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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole décrit une nouvelle méthode colorimétrique pour la détection de primaquine antipaludique (PMQ) dans les urines synthétiques et les sérums humains.

Résumé

Primaquine (PMQ), un médicament antipaludique important, a été recommandé par l'Organisation mondiale de la Santé (OMS) pour le traitement des infections potentiellement mortelles causées par P. vivax et ovale. Cependant, PMQ a des effets indésirables indésirables qui mènent à l'hémolyse aigue dans les patients présentant l'insuffisance de déshydrogénase de glucose-6-phosphate (G6PD). Il est nécessaire de mettre au point des méthodes simples et fiables pour la détermination du PmQ dans le but de surveiller la posologie. Au début de 2019, nous avons signalé une approche basée sur les UV-Vis et les yeux nus pour la quantification colorimétrique DU PMQ. La détection a été basée sur une réaction de Griess-like entre PMQ et anilines, qui peut générer des produits azo colorés. La limite de détection pour la mesure directe du PMQ dans l'urine synthétique est dans la gamme nanomolaire. En outre, cette méthode a montré un grand potentiel pour la quantification de PMQ des échantillons de sérum humain aux concentrations médicalement pertinentes. Dans ce protocole, nous décrirarons les détails techniques concernant les synthèses et la caractérisation des produits azo colorés, la préparation de réactif, et les procédures pour la détermination de PMQ.

Introduction

PMQ est l'un des médicaments antipaludiques les plus importants, il fonctionne non seulement comme un schizontocide tissulaire pour prévenir la rechute, mais aussi comme un gametocytocide pour interrompre la transmission de la maladie1,2,3,4. L'hémolyse intravasculaire est l'un des effets secondaires préoccupants du PMQ, qui devient extrêmement grave chez les personnes déficientes en G6PD. On sait que le trouble génétique G6PD est distribué dans le monde entier avec une fréquence génétique comprise entre 3 et 30% dans les zones d'endémie palustre. La gravité de la faiblesse du PMQ dépend du degré d'insuffisance de G6PD aussi bien que de la dose et de la durée de l'exposition de PMQ5,6. Pour réduire le risque, l'OMS a recommandé une seule dose faible (0,25 mg de base/kg) de PMQ pour le traitement du paludisme. Cependant, cela est encore contesté par les variations dans la sensibilité aux médicaments des patients5,7. La surveillance de dose est nécessaire pour évaluer les pharmacocinétiques après administration de PMQ, qui peut affecter l'ajustement de dosage pour un traitement réussi avec la toxicité limitée.

La chromatographie liquide de haute performance (HPLC) est la technique la plus largement utilisée pour la détermination clinique de PMQ. Endoh et coll. ont signalé un système HPLC avec un détecteur UV pour la quantification du sérum PMQ à l'aide d'une colonne de gel de polymère C-188. Dans leur système, les protéines sériques ont d'abord été précipitées avec de l'acétonitrile, puis le PMQ dans le supernatant a été séparé pour HPLC. La courbe d'étalonnage était linéaire sur la plage de concentration de 0,01 à 1,0 g/mL8. Une autre méthode basée sur un HPLC en phase inverse avec détection UV à 254 nm a été rapportée pour la quantification du PMQ et de ses principaux métabolites9. La courbe d'étalonnage du PMQ était linéaire dans la fourchette comprise entre 0,025-100 g/mL. Une extraction liquide-liquide supplémentaire avec l'hexane mélangé et l'acétate d'éthyle comme phase organique a été employée pour la séparation de PMQ avec la récupération de pourcentage a atteint 89%9. Plus récemment, Miranda et coll. ont mis au point une méthode UPLC avec détection UV à 260 nm pour l'analyse de PMQ dans les formulations de comprimés avec une limite de détection à 3 'g/mL10.

Bien que les méthodes HPLC présentent une sensibilité prometteuse dans la détermination des médicaments et que la sensibilité puisse être encore améliorée si le HPLC est équipé d'un spectromètre de masse, il y a encore quelques inconvénients. Les mesures directes des médicaments dans les fluides biologiques sont généralement inaccessibles par HPLC, car de nombreuses biomolécules peuvent grandement influencer l'analyse. Des extractions supplémentaires sont nécessaires pour enlever les molécules endogènes avant l'analyse HPLC11,12. De plus, la détection de PMQ par un détecteur HPLC-UV est généralement effectuée à sa longueur d'onde maximale d'absorption (260 nm); cependant, il existe de nombreuses molécules endogènes dans les fluides biologiques avec une forte absorption à 260 nm (par exemple, acides aminés, vitamines, acides nucléiques et pigments urochromes), interférant ainsi avec la détection DES UV PMQ. Il est nécessaire d'élaborer des méthodes simples et rentables pour la détermination du PmQ avec une sensibilité et une sélectivité raisonnables.

La réaction de Griess a été présentée pour la première fois en 1879 comme un test colorimétrique pour la détection des nitrites13,14,15,16. Récemment, cette réaction a été largement explorée pour détecter non seulement le nitrite mais aussi d'autres molécules biologiquement pertinentes17,18,19,20. Nous avons déjà signalé la première étude systématique d'une réaction inattendue de Griess avec PMQ (figure 1). Dans ce système, PMQ est capable de former des azos colorés lorsqu'ils sont couplés avec des anilines substituées en présence d'ions nitrite s'ils sont acides. Nous avons en outre constaté que la couleur des azos variait du jaune au bleu lors de l'augmentation de l'effet de don d'électrons du substituant sur les anilines21. Une méthode colorimétrique basée sur l'absorption UV-vis pour la quantification de PMQ a été développée par la réaction optimisée entre 4-methoxyaniline et PMQ. Cette méthode a montré un grand potentiel pour la détection sensible et sélective du PMQ dans les fluides bio-pertinents. Ici, nous visons à décrire les procédures détaillées pour la détermination PMQ basée sur cette stratégie colorimétrique.

Protocole

1. Synthèse des Azos colorés

  1. Dans un flacon de fond rond de 25 ml (RBF), dissoudre l'aniline (0,1 mmol) et le bisphosphate primaquine (45,5 mg, 0,1 mmol) en 10 ml de solution H3PO4 (5 % v/v). Mettre le RBF sur un bain de glace, ajouter une barre d'agitation avec la bonne taille dans la solution, et mettre le RBF sur une plaque à remuer.
    REMARQUE: Pour la synthèse de l'azo 3g (Figure 2), utiliser 0,2 mmol de bisphosphate primaquine.
  2. Dissoudre NaNO2 (6,9 mg, 0,1 mmol) dans 1 ml d'eau refroidie, puis ajouter dans le mélange de réaction goutte à goutte. Retirez le bain de glace et maintenez le mélange de réaction agité à température ambiante.
  3. Surveillez la réaction à l'effière d'un gel de silice recouvert d'une plaque de chromatographie à couches minces (TLC). Utilisez un mélange de dichlorométhane (DCM)/méthanol (MeOH) (vol/vol 5:1) comme éluence pour tLC. Le produit azo présente des taches colorées sur la plaque TLC, qui est facile à distinguer à l'œil nu. Arrêtez la réaction lorsque les taches PMQ disparaissent sur TLC.
  4. Ajustez le mélange de réaction au pH par NaOH (2 M) sur un bain de glace. Utilisez un entonnoir de séparation de 50 ml pour extraire le mélange 3 fois avec 20 ml d'acétate d'éthyle pour chacun, combinez et concentrez la phase organique sous vide à l'aide d'un évaporateur rotatif.
    REMARQUE: Avant l'extraction, ajuster la valeur de pH des solutions de réaction au-dessus de 10. Cela peut maintenir l'amine primaire comme sa forme non ionisée, facilitant ainsi l'extraction.
  5. Purifiez les résidus par chromatographie flash avec gel de silice en phase inverse sous pression normale, en utilisant MeOH/H2O comme l'élu. Séchez la solution de produit par lyophilisation pour donner les produits azo désirés.
    REMARQUE: La même réaction peut également être effectuée dans les solutions HCl diluées (0,2 M).

2. Mesures UV-Vis et Calcul théorique

  1. Dissoudre l'azo pur (50 M) dans de l'eau distillée ou dans une solution H3PO4 (pH 1.1) de 5 % (pH 1,1), respectivement. Enregistrer les spectres d'absorption UV-vis (250-700 nm) sur un spectrophotomètre à température ambiante (25 oC). Exportez les données sous forme de fichiers .xls/.xlsx pour une analyse plus approfondie.
  2. Effectuez tous les calculs théoriques pour les produits PMQ lui-même et azo à l'aide du programme Gaussian 16. Utilisez la théorie fonctionnelle de densité dépendante du temps (TD-DFT) avec un ensemble de base 6-31G. Inclure les effets des solvants par le formalisme du modèle continuum polarisable (PCM) à l'aide de l'eau.
    1. Utilisez un logiciel (p. ex., Chemdraw Office) pour dessiner les structures, puis enregistrer la structure sous forme de fichier d'entrée gaussien (gif).
    2. Ouvrez le fichier gif avec Gauss View et cliquez sur le bouton Calculer. Sélectionnez Gaussian Calculation Setup, Opt-Freq, et ground state-DFT-B3LYP-6-31G; puis cliquez sur Soumettre. L'optimisation de la géométrie générera un fichier .log.
    3. Après la procédure ci-dessus, utilisez Gauss View pour ouvrir ce fichier journal. Cliquez sur Calcul-Gaussian Calculation Setup et sélectionnez l'énergie et TD-SCF-DFT-B3LYP-6-31G-Singlet seulement. Puis Soumettez- Le calcul de l'énergie générera un autre fichier journal et un fichier cube.
    4. Utilisez Gauss View pour ouvrir le fichier journal à partir du calcul de l'énergie. Cliquez sur Résultats-UV/Vis pour voir l'absorption prévue.
    5. Utilisez Gauss View pour ouvrir le fichier cube. Cliquez sur Résultats et sélectionnez les actions de surface et de contour-surface et nouvelle surface pour voir les orbites.
  3. Comparez les résultats de la mesure expérimentale et du calcul gaussien. Calculez l'erreur en pourcentage entre les valeurs calculées et mesurées, selon l'équation suivante.
                  Erreur de l'artiste (Wmax cal.-Wmaxexper.) / Wmaxexper. | 100%
    où Wmax cal. représente la longueur d'onde maximale d'absorption du calcul théorique et Wmax exper. représente la longueur d'onde du résultat expérimental.

3. Détermination du PMQ

  1. Mesure du PMQ à l'aide d'une plaquede 96 puits ( figure5)
    1. Dissoudre 4-methoxyaniline en 0.2 M HCl pour une solution aniline de 200 mM, R1. Dissoudre le nitrite de sodium dans l'eau distillée pour obtenir une solution de 5 mM, R2. Gardez toutes les solutions au réfrigérateur à 4 oC avant de l'utiliser.
    2. Ajouter 100 l de R1 dans une assiette de 96 puits et ajouter 50 l d'échantillon contenant du PMQ dans la plaque pour mélanger avec R1. Ensuite, ajouter 50 l de R2 dans la plaque. Mélanger les solutions par pipetting répétée.
    3. Maintenir la plaque à température ambiante pendant 15 min, puis enregistrer l'absorption UV-vis à 504 nm. Répétez 3x pour chaque test.  Le produit azo est stable avec l'exposition de lumière de pièce ; il n'est pas nécessaire de garder la plaque à l'obscurité.
    4. Exportez les données sous forme de fichiers .xls/.xlsx pour une analyse plus approfondie.
  2. Courbe de calibration pour la mesure directe de PMQ dans un échantillon d'urine
    1. Préparer des solutions DE PmQ à l'aide d'urine synthétique avec des concentrations de PMQ à 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 M, respectivement.
    2. Ajouter 100 l de R1 dans une assiette de 96 puits et ajouter 50 ll de solution d'urine PMQ pour mélanger avec R1. Ensuite, ajouter 50 l de R2 au mélange ci-dessus. Mélanger les solutions par pipetting répétée. Maintenir la plaque à température ambiante pendant 15 min, puis enregistrer l'absorption UV-vis à 504 nm.
    3. Générez une courbe d'étalonnage basée sur les concentrations d'absorption I504 et de PMQ. Utilisez les valeurs des puits sans PMQ comme un blanc, et soustrayez les valeurs vierges de tous les tests avant le traitement des données.
    4. Effectuer un ajustement linéaire pour générer les équations linéaires comme Y - aX -b, où Y est l'intensité d'absorption à 504 nm, X est la concentration de PMQ, a est la pente, et b est le y-intercept de la ligne linéaire.
  3. Courbe de calibration pour la mesure directe de PMQ dans un échantillon humain de sérum
    1. Préparer des solutions PMQ à l'aide de sérum humain avec des concentrations de PMQ à 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 200, M respectivement.
    2. Ajouter 100 l de R1 dans une assiette de 96 puits et ajouter 50 l de solution de sérum PMQ pour mélanger avec R1. Ajouter 50 l de R2 au mélange ci-dessus et mélanger les solutions par pipetting répétée. Maintenir la plaque à température ambiante pendant 15 min, puis enregistrer l'absorption UV-vis à 504 nm. Exportez les données sous forme de fichier .xls/.xlsx pour une analyse plus approfondie.
    3. Générez une courbe d'étalonnage basée sur les concentrations d'absorption I504 et de PMQ. Utilisez les valeurs des puits sans PMQ comme un blanc, et soustrayez les valeurs vierges de tous les tests avant le traitement des données.
    4. Effectuer un ajustement linéaire pour générer les équations linéaires comme Y - aX -b, où Y est l'intensité d'absorption à 504 nm, X est la concentration de PMQ, a est la pente, et b est le y-intercept de la ligne linéaire.
  4. Extraction de PMQ du sérum
    1. Ajoutez une certaine quantité de PMQ dans le sérum humain pour simuler le sérum contenant du PMQ. Pour l'extraction de PMQ, ajouter 6 ml de mélange d'acétate d'éthyle/hexane (7:1 v/v) dans 2 ml de sérum contenant du PMQ dans un tube centrifugeur de 15 ml.
    2. Ajouter 100 l de solution d'hydroxyde de sodium (2 M) au système d'extraction. Secouez violemment le tube à l'aide d'un mélangeur à vortex pendant 30 s. Recueillir la couche organique et la concentrer à l'aide d'un évaporateur rotatif sous vide.
    3. Redissoudrez les résidus avec 200 l d'eau distillée et retirez les composants lipidiques insolubles par filtration à travers une membrane en forme de disque de 220 nm de taille pore. Utilisez la solution finale pour le test.
  5. Déterminer le PMQ à partir du sérum avec extraction
    1. Suivez les étapes 3.2 ou 3.3 pour générer la courbe d'étalonnage du PMQ dans l'eau distillée. Extraire le PMQ des sérums contenant du PMQ selon l'étape 3.4.
    2. Ajouter 100 l de R1 et 50 oL de solution PMQ dans une plaque de 96 puits. Ajouter 50 oL de R2 au-dessus du mélange, et mélanger les solutions par pipetting répétée.
    3. Maintenez la plaque à température ambiante pendant 15 min et enregistrez l'absorption UV-vis à 504 nm. Utilisez les puits avec R1 et R2, mais sans PMQ comme contrôles. Exportez les données sous forme de fichiers .xls/.xlsx pour une analyse plus approfondie.
    4. Soustrayez les valeurs de contrôle des valeurs d'absorption I504 pour chaque test, puis utilisez le résultat pour les calculs de concentration selon l'équation de revêtement de la courbe d'étalonnage.
      REMARQUE: La limite de détection (LOD) pour le PMQ dans tous les cas peut être calculée selon une méthode standard22. Le calcul était basé sur la fonction d'étalonnage : LOD 3.3 - SD/b , où SD est l'écart standard du blanc et b est la pente de la ligne de régression

Résultats

Pour optimiser les conditions de réaction (figure 2), diverses anilines ont été utilisées pour coupler avec PMQ par la réaction de Griess. Nous avons réalisé une série d'azos avec des couleurs différentes. Il a été constaté que les anilines avec un substitut de don d'électrons peuvent causer un changement rouge dans le spectre d'absorption UV-vis. Des calculs théoriques ont été effectués par la théorie fonctionnelle dépendante de la densité temporelle (TD-DFT). Tel que pr...

Discussion

Nous avons décrit une méthode colorimétrique pour la quantification commode de PMQ. C'est potentiellement la méthode actuelle la plus simple et la plus rentable. Plus important encore, cette méthode offre permet la mesure à l'œil nu PMQ sans utiliser d'équipement.

La réaction optimisée de Griess pour la détection de PMQ peut générer un azo de couleur rouge avec une absorption maximale à 504 nm. L'influence potentielle de l'absorption UV-vis des biomolécules endogènes est limit?...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à déclarer.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent la subvention de démarrage de l'Université de médecine chinoise de Guangzhou et le projet de formation à la recherche scientifique pour les jeunes de GZUCM (2019QNPY06). Nous reconnaissons également le Centre de recherche médicale de Lingnan de l'Université de médecine chinoise de Guangzhou pour le soutien sur les installations.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
4-MethoxyanilineAladdinK1709027
2,4-DimethoxyanilineHeowns10154207
3,4-DimethoxyanilineBidepharmBD21914
4-MethylanilineAdamas-betaP1414526
4-NitroanilineMacklinC10191447
96-wells,Flat BottonLabserv310109008
Gaussian@16 softwareGaussian, IncVersion:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux
Hydrochloric acidGCRF20180902
Marvin sketch (software)CHEMAXONfree edition: 15.6.29
Phosphoric acidMacklinC10112815
Primaquine bisiphosphate3A ChemicalsCEBK200054
Sodium nitriteAlfa Aesar5006K18R
SulfonamidesTCI(shanghai)GCPLO-BP
Varioskan LUX Plate readerThermo FisherSupplied with SkanIt Software 4.1

Références

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