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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für das auf Kartoffelvirus X (PVX) basierende microRNA-Silencing-System (VbMS) zur funktionellen Charakterisierung endogener microRNAs (miRNAs) in Kartoffeln. Target Mimic (TM) Moleküle von miRNA von Interesse werden in den PVX-Vektor integriert und vorübergehend in Kartoffeln exprimiert, um die Ziel-miRNA oder miRNA-Familie zum Schweigen zu bringen.

Zusammenfassung

Virus-basiertes microRNA-Silencing (VbMS) ist ein schnelles und effizientes Werkzeug zur funktionellen Charakterisierung von microRNAs (miRNAs) in Pflanzen. Das VbMS-System wurde für verschiedene Pflanzenarten entwickelt und angewendet, darunter Nicotiana benthamiana, Tomaten, Arabidopsis, Baumwolle und Monokotyledonen wie Weizen und Mais. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll, das PVX-basierte VbMS-Vektoren verwendet, um endogene miRNAs in Kartoffeln zum Schweigen zu bringen. Um die Expression einer spezifischen miRNA zu unterdrücken, werden Target-Mimic-Moleküle (TM) von miRNA von Interesse entworfen, in pflanzliche Virusvektoren integriert und in Kartoffeln durch Agrobacterium-Infiltration exprimiert, um direkt an die endogene miRNA von Interesse zu binden und ihre Funktion zu blockieren.

Einleitung

Pflanzliche microRNAs (miRNAs) werden als 20–24 nukleotidlange, kernkodierte regulatorische RNAs1 charakterisiert und spielen eine grundlegende Rolle in fast jedem Aspekt pflanzenbiologischer Prozesse, einschließlich Wachstum und Entwicklung2,3, Photosynthese und Metabolismus4,5,6,7, Hormonsynthese und Signalisierung8,9, biotische und abiotische Reaktionen10, 11,12,13 und Nährstoff- und Energieregulierung14,15. Die regulatorischen Rollen von pflanzlichen miRNAs sind gut programmiert und werden typischerweise auf posttranskriptionaler Ebene erfüllt, indem die Ziel-mRNAs entweder gespalten oder translational unterdrückt werden.

Enorme Fortschritte wurden bei der Identifizierung, transkriptionellen Profilerstellung und Zielvorhersage von miRNAs in Kartoffeln gemacht16,17,18,19,20,21. Die funktionelle Charakterisierung von miRNAs in Pflanzen, einschließlich Kartoffeln, ist jedoch aufgrund des Mangels an effizienten und hochdurchsatzigen genetischen Ansätzen hinter anderen Organismen zurückgeblieben. Es ist eine Herausforderung, eine funktionelle Analyse einzelner miRNA durch Standard-Loss-of-Function-Analyse durchzuführen, da die meisten miRNAs zu Familien mit erheblicher genetischer Redundanz gehören22. Darüber hinaus kann eine einzelne miRNA mehrere Zielgene kontrollieren23 und mehrere verschiedene miRNAs können denselben molekularen Signalweg gemeinsam modulieren24,25. Diese Eigenschaften machen es schwierig, die Funktion einer bestimmten miRNA oder einer miRNA-Familie zu charakterisieren.

Ein Großteil der funktionalen Analyse von miRNAs stützt sich stark auf Ansatzmöglichkeiten mit Funktionsverstärkung, die offensichtliche Einschränkungen aufweisen. Die künstliche miRNA (amiRNA)-Methode nutzt die endogenen primären Transkripte (pri-miRNAs), um miRNAs auf hohem Niveau zu produzieren, was zu einer Hemmung der Zielgenexpression führt26,27,28,29. Aktivierungsmarkierung und miRNA-Überexpression unter Verwendung eines starken konstitutiven 35S-Promotors führen jedoch häufig zu einer erhöhten Expression von miRNAs, die nicht repräsentativ für In-vivo-Bedingungen sind und daher möglicherweise nicht die endogene Funktion von miRNAs widerspiegeln30. Es wurde ein alternativer Ansatz entwickelt, der die Expression von miRNA-resistenten Formen von Zielgenen beinhaltet, die unreibbare Mutationen in den Bindungs- und/oder Spaltungsstellen enthalten31,32,33. Dieser Ansatz kann jedoch auch zu einer Fehlinterpretation des Phänotyps führen, der vom miRNA-resistenten Zieltransgen aufgrund transgener Artefakte abgeleitet wurde. Daher sollten Schlussfolgerungen aus diesen Untersuchungen zum Funktionsgewinn mit Vorsicht gezogen werden34. Eine weitere große Einschränkung der oben beschriebenen Ansätze besteht darin, dass sie eine Transformation erfordern, die arbeitsintensiv und zeitaufwendig ist. Darüber hinaus sind die transgenabhängigen Ansätze für transform-widerspenstige Pflanzenarten kaum anwendbar. Daher ist es wichtig, einen schnellen und effizienten Loss-of-Function-Ansatz zu entwickeln, um die Funktion von miRNAs zu entschlüsseln.

Um die Voraussetzung des Transformationsverfahrens zu umgehen, wurde ein virusbasiertes microRNA-Silencing (VbMS) etabliert, indem die Target-Mimic-Strategien (TM) mit virus-abgeleiteten Vektoren kombiniert werden. Im VbMS-System werden künstlich konstruierte TM-Moleküle vorübergehend von einem Virus-Backbone exprimiert und bieten ein leistungsfähiges, hochdurchsatzreiches und zeitsparendes Werkzeug, um die Funktion von pflanzlichen endogenen miRNAs zu sezieren35,36. VbMS wurde ursprünglich in N. benthamiana und Tomaten mit dem Tabakrasselvirus (TRV)35,36,37 entwickelt und unter Verwendung verschiedener anderer Virusexpressionssysteme auf Arabidopsis, Baumwolle, Weizen und Mais ausgedehnt, darunter Kartoffelvirus X (PVX)38, Baumwollblattknautschvirus (ClCrV)39, Gurkenmosaikvirus (CMV)40,41,42, Chinesisches Weizenmosaikvirus (CWMV)43 , und Gerstenstreifenmosaikvirus (BSMV)44,45.

Die Kartoffel (Solanum tuberosum) ist die viertwichtigste Nahrungspflanze und die am weitesten verbreitete Noncerealpflanze der Welt, vor allem wegen ihres hohen Nährwerts, ihrer hohen Energieproduktion und ihres relativ geringen Inputbedarfs46. Mehrere Eigenschaften der Kartoffel machen sie zu einer attraktiven zweikeimblättrigen Modellpflanze. Es ist eine vegetativ vermehrte polyploide Pflanze mit hoher Auskreuzungsrate, Heterozygotie und genetischer Vielfalt. Bis heute gibt es jedoch keinen Bericht, der die Funktion von miRNAs in Kartoffeln mit VbMS charakterisiert. Hier stellen wir einen ligationsunabhängigen Klonierungs-(LIC)-angepassten Kartoffel-PVX-basierten VbMS-Ansatz vor, um die Funktion von miRNAs in Kartoffelpflanzen zu bewerten38. Wir haben die miR165/166-Familie ausgewählt, um den VbMS-Assay zu veranschaulichen, da die miR165/166-Familie und ihre Ziel-mRNAs und Transkriptionsfaktoren der Klasse III Homöodomänen/Leu-Reißverschluss (HD-ZIP III) umfassend charakterisiert wurden22,47,48. Die HD-ZIP III-Gene sind Schlüsselregulatoren der Meristementwicklung und Organpolarität, und die Unterdrückung der miR165/166-Funktion führt zu einer erhöhten Expression der HD-ZIP III-Gene, was zu pleotropen Entwicklungsdefekten wie reduzierter apikaler Dominanz und abweichenden Mustern der Blattpolarität führt22,35,38,41 . Die leicht scorablen Entwicklungsphänotypen, die mit dem Silencing von miRNA165/166 korrelieren, ermöglichen eine genaue Bewertung der Wirksamkeit des PVX-basierten VbMS-Assays.

In dieser Studie zeigen wir, dass das PVX-basierte VbMS-System die Funktion von miRNAs in Kartoffeln effektiv blockieren kann. Da das PVX-basierte virusinduzierte Gen-Silencing-System (VIGS) in einer Reihe von Kartoffelsorten etabliert wurde49,50,51,52, kann dieser PVX-basierte VbMS-Ansatz wahrscheinlich auf eine breite Palette von diploiden und tetraploiden Kartoffelarten angewendet werden.

Protokoll

1. Wachsen Sie Kartoffelpflanzen.

  1. Vermehrung von In-vitro-Kartoffelpflanzen in Kulturröhrchen (25 x 150 mm) mit Murashige und Skoog (MS) Medien plus Gamborg-Vitamin (MS-Basalsalzmischung, Gamborg-Vitamin, 30 g/L Saccharose, 3,5 g/L Agar, pH = 5,7). Platzieren Sie die Röhren im Wachstumsraum unter 20–22 °C, 16 h Licht/8 h dunkler Photoperiode und einer Lichtintensität von 120 μmol/m2∙s1.
    HINWEIS: Neue Triebe und Wurzeln entwickeln sich normalerweise in 1-2 Wochen aus Pflanzen. Vermehren Sie jeden Monat Pflanzen mit frischen MS / Gamborg-Vitaminmedien.
  2. Vier Wochen später transplantieren Sie In-vitro-Pflanzen in den Boden und züchten sie in einem Gewächshaus unter 20–22 °C, 16 h Licht/8 h Dunkler Photoperiode und einer Lichtintensität von 120 μmol/m2∙s1.
    HINWEIS: Die Pflanzen mit neu entwickelten Wurzeln und Blättern sind zum Umpflanzen geeignet. Halten Sie die Feuchtigkeit für die frisch umgepflanzten Pflanzen für die ersten 3-4 Tage aufrecht.

2. Konstruiere die VbMS-Vektoren.

  1. Entwerfen und klonen Sie die kurzen Tandem-TM-Moleküle (STTM, Abbildung 1)22,53 für die interessierende miRNA.
    HINWEIS: Erfassen Sie miRNA-Sequenzen basierend auf experimentellen Daten oder aus der miRbase-Datenbank54,55,56,57,58,59. Die in dieser Studie verwendete miR166-Sequenz wurde bereits beschrieben60.
    1. Entwerfen Sie das TM-Modul, indem Sie eine Mismatch-Sequenz, normalerweise 5'-CTA-3', in die reverse Komplementsequenz der miRNA an der Stelle einfügen, die den 10.–11. Nukleotiden der miRNA entspricht.
      HINWEIS: Zum Beispiel ist die Stu-miR160-Sequenz 5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61, wobei die 10.–11. Nukleotide fett gedruckt sind. Die umgekehrte Komplementsequenz (in Desoxynukleotiden) ist 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' und die Mismatch-Bulge-Insertionsstelle ist fett dargestellt. Die TM-Molekülsequenz (Desoxynukleotid) sollte 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3' sein.
    2. Entwurfsprimer für das Klonen des STTM-Fragments (Abbildung 1). Verwenden Sie DNA-Oligonukleotide mit der 48-nt-Spacer-Sequenz als Vorlage für das PCR-Klonen. Der Vorwärtsprimer besteht aus einem LIC1-Linker (5'-CgACgACAAgACCgT-3'), der Vorwärtssequenz des oben für TM entwickelten Moleküls und der partiellen 5'-Sequenz des 48-nt-Abstandhalters (5'-GTTGTTGTTGTTGTTATGGT-3'). Der Reverse Primer besteht aus einem LIC2-Linker (5'-gAggAgAagAgCCgT-3'), der reversen Komplementsequenz des TM-Moleküls und einem partiellen reversen Komplement zur 3'-Sequenz des 48-nt-Spacers (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3').
      HINWEIS: Die 48-nt-Abstandshaltersequenz ist 5'-GTTGTTGTTGTTGTTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAGAAT-3'. Zum Beispiel sollte für STTM-miR160 der Vorwärtsprimer 5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3' sein; Der Reverse Primer sollte 5'-gAggAgAagAgCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' lauten (Abbildung 1).
    3. Amplifizieren Sie das STTM-Fragment in einem Volumen von 50 μL durch PCR unter Verwendung des synthetisierten universellen 48-nt-Abstandhalters als Vorlage und einer High-Fidelity-DNA-Polymerase.
      1. Richten Sie die PCR-Reaktion ein, indem Sie 0,5 μL jedes Primers (40 μM), 0,5 μL 48-nt-Spacer-Oligo (40 μM), 5 μL 10x PCR-Puffer, 1 μL dNTP-Gemisch (je 10 mM), 0,1 μL High-Fidelity-DNA-Polymerase (10 U/μL) und 43 μL ddH2O auf ein Gesamtvolumen von 50 μL mischen. 94 °C für 3 min, 32 Zyklen von 94 °C für 45 s, 60 °C für 45 s und 72 °C für 60 s.
    4. Reinigen Sie das STTM-Fragment durch Ethanolfällung. Zu den PCR-Produkten werden 2,5 Volumen Ethanol und 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH = 4,0) gegeben. Kräftig mischen und 10 min bei 14.000 x g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und spülen Sie das Pellet mit 1 ml 70% Ethanol ab. Trocknen Sie das Pellet und lösen Sie es in 20 μL ddH2O auf.
      HINWEIS: Verwenden Sie DNA-Elektrophorese, um die Amplifikation der STTM-PCR-Produkte zu überprüfen.
    5. Die T4-DNA-Polymerase-Reaktion auf Eis durch Mischen von 2,5 μL gereinigtem STTM PCR-Produkt, 0,5 μL 10x T4 DNA-Polymerase-Puffer, 0,05 μL 1 M Dithiothreitol (DTT), 0,25 μL 100 mM dATP, 0,1 μL T4-DNA-Polymerase (3 U/μL) und 1,6 μL ddH2O auf ein Gesamtvolumen von 5 μL mischen. und die Produkte 20 min lang bei 75 °C behandeln, um die T4-DNA-Polymerase zu inaktivieren.
  2. Bereiten Sie das PVX-basierte VbMS-Konstrukt vor.
    1. Verdauung von 5 μg PVX-LIC-Plasmid38 mit 2,5 μL SmaI (20 U/μL) in einem Volumen von 100 μL.
    2. Den verdauten PVX-LIC-Produkten wird eine gleiche Menge Phenol:Chloroform:Isopropanol (25:24:1, pH = 6,7/8,0) zugesetzt und kräftig vermischt. Zentrifugiere bei 14.000 x g für 10 min und überführe den Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie eine gleiche Menge Chloroform:Isopropanol (24:1) hinzu und wirbeln Sie kräftig. Zentrifuge bei 14.000 x g für 10 min.
      HINWEIS: Der PVX-LIC-Vektor beherbergt die LIC-Kassette zum Klonen. Die LIC-Kassette des PVX-LIC-Vektors enthält ein ccdB-Gen und ein Chloramphenicol-resistentes Gen und muss im E. coli-Stamm DB3.1 unter Verwendung von LB-Medium, das Kanamycin (50 μg/L) und Chloramphenicol (15 μg/L) enthält, aufrechterhalten/vermehrt werden.
    3. Den Überstand in ein neues Zentrifugenrohr überführen. 2,5 Volumen Ethanol und 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH = 4,0) zugeben und kräftig mischen. Zentrifugiere bei 14.000 x g für 10 min und entferne den Überstand.
    4. Spülen Sie das Pellet mit 1 ml 70% Ethanol und wirbeln Sie es kräftig. Zentrifugiere bei 14.000 x g für 10 min und entferne den Überstand. Trocknen Sie das Pellet und lösen Sie das aufgeschlossene PVX-LIC-Plasmid mit 100 μL ddH2O auf.
    5. Richten Sie die T4-DNA-Polymerase-Reaktion auf Eis ein, indem Sie 2,5 μL verdaute PVX-LIC-Vektor-DNA, 0,5 μL 10x T4-DNA-Polymerase-Puffer, 0,05 μL 1 M DTT, 0,25 μL 100 mM dTTP und 0,1 μL T4-DNA-Polymerase (3 U/μL) in einem Gesamtvolumen von 5 μL mischen. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 °C für 15 min und behandeln Sie die Produkte bei 75 °C für 20 min bis 20 min inaktivieren Sie die T4-DNA-Polymerase.
  3. Klonen Sie die STTM-Sequenz mithilfe einer LIC-Reaktion in den PVX-LIC-Vektor. Mischen Sie die T4 DNA Polymerase-behandelten STTM PCR Produkte (5 μL) und die T4 DNA Polymerase-behandelten PVX-LIC Plasmide (5 μL). 5 min bei 70 °C inkubieren, an einer Rampe von 0,1 °C/s auf 22 °C abkühlen und 30 min mit einer PCR-Maschine bei 22 °C halten.
    HINWEIS: Verlängern Sie die Inkubationszeit auf über Nacht bei 4 °C, um eine höhere Effizienz des LIC-Klonens zu erreichen.
  4. 5 μL der LIC-Reaktionsprodukte in die E. coli DH5α umwandeln und auf einer LB-Platte mit 50 μg/ml Kanamycin wachsen62,63. Wählen und verifizieren Sie positive Kolonien durch PCR mit den Klonprimern und dem universellen Primer für den PVX-LIC-Vektor, gefolgt von der Sequenzierung.
    1. Führen Sie eine Kolonie-PCR mit dem Vorwärtsprimer für PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') in Kombination mit dem Reverse Primer für das STTM-Klonen durch, um positive Klone zu identifizieren. Die Größe des PCR-Bandes sollte ~ 300 bp betragen.
      HINWEIS: Überprüfen Sie die Sequenzen von STTM-Fragmenten anhand der Terminatorzyklussequenzierung64,65.
  5. Isolieren Sie die PVX-STTM-Plasmide aus den validierten Klonen und wandeln Sie sie in Agrobacterium-Stämme GV3101, GV2260 oder EHA10562,63 um. Verifizieren Sie Agrobacterium-Kolonien durch PCR.
    HINWEIS: Bestätigen Sie Agrobacterium-Kolonien durch PCR mit dem Forward Primer für PVX-LIC und dem Reverse Primer für das STTM-Klonen.

3. Führen Sie einen PVX-basierten VbMS-Assay in Kartoffelpflanzen durch.

  1. Verpflanzen Sie 4 Wochen alte In-vitro-Kartoffelpflanzen in den Boden. Die transplantierten Pflanzen werden 3–4 Tage später einem VbMS-Assay unterzogen.
  2. Impfen Sie Kartoffelpflanzen mit Agrobacterium , das die PVX-STTM-Plasmide enthält.
    HINWEIS: Für den VbMS-Assay in Kartoffeln werden agrobacterium-vermittelte Infiltration und Zahnstocher-kratzende Inokulation gleichzeitig durchgeführt.
    1. Picken und impfen Sie positive Transformanten, die PVX-STTM-Vektoren enthalten, in 50 ml flüssige LB mit 50 μg/ml Kanamycin und 50 μg/ml Rifampicin. Wachsen Sie in einem 28 °C Inkubator bei 220 U / min für 16 h bis OD600 = 1,0.
    2. Gleichzeitig streifen Sie die positiven Agrobacterium-Kolonien auf mindestens zwei neue LB-Platten mit 50 μg/ml Kanamycin und 50 μg/ml Rifampicin und wachsen 1 Tag lang bei 28 °C. Fügen Sie den PVX-LIC38,66-Vektor als Kontrolle und PVX-GFP67,68 zur Überwachung der Virusausbreitung hinzu.
    3. Sammeln Sie die Agrobacterium-Flüssigkultur durch Zentrifugation bei 3.400 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Agrobacterium-Zellen mit einem gleichen Volumen an Infiltrationspuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES und 200 μM Acetosyringon, pH = 5,6) resuspendieren und auf OD600 = 1,0 einstellen. Bei Raumtemperatur 6 h inkubieren.
    4. Infiltrieren Sie die Agrobacterium-Kultur mit einer 1 ml nadellosen Spritze in die Abaxialseite vollständig expandierter Blätter.
      1. Drehen und halten Sie ein Blatt mit einer Hand und verwenden Sie dann einen Finger, um die Blattlamina von der adaxialen Seite an der Infiltrationsstelle zu stützen. Halten Sie die Spritze mit der anderen Hand senkrecht zur Blattoberfläche und infiltrieren Sie die Agrobacterium-Kultur in die abaxiale Seite der Lamina.
    5. Kratzen Sie die Agrobacterium-Kultur von den LB-Platten und kratzen Sie mit einem Zahnstocher an der Stammoberfläche der ersten ein oder zwei Internodien der infiltrierten Kartoffelpflanzen. Kratzen Sie vorsichtig die Epidermis des Stiels. Vermeiden Sie es, durch den Stängel zu stechen, was zu schweren Schäden an den Pflanzen führen kann.
  3. Züchten Sie die infiltrierten Pflanzen bei 22 °C mit einer Photoperiode von 16 h Licht/8 h Dunkelheit und einer Lichtintensität von 120 μmol/m2∙ s1 in einem Gewächshaus.
    HINWEIS: Phänotypen, die durch miRNA-Silencing verursacht werden, treten normalerweise 2-4 Wochen nach der Aminokulation auf (Abbildung 2, Abbildung 3). Es dauert in der Regel 10-20 Tage, bis der VbMS-Phänotyp nach der Infiltration auftritt. Der VbMS-Phänotyp hängt von den Eigenschaften der spezifischen miRNA- und Zielgene, den Wachstumsbedingungen und den Kartoffelsorten ab.

4. Führen Sie eine Ausdrucksanalyse durch.

  1. Wenn Phänotypen 2-4 Wochen nach der Aminokulation auftreten, sammeln Sie Gewebe wie Triebe, Blätter, Blüten oder Wurzeln mit Phänotypen aus den VbMS-Pflanzen und Geweben aus den Kontrollpflanzen mit einer Schere. Isolieren Sie die Gesamt-RNAs aus den gesammelten Geweben.
  2. Überprüfen Sie die RNA-Qualität durch Elektrophorese62,63 und quantifizieren Sie die RNA-Konzentration, indem Sie die OD260-Absorption mit einem Spektralphotometer messen.
  3. Verwenden Sie stem-loop real-time reverse transcription PCR (RT-PCR), um die miRNA-Expression zu analysieren.
    1. Entwerfen Sie für bestimmte miRNAs einen Stem-Loop-Reverse-Transkriptionsprimer. Stem-Loop-RT-Primer enthalten ein universelles 5'-Backbone und eine 3' 6-nt-Erweiterung einer spezifischen miRNA. Entwerfen Sie ein 5'-Universal-Backbone (5'- GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3'), das eine Stamm-Loop-Struktur bildet. (Der Großbuchstabe entspricht einer umgekehrt-wiederholten Sequenz und der Kleinbuchstabe dem Schleifenbereich).
    2. Ein Teil der 5'-Backbone-Sequenz, die eine Schleife bildet, dient als reverse Primer für die nachfolgende PCR-Amplifikation (fett-kursive Sequenz in der Backbone-Sequenz). Fügen Sie eine 6-nt-Erweiterungssequenz hinzu, die umgekehrt komplementär zum 3'-Ende der miRNA ist, das für den Stem-Loop-Primer von Interesse ist, um Spezifität für die umgekehrte Transkription bereitzustellen (ergänzende Abbildung 1A).
      HINWEIS: Entwerfen Sie den Stem-Loop-Reverse-Transkriptionsprimer, wie von Chen et al.69 und Erika Varkonyi-Gasic et al.70,71,72 beschrieben. Zum Beispiel ist der Stem-Loop Reverse Transcription Primer für Stu-miR160 als 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGCATA-3' konzipiert. Der Stem-Loop Reverse Transkription Primer für die Kartoffel miR165/166 Familie ist als 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGGG(A/G)A-3' konzipiert. (Die fett gedruckten Großbuchstabensequenzen bieten die Spezifität der reversen Transkription für bestimmte miRNAs).
    3. Richten Sie die Reverse-Transkriptionsreaktion ein, indem Sie 50–200 ng Gesamt-RNA, 1 μL des Stem-Loop-Reverse-Transkriptionsprimers (100 μM), 2 μL 10x Puffer, 0,2 μL RNase-Inhibitor (40 U/μL), 0,25 μL dNTPs (je 10 mM) und 1 μL Reverse Transkriptase (200 U/μL) auf Eis mischen. Nukleasefreies ddH2O zu einem Gesamtvolumen von 20 μL hinzufügen.
    4. Führen Sie eine umgekehrte Transkription mit dem gepulsten reversen Transkriptionsverfahren durch. Inkubieren Sie das Reverse Transkriptionsreaktionsgemisch bei 16 °C für 30 min, führen Sie einen Temperaturzyklus von 30 °C für 30 s, 42 °C für 30 s und 50 °C für 1 s für insgesamt 60 Zyklen durch und inaktivieren Sie die Reverse Transkriptase durch Inkubation bei 85 °C für 5 min.
    5. Für die Real-Time-PCR-Analyse der miRNA-Expression entwerfen Sie den Forward-Primer basierend auf der miRNA-Sequenz, schließen jedoch keine Sequenzen ein, die sich mit dem oben entworfenen Stem-Loop-Reverse-Transkriptions-Primer überlappen. Fügen Sie den 5' des Vorwärtsprimers eine 3-7-nt-Erweiterung hinzu, um die Länge, die Schmelztemperatur und den GC-Gehalt zu optimieren (ergänzende Abbildung 1).
      HINWEIS: Der universelle Reverse Primer ist 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. Zum Beispiel ist der Stem-Loop Reverse Transkription Primer für Stu-miR160 als 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3' konzipiert. Der Stem-Loop Reverse Transcription Primer für die miR165/166-Familie ist 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. Die fett gedruckten Sequenzen dienen als 5'-Erweiterungen zur Primer-Optimierung. Die Stem-Loop-Reverse-Transkriptions-Primer und die Real-Time-PCR-Primer für miRNA können mit dem miRNA Primer Design Tool73 entworfen werden.
  4. Synthetisieren Sie cDNAs der Ziel-mRNAs mittels Standard-Reverse-Transkriptions-PCR (RT-PCR). Inkubieren Sie das Reverse Transkriptionsreaktionsgemisch bei 37 °C für 60 min und inaktivieren Sie die Reverse Transkriptase durch Erhitzen auf 85 °C für 5 min.
    HINWEIS: (1) Prognostizieren Sie Ziel-mRNAs mit dem psRNATarget-Programm74, wenn die Ziel-mRNAs nicht bekannt sind. (2) Der universelle Reverse Transcription Primer für mRNA ist ein verankerter Primer 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
  5. Richten Sie die real-time PCR-Reaktion sowohl für die miRNA von Interesse als auch für die Ziel-mRNAs ein. Mischen Sie 0,5 μL Template-cDNA, 5 μL 2x real-time PCR-Puffer mit SYBR green, 0,05 μL jedes Forward- und Reverse-Primers (40 μM) und 4,4 μL ddH2O in einem Gesamtvolumen von 5 μL auf Eis.
  6. Bei 95 °C für 3 min, 40 Zyklen von 95 °C für 3 s und 60 °C für 30 s inkubieren. Führen Sie eine anschließende Schmelzkurvenanalyse wie folgt durch: Inkubieren bei 95 °C für 15 s, Abkühlen auf 60 °C an einer Rampe von 20 °C/s, Halten bei 60 °C für 60 s, Erhitzen auf 95 °C bei einer Rampe von 0,2 °C/s und Halten bei 95 °C für 15 s. Analysieren Sie die Ct-Werte mit den ΔΔCt-Methoden76,77 und zeichnen Sie die Mittelwerte mit Standardfehlern auf.
    HINWEIS: (1) Die real-time PCR Primer für Ziel-mRNAs können wie beschrieben entworfen werden75. (2) Das Kartoffelpolyubiquitin-10-Gen kann als interne Kontrolle für die Normalisierung in Kartoffeln dienen. Der Vorwärtsprimer für das Kartoffelpolyubiquitin-10-Gen ist 5'-ATGTTGCCTTTCTTATGTGTGGTTG-3' und der reverse Primer 5'-TTATTTATTCACATAAACGACAGTTCAACC-3'. (3) Bei der Real-Time-PCR-Analyse können Kontamination und Primer-Dimer-Bildung zu falsch positiven Ergebnissen führen. Um die unspezifische Amplifikation zu überwachen und die Haftung der Real-Time-PCR-Analyse zu erhöhen, wird empfohlen, Kontrollen ohne Template und Reverse Transkriptase für Real-Time-PCR-Assays einzubeziehen.

Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt die PVX-STTM165/166 Kartoffelpflanzen (Katahdin) mit ektopischem Wachstum von Blattgeweben von der Abaxialseite der Blattlamina entlang der Venen. Schwerere Phänotypen wie trompetenförmige Blattbildung wurden ebenfalls beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde in den PVX-Kontrollanlagen keine phänotypische Anomalie beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass das VbMS-System die endogene miRNA-Funktion in tetraploiden Kartoffelpflanzen wirksam unterdrückte und das PVX-VbMS-Syste...

Diskussion

Wir präsentieren ein PVX-basiertes miRNA-Silencing-System zur Charakterisierung der Funktion von endogenen miRNAs in Kartoffeln durch Integration des STTM-Designs in den PVX-Vektor. Das VbMS-System erwies sich als wirksam bei der Stummschaltung von miRNA165/166 in Kartoffeln, einer hochkonservierten miRNA-Familie über Pflanzenarten hinweg.

Der TM-Ansatz wurde entwickelt, um die Expression von miRNAs auf der Grundlage einer künstlichen miRNA-Zielmimik zu stören, die eine Mismatch-Schleife a...

Offenlegungen

Nichts.

Danksagungen

Wir danken Dr. Yule Liu von der Tsinghua University für die Bereitstellung des PVX-LIC-Vektors. Diese Arbeit wurde von einem Start-up-Fonds der Texas A&M AgriLife Research und dem Hatch Project TEX0-1-9675 des USDA National Institute of Food and Agriculture an JS unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
100 µM dATP and 100 µM dTTPOmega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USATQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0.Teknova, Hollister, CA 95023, USA#S0297
AcetosyringoneTCI America, Portland, OR 97203, USAD2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
ChloroformVWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USAVWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSOTCI America, Portland, OR 97203, USAD0798-25G
DTTVWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USAVWRV0281-25G
E. coli DB3.1for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5αfor the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather FeedICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USAG99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPsRoche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		7958960001
Isoamyl alcoholVWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USAVWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 ProofDecon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USAV1005M
MESTCI America, Portland, OR 97203, USAM0606-250G
MgCl2ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USAMFCD00149781
M-MuLV Reverse TranscriptaseNew England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USAM0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-FiThermoFisher, Waltham, MA 02451, USAND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR SystemBio-Rad, Hercules, California 94547, USA170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler proEppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA950030010
pH meterSper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USABenchtop pH / mV Meter - 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0.VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USAVWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan GumAlfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USAJ63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LICZhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR SystemThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) KitRoche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		7959389001
Restriction enzyme: SmaINew England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USAR0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMixQuanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA KitOmega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USASKU: D3485-01
RNase Inhibitor MurineNew England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USAM0314L
RNAzol RTSigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USAR4533
Soil: Metro-Mix 360Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USAMetro-Mix 360
T4 DNA polymerase and bufferNew England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USAM0203S

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