연속체 모델(PCM) 형식주의에 의한 용매 효과를 포함합니다.
   1. 소프트웨어(예: Chemdraw Office)를 사용하여 구조를 그린 다음 구조를 가우시안 입력 파일(.gif)으로 저장합니다.
   2. 가우스 보기로 GIF 파일을 열고 계산버튼을 클릭합니다. 가우시안 계산 설정, 옵트+주파수및 접지 상태 DFT-B3LYP-6-31G를 선택합니다. 그런 다음 제출을클릭합니다. 형상 최적화는 .log 파일을 생성합니다.
   3. 위의 절차에 따라 Gauss View를 사용하여 이 로그 파일을 엽니다. 계산 -가우시안 계산 설정을 클릭하고 에너지와 TD-SCF-DFT-B3LYP-6-31G-싱글만선택합니다. 그런 다음 을 제출합니다. 에너지 계산은 다른 로그 파일과 큐브 파일을 생성합니다.
   4. 가우스 뷰를 사용하여 에너지 계산에서 로그 파일을 엽니다. 결과-UV/Vis를 클릭하여 예측된 흡수를 확인합니다.
   5. 가우스 뷰를 사용하여 큐브 파일을 엽니다. 결과s를 클릭하고 곡면 및 등고선-곡면 작업및 새 곡면을 선택하여 궤도를 확인합니다.
3. 실험 측정과 가우시안 계산의 결과를 비교합니다. 다음 방정식에 따라 계산된 값과 측정값 사이의 백분율 오차를 계산합니다.
                 오류 = | (W_최대 cal.-W_최대최대 내량. / W_최대엑스퍼. | × 100 %
   여기서 W_max cal.은 이론적 계산및 W_max exper의 최대 흡광도 파장을 나타냅니다. 는 실험 결과에서 파장을 나타냅니다.

3. PMQ 결정

1. 96웰 플레이트를 이용한 PMQ 측정(그림5)
   1. 200 mM 애니라인 용액, R1을 위해 0.2 M HCl에 4-메톡시아니린을 용해시다. 증류수에 아질산 나트륨을 용해하여 5 mM 용액, R2를 얻습니다. 사용하기 전에 냉장고에 있는 모든 용액을 4°C로 유지하십시오.
   2. R1 100 μL을 96웰 플레이트에 넣고 샘플을 함유한 PMQ 50 μL을 플레이트에 추가하여 R1과 혼합합니다. 그런 다음 접시에 R2 50 μL을 추가합니다. 반복파이팅으로 솔루션을 혼합합니다.
   3. 플레이트를 실온에서 15분 동안 유지한 다음 UV-vis 흡광도를 504 nm로 기록합니다. 각 테스트에 대해 3x를 반복합니다.  azo 제품은 실내 조명 노출로 안정적입니다. 접시를 어둡게 유지할 필요가 없습니다.
   4. 추가 분석을 위해 데이터를 .xls/.xlsx 파일로 내보냅니다.
2. 소변 샘플에서 직접 PMQ 측정을 위한 교정 곡선
   1. PMQ 농도가 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 μM에서 합성 소변을 사용하여 PMQ 솔루션을 준비합니다.
   2. 100 μL의 R1을 96웰 플레이트에 넣고 50 μL의 PMQ 소변 용액을 추가하여 R1과 혼합합니다. 그런 다음 위의 혼합물에 R2 50 μL을 추가합니다. 반복파이팅으로 솔루션을 혼합합니다. 플레이트를 실온에서 15분 동안 유지한 다음 UV-vis 흡광도를 504 nm로 기록합니다.
   3. 흡광도 I₅₀₄ 및 PMQ 농도에 기초하여 캘리브레이션 곡선을 생성한다. PMQ가 없는 웰의 값을 공백으로 사용하고 데이터 처리 전에 모든 테스트에서 빈 값을 뺍니다.
   4. 선형 맞춤을 수행하여 선형 방정식을 Y = aX+b로생성하고, 여기서 Y는 504 nm의 흡광도 강도이고, X는 PMQ의 농도이고, a는 경사이고, b는 선형 선의 y-절편이다.
3. 인간 혈청 시료에서 직접 PMQ 측정을 위한 교정 곡선
   1. 각각 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, μM에서 PMQ 농도로 인간 혈청을 사용하여 PMQ 솔루션을 준비합니다.
   2. 100 μL의 R1을 96웰 플레이트에 넣고 50 μL의 PMQ 세럼 용액을 추가하여 R1과 혼합합니다. 위의 혼합물에 R2 50 μL을 추가하고 반복파이팅하여 솔루션을 혼합합니다. 플레이트를 실온에서 15분 간 유지한 다음 UV-vis 흡광도를 504 nm로 기록합니다. 추가 분석을 위해 데이터를 .xls/.xlsx 파일로 내보냅니다.
   3. 흡광도 I₅₀₄ 및 PMQ 농도에 기초하여 캘리브레이션 곡선을 생성한다. PMQ가 없는 웰의 값을 공백으로 사용하고 데이터 처리 전에 모든 테스트에서 빈 값을 뺍니다.
   4. 선형 맞춤을 수행하여 선형 방정식을 Y = aX+b로생성하고, 여기서 Y는 504 nm의 흡광도 강도이고, X는 PMQ의 농도이고, a는 경사이고, b는 선형 선의 y-절편이다.
4. 혈청에서 PMQ 추출
   1. PMQ 함유 세럼을 시뮬레이션하기 위해 일정량의 PMQ를 인간 세럼에 추가합니다. PMQ 추출을 위해, 에틸 아세테이트/헥산(7:1 v/v)의 혼합물 6 mL를 15 mL 원심분리기 튜브에 PMQ 함유 세럼 2mL에 넣습니다.
   2. 추출 시스템에 수산화 나트륨 (2M) 용액 100 μL을 추가하십시오. 30s. 유기층을 수집하고 진공 하에서 회전 증발기를 사용하여 농축하는 와류 믹서를 사용하여 튜브를 격렬하게 흔들어 줍니다.
   3. 200 μL의 증류수로 잔류물을 재용해 내고 220 nm 크기의 디스크 모양 멤브레인을 통해 여과하여 불용성 지질 성분을 제거합니다. 테스트를 위해 최종 솔루션을 사용합니다.
5. 추출로 혈청에서 PMQ 결정
   1. 3.2 또는 3.3 단계를 수행하여 증류수에서 PMQ에 대한 교정 곡선을 생성합니다. 3.4단계에 따라 PMQ 함유 세럼에서 PMQ를 추출합니다.
   2. 100 μL의 R1 및 50 μL의 PMQ 용액을 96웰 플레이트에 추가합니다. 위의 혼합물에 R2 50 μL을 추가하고 반복 파이펫팅으로 솔루션을 혼합합니다.
   3. 플레이트를 실온에서 15분 동안 유지하고 UV-vis 흡광도를 504 nm로 기록합니다. 제어로 PMQ없이 R1 및 R2와 우물을 사용합니다. 추가 분석을 위해 데이터를 .xls/.xlsx 파일로 내보냅니다.
   4. 각 테스트에 대한 흡광도 값 I_504에서 제어 값을 뺀 다음 보정 곡선의 라이너 방정식에 따른 농도 계산에 결과를 사용합니다.
      참고: 모든 경우에 PMQ에 대한 검출 한계(LOD)는 표준 방법^22에따라 계산될 수 있다. 계산은 보정 함수를 기반으로 했습니다: LOD = 3.3 × SD/b,여기서 SD는 공백의 표준 편차이고 b는 회귀 선의 경사입니다.

결과

반응 조건을 최적화하기위해(그림 2),다양한 아니라인이 Griess 반응을 통해 PMQ와 결합하는 데 사용되었다. 우리는 다른 색상의 아조스의 시리즈를 달성했다. 전자 기증 치장을 가진 아니라인은 UV-vis 흡수 스펙트럼에 적색 변화를 일으킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이론적 계산은 시간 의존 밀도 기능 이론(TD-DFT)을 통해 수행되었다. 도 2A에제시된 바와 같?...

토론

편리한 PMQ 정량화를 위한 대색 방법을 설명했습니다. 잠재적으로 가장 간단하고 비용 효율적인 현재 방법입니다. 더 중요한 것은, 이 방법은 어떤 장비를 사용하지 않고 육안 기반 PMQ 측정을 가능하게 제공 제공합니다.

PMQ 검출을 위한 최적화된 Griess 반응은 504 nm에서 최대 흡수를 가진 적색 아조를 생성할 수 있습니다. 내인성 생체 분자의 UV-vis 흡수로 인한 잠재적 영향은 제?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Methoxyaniline	Aladdin	K1709027
2,4-Dimethoxyaniline	Heowns	10154207
3,4-Dimethoxyaniline	Bidepharm	BD21914
4-Methylaniline	Adamas-beta	P1414526
4-Nitroaniline	Macklin	C10191447
96-wells,Flat Botton	Labserv	310109008
Gaussian@16 software	Gaussian, Inc		Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux
Hydrochloric acid	GCRF	20180902
Marvin sketch (software)	CHEMAXON		free edition: 15.6.29
Phosphoric acid	Macklin	C10112815
Primaquine bisiphosphate	3A Chemicals	CEBK200054
Sodium nitrite	Alfa Aesar	5006K18R
Sulfonamides	TCI(shanghai)	GCPLO-BP
Varioskan LUX Plate reader	Thermo Fisher		Supplied with SkanIt Software 4.1