Uma plataforma personalizada de microscopia multifotn para imagens ao vivo de córnea de rato e conjuntiva

Resumo

Apresentada aqui é uma plataforma microscópica multifotípica para imagens de superfície ocular de rato vivo. O camundongo transgênico fluorescente permite a visualização de núcleos celulares, membranas celulares, fibras nervosas e capilares dentro da superfície ocular. Sinais de segunda geração harmônica não lineares derivados de estruturas colágenas fornecem imagens sem rótulos para arquiteturas estromais.

Resumo

A análise histológica convencional e os sistemas de cultura celular são insuficientes para simular completamente a dinâmica fisiológica e patológica in vivo. A microscopia multifotônica (MPM) tornou-se uma das modalidades de imagem mais populares para estudo biomédico em níveis celulares in vivo, as vantagens incluem alta resolução, penetração de tecido profundo e fototoxicidade mínima. Projetamos uma plataforma de imagem MPM com suporte para olhos de mouse personalizado e um estágio estereotaxico para imagem de superfície ocular in vivo. O rato repórter de proteína fluorescente dupla permite a visualização de núcleos celulares, membranas celulares, fibras nervosas e capilares dentro da superfície ocular. Além dos sinais de fluorescência multifotônica, a aquisição de segunda geração harmônica (SHG) permite simultaneamente a caracterização da arquitetura estromal colágena. Esta plataforma pode ser empregada para imagens intravitais com posicionamento preciso em toda a superfície ocular, incluindo córnea e conjuntiva.

Introdução

As estruturas superficiais oculares, incluindo a córnea e a conjuntiva, protegem outros tecidos oculares mais profundos de distúrbios externos. A córnea, a parte frontal transparente do olho, funciona tanto como uma lente refrativa para direcionar a luz para o olho quanto como uma barreira protetora. O epitélio corneo é a camada mais externa da córnea e consiste em camadas distintas de células superficiais, células de asa e células basais. O estroma corneal é composto de lamellae colagenosa sofisticadamente embalada embutida com ceratocitos. O endotélio corneo, uma única camada de células hexagonais planas, tem um papel importante na manutenção da transparência da córnea, mantendo o estroma córnea em um estado relativamente desidratado através de suas funções de bombeamento¹. Limbus forma a borda entre a córnea e a conjuntiva, e é o reservatório de células-tronco epiteliais da córnea². A conjuntiva altamente vascularizada ajuda a lubrificar os olhos produzindo muco e lágrimas³.

A dinâmica celular das estruturas da superfície córnea é convencionalmente estudada pela análise histológica ou pela cultura celular in vitro, o que pode não simular adequadamente a dinâmica celular in vivo. Uma abordagem de imagem ao vivo não invasiva pode, portanto, preencher tal lacuna. Devido às suas vantagens, que incluem alta resolução, fotodamagem mínima e profundidade de imagem mais profunda, o MPM tornou-se uma modalidade poderosa em diversas áreas de pesquisa biológica^{4,,5,,6,,7,,8}. Para imagens córneas, o MPM fornece informações celulares da autofluorescência intrínseca derivada do NAD intracelular(P)H). Sinais de segunda geração harmônica (SHG) derivados das fibras de colágeno tipo I não centrosimétricas sob a varredura a laser femtosegundo fornecem estruturas estromais colágenos sem procedimentos adicionais de coloração⁹. Anteriormente, nós e outros grupos exploramos MPM para imagens de córneas animais e humanas^{9,,10,,11,12,,13,,14,,15}.

Linhas de camundongos transgênicos que exibem proteínas fluorescentes em populações de células específicas têm sido amplamente utilizadas para vários estudos em biologia celular, incluindo desenvolvimento, homeostase tecidual, regeneração tecidual e carcinogênese. Foram utilizadas cepas de camundongos transgênicos rotuladas com proteínas fluorescentes para imagem in vivo de córneas^9,,10, folículos capilares¹⁰ e epiderme¹⁰ por MPM. A cepa de camundongo fluorescente duplo com membrana celular rotulada com tdTomato e núcleo celular marcado com EGFP é criada a partir de duas cepas de camundongos: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sor^tm1Ytchn/J, #021847)¹⁶ e mT-mG (Gt(ROSA26)^{ACTB-tdTomato-EGFP}, #007676)¹⁷. A linha de camundongos transgênicos R26R-GR contém uma dupla proteína fluorescente, incluindo um gene de fusão H2B-EGFP e um gene de fusão de sinal de âncora mCherry-GPI, inserido no lócus gt (ROSA)26Sor. A cepa transgênica mT-mG é um tdTomato de membrana celular e ratos cre-repórter fluorescentes EGFP. Antes da recombinação da Cre, a proteína da membrana celular com expressão de fluorescência tdTomato está amplamente presente em várias células. Esta cepa de camundongos transgênicos nos permite visualizar núcleos-EGFP e membrana com tdTomato sem excitação cre. Duas fêmeas (R26R-GR^+/+) e um macho (mT-mG^+/+) foram criadas juntas para produzir camundongos suficientes para experimentos. Sua prole com R26R-GR^+/-;mT-mG^+/- genótipo, uma cepa de camundongos fluorescentes duplos, foi utilizada neste estudo. Comparado com uma linha de mouse de repórter fluorescente como descrito anteriormente^9,10, esta cepa de mouse repórter fluorescente duplo nos fornece uma redução de 50% do tempo de imagem.

Neste trabalho, descrevemos um protocolo técnico detalhado para imagens in vivo da superfície ocular de forma passo a passo usando nossa plataforma de imagem e camundongos transgênicos fluorescentes duplos.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com os procedimentos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Nacional de Taiwan e do Chang Gung Memorial Hospital.

1. Configuração de microscopia multifotônica

1. Construa um sistema baseado em um microscópio vertical com imersão de água 20x 1.00 NA objetivo(Figura 1A).
2. Use Ti: Laser de safira (com comprimento de onda tunable) como fonte de excitação. Defina o comprimento de onda de saída a laser em 880 nm para EGFP e 940 nm para tdTomato(Figura 1A).
3. Inclua dois espelhosdicróicos (495 nm e 580 nm) para a separação de SHG/EGFP e EGFP/tdTomato(Figura 1A). Separar espectralmente os sinais SHG, EGFP e tdTomato pelos filtros bandpass 434/17nm, 510/84nm e 585/40nm(Figura 1A).
4. A fim de otimizar a qualidade da imagem e evitar fotobleaching e danos teciduais, definir a potência laser para cerca de 35 mW para imagem córnea e 50 mW para limbus. Meça a potência do laser antes que o laser passe pelo sistema óptico. A potência exata do laser nas amostras é de cerca de 8-9 mW. O design microscópico completo é mostrado na Figura 1A.
   NOTA: O limite superior da potência laser é definido para 70 mW para evitar o branqueamento fotográfico e danos nos tecidos.

2. Preparação animal para imagens ao vivo

1. Use ratos de 8 a 12 semanas para o experimento. Injete intramuscularmente 50-80 mg/kg de tiletamina HCl e zolazepam HCl para anestesia geral. Verifique a falta de resposta ao reflexo de retirada beliscando um dedo do dedo do dedo. A anestesia suficiente é importante para permitir um monitoramento estável da taxa de respiração.
   NOTA: Camundongos com idade de 8 semanas ou mais são recomendados porque seus globos oculares estão amadurecidos.
2. Coloque o mouse sob anestesia em um estágio aquecido e insira a sonda de monitoramento de temperatura no ânus.
   ATENÇÃO: A sonda deve ser totalmente inserida na cavidade anal sem exposição ao ar, para evitar o superaquecimento do aquecedor e a indução da insolação.

3. Ocular para imagem ao vivo da superfície ocular

1. Para imagens ao vivo da superfície ocular, use o suporte de mouse estereotaxic projetado sob medida composto por duas partes: um suporte para cabeça para estabilizar a cabeça e um suporte ocular para retrair as pálpebras e expor toda a superfície ocular(Figura 1B-D).
2. Insira as barras de ouvido no meatus auditivo externo e mantenha a fixação de três pontos do porta-cabeça(Figura 1B,D).
3. Aplique topicamente uma solução de 0,4% de cloridrato de oxibuprocaína em soro fisiológico e deixe-o por 3 minutos para anestesiar a superfície ocular.
4. Certifique-se de que o globo ocular está salientes por uma retração manual adequada das pálpebras. Caso contrário, a isquemia e o sangramento do globo ocular podem ocorrer.
5. Coloque cuidadosamente um laço do tubo de polietileno do suporte ocular ao longo da margem das pálpebras para expor a superfície ocular. Estabilize o globo ocular com o suporte ocular composto por um fórceps No. 5 Dumont com suas pontas cobertas com o laço do tubo de polietileno(Figura 1C,D).
6. Fórceps de parafuso usando um botão em fórceps destais do suporte ocular para manter o globo ocular estável(Figura 1D).
7. Aplique um gel ocular com o índice refrativo de 1.338 na superfície da córnea como meio de imersão para manter a umidade da superfície ocular a cada hora. Além disso, a aplicação regular do gel ocular a cada hora evita nublar na córnea durante a imagem.
8. Gire o globo ocular com o suporte que bloqueou o estágio motorizado do estepe para imagem em toda a superfície córnea central da córnea central até a região periférica(Figura 1C,D).
   ATENÇÃO: Tanto o excesso quanto as quantidades insuficientes de gel ocular podem afetar a qualidade das imagens durante a imagem. Portanto, complementar o gel ocular a cada hora para manter a superfície úmida regularmente é importante para a imagem.

4. Aquisição de imagem em série Z

NOTA: Defina o primeiro e o último slide em cada pilha para reduzir os artefatos de movimento de queda.

1. Antes de tirar as imagens, imagem o campo de alvo com uma fonte de luz de mercúrio.
2. Clique no símbolo do software de microscópio para ativar o software.
3. Selecione o ganho pmt adequado e o ganho digital para visualizar a estrutura celular na superfície ocular.
4. Defina o primeiro slide e o último slide para adquirir uma pilha.
5. Digite valores numéricos para resolução de imagem e passo z, por exemplo, 512 x 512 e 1 μm como passo z.
6. Clique no botão Iniciar para coletar imagens em série z.
7. Adquira imagens ao vivo duas vezes na mesma área, primeiro com 880 nm de excitação para coleta de sinais SHG/EGFP e segundo em excitação de 940 nm para a coleta de sinais EGFP/tdTomato.
   NOTA: A combinação de duas pilhas fornece imagens de 3 canais. O tamanho da resolução da imagem e do formato de digitalização foram de 512 x 512 pixels e 157 μm x157 μm, respectivamente.

5. Processamento de imagem e reconstrução 3D

1. Carregue as imagens em série Z no software Fiji¹⁸.
2. Selecione o filtro 3D mediano do plugin em Fiji para reduzir os ruídos de fundo.
3. Selecione o filtro Máscara de Embalagem Não-harp em Fiji para afiar as imagens.
4. Clique em "Auto" em brilho/contraste para otimizar automaticamente a qualidade das imagens.
5. Salve as imagens como sequências de imagens para poder exportar as imagens em série Z.
6. Carregue imagens em série z em software comercial (por exemplo, Avizo lite) para reconstrução 3D usando renderização de volume.
7. Em todas as imagens MPM, apresentam sinais EGFP, tdTomato e SHG nas cores pseudo-verde, vermelho e ciano, respectivamente.
8. Capture imagens da estrutura 3D pelo instantâneo.

Resultados

Usando esta plataforma de imagem ao vivo, a superfície ocular do mouse pode ser visualizada em níveis celulares. Para visualizar células individuais únicas na superfície ocular, empregamos os camundongos transgênicos fluorescentes duplos com EGFP expressos no núcleo e tdTomato expressos na membrana celular. O estroma córnea rico em colágeno foi destacado por sinais shg.

No epitélio córnea, foram visualizadas células superficiais, células de asa e células basais (

Discussão

Esta plataforma de imagem MPM personalizada com um software de controle foi usada para imagens intravitais de órgãos epiteliais de camundongos, incluindo pele^10,folículo piloso¹⁰ e superfície ocular^9,,10 (Figura 1A). O sistema personalizado foi usado por sua flexibilidade na alteração dos componentes ópticos para vários experimentos, desde o início do nosso projeto. Essa metodo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AVIZO Lite software	Thermo Fisher Scientific		Version: 2019.3.0
Bandpass filters	Semrock	FF01-434/17 FF01-500/24 FF01-585/40
Dichroic mirrors	Semrock	FF495-Di01-25x36 FF580-Di01-25x36
Galvano	Thorlabs	GVS002
Jade BIO control software	SouthPort Corporation	Jade BIO
Oxybuprocaine hydrochloride	Sigma	O0270000
PMT	Hamamatsu	H7422A-40
Polyesthylene Tube	BECTON DICKINSON	427401
Stereotaxic mouse holder	Step Technology Co.,Ltd	000111
Ti: Sapphire laser	Spectra-Physics	Mai-Tai DeepSee
Upright microscopy	Olympus	BX51WI
Vidisic Gel	Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH	D13581
Zoletil	Virbac	VR-2831