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要約

複雑な薬剤耐性結核(DR-TB)レジメンへの患者の付着を分析する現在の方法は、不正確でリソース集約的な可能性があります。当社の方法は、11のDR-TB薬の濃度について、容易に採取され保存されたマトリックスである毛髪を分析します。LC-MS/MSを用いて、薬物の付着をよりよく理解するために利用できるサブナノグラムの薬物レベルを決定することができます。

要約

薬剤耐性結核(DR-TB)は公衆衛生上の脅威の増大であり、治療薬レベルの評価には重要な臨床的利点がある可能性があります。血漿薬物レベルは現在のゴールドスタンダード評価ですが、フレボトミーとコールドチェーンを必要とし、非常に最近の付着のみをキャプチャします。当社の方法は、11の抗結核薬をテストするために、収集が容易で長期的な付着を反映するマトリックスである髪を使用しています。私たちのグループによる以前の研究は、髪の抗レトロウイルス薬レベルがHIVの結果に関連していることを示しています。DR-TB薬の私達の方法は、2mgの毛(根に近い3cmの近位)を使用し、メタノールで粉砕および抽出されます。サンプルは単一のLC-MS/MS法で分析され、16分で11の薬剤を定量化します。11の薬剤の定量(LLOQ)の下限は0.01 ng/mgから1 ng/mgの範囲である。サンプルは、重水素化、15N-または13C標識薬物アイソトポログに対する薬物の面積比を使用して定量化される。0.001~100 ng/mgの範囲の較正曲線を用いた。 DR-TB患者から採取した毛髪サンプルの都合のよいサンプルへのこの方法の適用は、直接観察された治療(DOT)において、9種類の薬物(イソニアジド、ピラジナミド、エタンブトール、リネゾリド、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、クロファジミン、ベダキリン、プレトマン)の直線的なダイナミックレンジ内の毛髪の薬物レベルを示した。プロチオンアミドの患者はおらず、エチオンアミドの測定レベルはLLOQに近かった(代わりにエチオンアミドの代謝産物の適合性を検査して暴露を監視する)。要約すると、薬剤耐性結核治療中の薬剤モニタリングのための技術として、毛髪中のDR-TB薬用多検体パネルの開発について述べています。

概要

21世紀において、薬剤耐性結核(DR-TB)は、すでに弱い国家結核対策プログラムの進化する大惨事であり、過去5年間だけで確認された症例は倍増し、世界的に1,22の抗菌性に関連する全死亡のほぼ3分の1を占めている。DR-TBの治療は、従来、薬物感受性結核の治療よりも長く、より有毒な第2ラインレジメンを必要としてきた。さらに、DR-TB患者は、しばしば、初期3の抵抗の出現に寄与した、遵守に重要な既存の課題を有する。

ウイルス負荷が治療を監視するために使用できるHIV感染とは異なり、結核における治療応答の代理エンドポイントは、個々のレベル4で遅延し、信頼性が低い。治療下の抗結核薬濃度および治療障害の重要な予測者である患者の付着を監視することも困難である。自己申告された遵守は、リコールバイアスとプロバイダ55、66を喜ばせたいという願望に苦しんでいます。ピル数と投薬イベント監視システム (MEMS) は、より客観的な7をすることができますが、実際の薬物消費量を測定しません8,9,10.バイオマトリスの薬物レベルは、付着データと薬物動態データの両方を提供することができます。従って、血漿薬物レベルは、治療用薬物モニタリング11,12,12において一般的に使用される。しかし、薬物付着モニタリングの文脈では、血漿レベルは短期的な暴露を表し、適切な付着基準範囲を決定する際に有意な患者間変動によって制限される。「ホワイトコート」効果は、診療所や研究訪問の前に付着が改善され、正確な薬物付着パターン13を提供する血漿レベルの能力をさらに複雑にする。

毛髪は、長期薬物暴露14,15,15を測定できる代替バイオマトリックスである。多くの薬物および内因性代謝産物は、毛髪が成長するにつれて全身循環から毛タンパク質マトリックスに組み込まれる。この動的プロセスは、毛髪の成長中に継続して、毛髪マトリックスに堆積する薬物の量は、循環する薬物の継続的な存在に依存し、毛髪は薬物摂取量の優れた時間的読み出しを行う。バイオマトリックスとしての毛髪は、血液と比較して保管および出荷のためのコールドチェーンを必要とせずに容易に収集されるという付加的な利点を有する。さらに、毛髪は非生物的有害性であり、この分野でさらなる実現可能性の利点を提供する。

毛髪薬のレベルは、長い法医学のアプリケーションで使用されてきました16.過去10年間で、毛髪抗レトロウイルス(ARV)レベルは、私たちのグループが貢献したHIV治療と予防における薬物遵守を評価する際の有用性を実証してきました。髪の毛のARVレベルは、HIV感染,,17、18、19、20、21,18における治療結果の最も強力な独立した予測変数であることが示されている。,192021DR-TB患者の毛髪レベルが治療結果を予測する際に同じ有用性を有するかどうかを判断するために、LC-MS/MSを使用して、小さな毛髪サンプル中の11個のDR-TB薬を分析する方法を開発し、検証しました。アッセイの性能の初期評価として、南アフリカ西ケープ州で直接観察治療(DOT)を受けているDR-TB患者のコンビニエンスサンプルでDR-TB薬レベルを測定した。

プロトコル

すべての患者は、毛髪サンプル収集の前に書面によるインフォームド・コンセントを提供しました。ケープタウン大学とカリフォルニア大学サンフランシスコ校から機関審査委員会の承認を得ました。

1. ヘアサンプリング

  1. 書面によるインフォームド・コンセントを取得します。
  2. 清潔なはさみを使用して、頭皮にできるだけ近い後頭領域から約20〜30本の頭皮の毛のストランドをカットします。
  3. 髪の遠位の周りにテープを置いて、方向を示します。髪の毛のサンプルをアルミホイルの正方形に折り畳み、室温で保管します。近位端の追加処理による汚染を避けるために、髪の遠位端にラベルを付けます。
  4. 患者のサンプルに加えて、「空白の髪」を収集する:結核薬を服用していない人から頭皮の毛のサンプル。大量の量を収集します(>各20人の患者のサンプルのための30mgの空白の毛)。

2. 薬物抽出

  1. ビーズチューブにラベルを付けます。各患者サンプルは1つの管を必要とする。ラベル12チューブは「C0」から「C11」に、12のキャリブレーションポイントのそれぞれに1つ。低品質制御用のチューブ、中型品質管理用チューブ、高い品質管理用のチューブのラベルを付けます。最後に、マトリックスブランクのチューブにラベルを付けます。
  2. 毛髪サンプルを含むアルミホイルの正方形を開きます。毛髪サンプルが3cmより長い場合は、近位端から3cmで髪を切り、その近位部分を分析に使用します。
  3. 2mgの毛髪サンプルをビーズチューブに計量する。
  4. 16追加のビーズチューブに白髪の2mgの重量を量る。これらは、キャリブレーションポイント、品質管理、およびマトリックスブランクとして使用されます。チューブは、ステップ2.8および2.9で示されたレベルで薬物基準基準でスパイクされる以外に、患者サンプルと同じ抽出手順に従います。
  5. すべてのビーズチューブをホモジナイザーに入れる。速度6.95 m/sでホモジナイザーを実行し、2サイクルの間に15の休息期間を持つ30 sの2サイクルをそれぞれ実行します。
  6. 内部標準ミックスを作成し、サンプルに追加します。
    1. 50 mLの体積フラスコに約40mLのメタノールを加える。
    2. オレンジガラスバイアルで、メタノールを溶媒として使用して、表1に示す内部規格の混合を行う。
      注:メタノールは非常に揮発性です。蒸発による損失を防ぐために、このプロセス中にすべてのバイアルを上限にしておきます。
    3. これらの混合から、表1に示す体積を50mLの体積フラスコに加える。その後、フラスコをメタノールで50mLに充填する。
    4. ボリュームフラスコをキャップして混ぜます。マトリックスブランクチューブを除く、粉砕された毛管のそれぞれに500 μLの混合物を加えます。マトリックスブランクチューブに500μLのメタノールを加えます。
  7. リファレンス標準ミックスを作成します。
    1. ステップ2.7.2で表に示す濃度を得るためにメタノールと以下の薬剤のきちんとした基準規格を構成する。以下の濃度の1mLのみが必要である。
    2. 1768 μL のメタノールをバイアルに加え、表 2 に記載されている基準規格の量を同じバイアルに追加して、2 mL 最終容積を得ます。このバイアル「参照Stdミックス1x」にラベルを付けます。渦。
    3. 「Ref Std Mix 1x」から900 μLのメタノールに100 μLをスパイクします。このバイアル「参照Stdミックス10x」にラベルを付けます。渦。
    4. 「Ref Std Mix 10x」から900 μLのメタノールに100 μLをスパイクします。このバイアルに「参照Stdミックス100x」というラベルを付けます。渦。
    5. 「Ref Std Mix 100x」から900 μLのメタノールに100 μLをスパイクします。このバイアルに「参照Stdミックス1000x」というラベルを付けます。渦。
  8. 表3に記載されているRef Std Mixの量を加えて、較正曲線チューブをスパイクする。
  9. QCミックスとスパイク品質管理チューブを作成します。
    1. ラベル 5 バイアル "QC-A" から "QC-E" まで。
    2. ラベル付きバイアルの5個に以下の量のメタノールを追加します。
      QC-A: 990 μL
      QC-B: 940 μL
      QC-C: 950 μL
      QC-D: 980 μL
      QC-E:950 μL
       
    3. ステップ2.7.1で作成した1mg /mLの医薬品ストックを使用して、以下にリストされている特定のバイアルに10 μLを追加します。0.5 mg/mL の BDQ および CLF の株式の場合は、以下に示すバイアルに 20 μL を追加します。
      QC-A: PTH
      QC-B: EMB, CLF, BDQ, PTM
      QC-C: INH, LFX, LZD, MFX, PZA
      QC-D: PTH, EMB
      QC-E: CLF, BDQ, PTM

      注:いくつかの薬物は、複数のミックスに存在しています。
    4. バイアルに「QC-A df100」というラベルを付けます。10 μLのQC-Aを990 μLのメタノールに希釈します。
    5. バイアルに「低QC在庫」というラベルを付けます。このバイアルに1832 μLのメタノールを加えます。以下に詳述するQCミックスの量を追加します。
      QC-A df100:80 μL
      QC-B:8 μL
      QC-C:80 μL
       
    6. バイアルに「ミッドQCストック」というラベルを付けます。このバイアルに760 μLのメタノールを加えます。以下に詳述するQCミックスの量を追加します。
      QC-A df100:800 μL
      QC-B:40 μL
      QC-C:400 μL
       
    7. バイアルに「高QC在庫」というラベルを付けます。このバイアルに1376 μLのメタノールを加えます。以下に詳述するQCミックスの量を追加します。
      QC-D: 160 μL
      QC-E:320 μL
      MFX、1mg/mL在庫:16 μL
      INH、1mg/mL在庫:32 μL
      LFX、1mg/mL在庫:32 μL
      LZD、1mg/mL在庫:32 μL
      PZA、1mg/mL在庫:32 μL
       
    8. 10 μL 低QCストックを低QCビードチューブにスパイクします。
    9. ミッドQCビーズチューブに10 μLミッドQCストックをスパイク。
    10. 高QCビーズチューブに10 μLハイQCストックをスパイク。
  10. すべてのチューブをホットシェーカーに2時間37°Cで入れます。水がチューブに飛び散らないほど揺れが遅いはずです。
  11. シェーカーからチューブを取り外します。ビーズチューブから新しいマイクロ遠心チューブに液体を移す。これらのマイクロ遠心分離管に同じ方法でラベルを付けます。
  12. 古いチューブに500μLのメタノールを加えます。キャップと渦。
  13. 2度目の、ビーズチューブから対応するマイクロ遠心チューブに液体を移します。粉砕された髪を移しても大丈夫です。これは最終的に遠心分離されます。
  14. 2,800 x gで 10 分間マイクロ遠心分離管を遠心します。
  15. 慎重に液体を取り出し、対応するラベルを持つ新しい遠心管に移します。毛髪ペレットを邪魔したり、転がしたりしないように注意してください。
  16. 遠心管内の液体を蒸発させて32°Cで乾燥させます。
  17. 乾燥管に200μLの移動相A(1%ギ酸のHPLC級水)を加えてサンプルを再構成します。渦。
  18. 250 μL のインサートで、液体をアンバーバイアルに移します。

3. LC-MS/MSの準備

  1. 1リットルの体積フラスコにHPLCグレードの水を加えて、移動相A(1%のギ酸を含むHPLCグレードの水)を1リットルにします。その後、そのフラスコに10mLの>95%のギ酸を加え、HPLCグレードの水でラインに充填します。
    1. 1リットルの体積フラスコにアセトニトリルを加えて、移動相B(0.1%のギ酸を含むアセトニトリル)を1リットル作ります。その後、そのフラスコに1mLの>95%のギ酸を加え、アセトニトリルでラインに充填します。
  2. 2.5 μmの粒子サイズと100 Åの孔径の2 x 100 mmカラムを取り付け、極端を覆い、エテル結合フェニルビーズを柱コンパートメントに取り付けます。また、製造元が推奨するガードカートリッジが取り付けられているカラムを確認します。
  3. データ収集ソフトウェアを開き、[ハードウェア構成] をダブルクリックします。LCMS を強調表示し、[プロファイルのアクティブ化] をクリックします。
    1. [新しいサブプロジェクト] をクリックするか、他のサブプロジェクトが既に存在する場合は、[サブプロジェクトのコピー] をクリックします。サブプロジェクトに名前を付けます。
    2. [新しいドキュメント]をクリックします。[取得方法] をダブルクリックします。[取得方法]ウィンドウで[マススペック]をクリックします。
    3. [スキャンの種類]ドロップダウンをMRM (MRM)に変更します。[極性] が[正]に設定されていることを確認します。
    4. [リストのインポート] をクリックし、補足資料に含まれている .csv ファイルMDR-TB LCMS メソッドの遷移.csvを選択します。
    5. 下にスクロールして、期間を 16.751 分に設定します。適切なサイクル時間とサイクル数が自動入力されます。
    6. 左側のサイドバーで、[統合バルコバルブ] をクリックします。ステップ 0 の位置名が A であることを確認します。[合計時間 (分)]列で、最初の行に 0.4、2 行目に 13 を入力します。
    7. [位置]列で、行 1 を B に、行 2 を A に設定します。
    8. 左側のサイドバーで、[バイナリポンプ] をクリックします。表 4に従って、勾配と流量表を設定します。
    9. 左側のサイドバーで、[オートサンプラー] をクリックします。射出量を10μLに変更します。[温度制御が有効]をクリックし、4 °Cに設定します。
    10. 左側のサイドバーで、[列コンパートメント] をクリックします。左右の温度を50°Cに設定します。
    11. メソッドを閉じて保存します。
  4. [新規ドキュメント] をクリックし、[取得バッチ] を選択してバッチを作成します。セット名を入力し、ドロップダウンバーから新しく作成したメソッドを選択します。
    1. スプレッドシートでは、この順序に従ってバッチを作成します:校正曲線、品質管理、患者サンプル、キャリブレーション曲線、品質制御、患者サンプル、較正曲線、品質制御。ランの開始と終了、およびキャリブレーション曲線、品質制御、患者サンプルの前後に、溶剤ブランク注射を追加します。検量線の注入後に少なくとも8回の溶剤ブランク注入を行い、検量物の持ち越しを減らすために高い品質管理バイアルを入れます。
      注: 列の年齢によっては、より多くの溶剤ブランク注入を追加する必要があります。
    2. サンプル名に隣接する列に、対応するバイアルの適切なオートサンプラー位置を入力します。
    3. [セットの追加 ]をクリックします。ポップアップ ウィンドウで、バッチ内のサンプル数を入力します。
    4. スプレッドシートから新しく作成したバッチにサンプル名とバイアルの場所をコピーして貼り付けます。
    5. [送信] タブに移動します。
  5. 溶媒ラインAを移動相Aに挿入し、溶媒ラインBを移動相Bに挿入して平衡化システムを行い、バイナリポンプのパージバルブを開きます。
    1. 溶媒組成を4mL/分流量で50%Bに設定します。バイナリポンプをオンにします。
    2. 5分後、0.3 mL/minに流量を減らします。漏れがないか確認します。
    3. ソフトウェアで、上部のツールバーの[均衡]を押します。時間を 5 分に設定し、[OK] をクリックします。
    4. 計測器が平衡状態になると、ウィンドウ右下のモジュールが緑色で表示されます。圧力が安定していることを確認し、[サンプルの開始] をクリックしてバッチを開始します。

4. データ分析

  1. バッチが完了したら、定量ソフトウェアを開きます。杖アイコンをクリックして、新しい結果テーブルを作成します。
    1. [参照]をクリックして適切なフォルダに移動し、データ ファイルを強調表示して右向きの矢印をクリックして、データを[選択済み] 領域に移動します。[次へ] をクリックします。
    2. [新しいメソッドの作成] を選択し、[新規] をクリックします。新しい定量方法名を入力し、[保存]を押して[次へ]をクリックします。
    3. 中央キャリブレーションポイントの最初の射出を選択します。次へを押します。
    4. [IS]列の内部標準のすべての遷移にチェック マークを付けます。
    5. 参照規格の量指定子遷移については、[IS 名]列で対応する IS を選択します。[次へ] をクリックします。
    6. 遷移をスクロールして、自動的に選択された保持期間が正確であることを確認します。ガウス スムージングが 1.5 に設定されていることを確認します。その他のデフォルト設定はすべてそのまま残すことができます(ノイズ率100%、ベースラインサブなど)。ウィンドウ2.00分、ピークスプリット2ポイント)。
      注: 必要に応じて、この時点で自動統合パラメータを変更します。これらのパラメータは計測器の設定に基づいて変更されるため、ここではこのパラメータは含まれていません。
    7. [完了] をクリックして、ロットに数量方法を適用します。
  2. 左上をクリックして、ピークレビューボタンを表示してクロマトグラムを表示します。左サイドバーを使用してトランジションをナビゲートします。各量指定子遷移の各注入をスクロールし、必要に応じて手動で正しいピークを統合します。
    1. 手動でピークを統合するには、[手動統合モードを有効にする]ボタンをクリックし、x 軸または Y 軸に沿ってクリックしてドラッグしてクロマトグラムを拡大表示し、一方のベースラインからもう一方のベースラインに線を引き、ピークを定義します。図 3 は、INH を持ち、手動で統合されたクロマトグラムと、INH を持たないクロマトグラムを示しています。
      注: すべての注入は、同じパラメータを使用して統合する必要があります。ピーク幅は、これらのパラメータを付着するためのガイドラインを提供することができますが、ピーク幅が異なる場合があります。ピークを定量するには、保持時間が、その検点の予想保持時間の±0.15分以内(基準標準ピークで定義されている)、予想される量指定子対予選比(図2を参照)を有すると定性的に確認され、信号対雑音比が10を超える必要があります。
  3. [サンプルタイプ]列で、キャリブレーションカーブインジェクション(空のキャリブレーションカーブインジェクションを除く)を標準に設定します。品質管理の注入を品質管理に設定します。残りの注射は[不明] のままにします。
    注: これはすべてのトランジションで設定されます。
  4. [実際の濃度]列に、すべてのキャリブレーション曲線および品質管理注入の表5に示す濃度を入力します。
  5. 左上から 2 番目をクリックする キャリブレーション カーブ ボタンを表示します。[回帰] ボタンをクリックします。
  6. ウェイトタイプを1/xに設定し、[OK]を押します。
  7. キャリブレーションカーブと品質管理サンプルを検証して、バッチが正常に実行されたことを確認します。
    1. 量指定子の参照遷移 (内部標準遷移ではなく) ごとに、各キャリブレーションカーブの射出精度([精度]列) を確認します。キャリブレーションポイントの少なくとも3分の2は80~120%以内の精度を持っている必要があります。
    2. キャリブレーションポイントが予想される精度をはるかに超えている場合、射出は外れ値である可能性があります。計算された濃度が、そのバイアルの他の2回の注射から2標準偏差以上離れている場合は、外れ値を除外します。各クロマトグラムの上に 「見つからない」ボタンをクリックします。
    3. キャリブレーション曲線の上に表示される R 値が >0.975 であることを確認します。
    4. すべての品質管理の注入が80-120%以内の精度を有することを確認してください。
  8. 上記の条件がすべて満たされている場合は、バッチが渡され、サンプルを定量化できます。ツールバーの [編集] をクリックし、[テーブル全体をコピー] をクリックします。表をスプレッドシートに貼り付けます。
  9. 2つのサンプル注射の計算された濃度の平均をとって、各サンプルの報告された濃度を決定する。

結果

全 11 個の DR-TB 薬のレベルが確認されたクロマトグラムの図を図 1に示します。各検致物の保持時間は、異なる計測器や列を使用する場合に変更される可能性があるため、正確な保持時間は個別に決定する必要があります。

抽出されたイオンクロマトグラム(EIC)を、キャリブレータの1つ(イソニアジド、INH)の1つの特定の薬剤(DR-TB薬物参照基準でスパ?...

ディスカッション

ここでは、LC-MS/MSを用いた小さな毛髪サンプルでのDR-TBの治療に利用される11の抗結核薬を定量化するために開発し、検証した方法のプロトコルを報告します。毛髪中のこれらの11の薬物を定量化するための他の方法は、以前に開発され、検証され、公開されていません。我々の方法は、約3センチメートル(cm)の長さ(〜2mg)のわずか20〜30本の毛鎖で薬物のサブナノグラムレベルを定量化すること...

開示事項

この研究は、国立アレルギー・感染症研究所RO1 AI123024(共同ピ:ジョン・メトカーフとモニカ・ガンジー)によって支えられました。

謝辞

著者らは、ケープタウン肺大学のキールタン・デダ教授、アリ・エスメール博士、マリエチエ・プレトリウス教授に感謝したいと考えており、この研究のために毛髪サンプルの収集を促進した。著者らは、この研究の参加者の貢献をさらに感謝して認める。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2 mL injection vialsAgilent Technologies5182-0716
250 uL injection vial insertsAgilent Technologies5181-8872
Bead ruptor 24OMNI International19001
Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes)OMNI International19628
BedaquilineToronto Research ChemicalsB119550
Bedaquiline-d6Toronto Research ChemicalsB119552
ClofazimineToronto Research ChemicalsC324300
Clofazimine-d7Toronto Research ChemicalsC324302
Disposable lime glass culture tubesVWR60825-425
EthambutolToronto Research ChemicalsE889800
Ethambutol-d4Toronto Research ChemicalsE889802
EthionamideToronto Research ChemicalsE890420
Ethionamide-d5ClearSynthCS-O-06597
Formic acidSigma-AldrichF0507-100mL
Glass bottlesCorning1395-1L
Hot ShakerBellco Glass Inc7746-32110
HPLCAgilent TechnologiesInfinity 1260
HPLC grade acetonitrileHoneywell015-4
HPLC grade methanolHoneywell230-1L
HPLC grade waterAqua Solutions IncW1089-4L
IsoniazidToronto Research ChemicalsI821450
Isoniazid-d4Toronto Research ChemicalsI821452
LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mmPhenomenex00D-4371-B0
LC guard cartridgePhenomenexAJ0-8788
LC guard cartridge holderPhenomenexAJ0-9000
LC-MS/MS quantitation softwareSciexMultiquant 2.1
LevofloxacinSigma-Aldrich1362103-200MG
Levofloxacin-d8Toronto Research ChemicalsL360002
LinezolidToronto Research ChemicalsL466500
Linezolid-d3Toronto Research ChemicalsL466502
Micro centrifuge tubesE&K Scientific695554
MoxifloxacinToronto Research ChemicalsM745000
Moxifloxacin-13C, d3Toronto Research ChemicalsM745003
MS/MSSciexTriple Quad 5500
OPC 14714Toronto Research ChemicalsO667600
Pretomanid (PA-824)Toronto Research ChemicalsP122500
ProthionamideToronto Research ChemicalsP839100
Prothionamide-d5Toronto Research ChemicalsP839102
PyrazinamideToronto Research ChemicalsP840600
Pyrazinamide-15N, d3Toronto Research ChemicalsP840602
Septum caps for injection vialsAgilent Technologies5185-5862
Turbovap LV evaporatorBiotage103198/11

参考文献

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