हम PVX-LIC वेक्टर प्रदान करने के लिए Tinghua University के डॉ यूल लियू को धन्यवाद देते हैं। इस काम को टेक्सास ए एंड एम एग्रीलाइफ रिसर्च और हैच प्रोजेक्ट TEX0-1-9675 से यूएसडीए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ फूड एंड एग्रीकल्चर से जेएस तक स्टार्ट-अप फंड द्वारा समर्थित किया गया था।

1. आलू के पौधे उगाएं।
<ol><li>संस्कृति ट्यूबों (25 x 150 मिमी) में इन विट्रो आलू के पौधों को मुराशिगे और स्कूग (एमएस) मीडिया प्लस गैम्बोर्ग के विटामिन (एमएस बेसल नमक मिश्रण, गैम्बोर्ग के विटामिन, 30 ग्राम / एल सुक्रोज,...

हम एक PVX-आधारित miRNA मौन प्रणाली प्रस्तुत करने के लिए PVX वेक्टर में STTM डिजाइन को एकीकृत करके आलू में अंतर्जात miRNAs के कार्य को चिह्नित करने के लिए। VbMS प्रणाली आलू में miRNA165/166 को शांत करने में प्रभावी साबित हुई, जो प?...

संयंत्र माइक्रोआरएनए (miRNAs) को 20-24 न्यूक्लियोटाइड-लंबे, परमाणु-एन्कोडेड नियामक आरएनए 1 के रूप में चिह्नित किया गया है और पौधे की जैविक प्रक्रियाओं के लगभग हर पहलू में मौलिक भूमिका निभाता है, जिसमें विकास और विकास 2,3, प्रकाश संश्लेषण और चयापचय 4,5,6,7, हार्मोन संश्लेषण और सिग्नलिंग 8,9, जैविक और अजैविक प्रतिक्रियाएं शामिल हैं10, 11,12,13, और पोषक तत्व और ऊर्जा विनियमन 14,15। संयंत्र miRNAs की नियामक भूमिकाओं को अच्छी तरह से क्रमादेशित किया जाता है और आमतौर पर पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल स्तरों पर या तो लक्ष्य mRNA को दबाकर या अनुवादिक रूप से दबाकर पूरा किया जाता है।
 आलू 16,17,18,19,20,21 में एमआईआरएनए की पहचान, ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइलिंग और लक्ष्य की भविष्यवाणी की दिशा में जबरदस्त प्रगति हुई है। हालांकि, आलू सहित पौधों में एमआईआरएनए का कार्यात्मक लक्षण वर्णन, कुशल और उच्च-थ्रूपुट आनुवंशिक दृष्टिकोण की कमी के कारण अन्य जीवों से पीछे रह गया है। मानक हानि-कार्य विश्लेषण द्वारा व्यक्तिगत miRNA का कार्यात्मक विश्लेषण करना चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि अधिकांश miRNAs काफी आनुवंशिक अतिरेक 22 वाले परिवारों से संबंधित हैं। इसके अलावा, एक एकल miRNA कई लक्ष्य जीन23 को नियंत्रित कर सकता है और कई अलग-अलग miRNas एक ही आणविक मार्ग को सहयोगी रूप से 24,25 से संशोधित कर सकते हैं। ये गुण एक विशिष्ट miRNA या miRNA परिवार के कार्य को चिह्नित करना मुश्किल बनाते हैं।
MIRNAs के अधिकांश कार्यात्मक विश्लेषण ने लाभ-के-फ़ंक्शन दृष्टिकोणों पर बहुत अधिक भरोसा किया है जिनकी स्पष्ट सीमाएं हैं। कृत्रिम miRNA (amiRNA) विधि एक उच्च स्तर पर miRNAs का उत्पादन करने के लिए अंतर्जात प्राथमिक टेपों (pri-miRNAs) का शोषण करती है, जिससे लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति 26,27,28,29 का निषेध होता है। हालांकि, सक्रियण टैगिंग और miRNA overexpression एक मजबूत संवैधानिक 35S प्रमोटर का उपयोग करके अक्सर miRNAs की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति का कारण बनता है जो विवो स्थितियों में प्रतिनिधि नहीं हैं और इसलिए mirnas30 के अंतर्जात कार्य को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण विकसित किया गया है जिसमें लक्ष्य जीन के miRNA-प्रतिरोधी रूपों की अभिव्यक्ति शामिल है जिसमें बाध्यकारी और / या दरार साइटों में अशुद्ध उत्परिवर्तन होते हैं31,32,33। लेकिन यह दृष्टिकोण संभावित रूप से ट्रांसजेनिक कलाकृतियों के कारण एमआईआरएनए-प्रतिरोधी लक्ष्य ट्रांसजीन से व्युत्पन्न फेनोटाइप की गलत व्याख्या का कारण बन सकता है। इसलिए, इन लाभ-के-फ़ंक्शन अध्ययनों से निष्कर्ष सावधानी के साथ तैयार किए जाने चाहिए34। उपर्युक्त वर्णित दृष्टिकोणों की एक और प्रमुख सीमा यह है कि उन्हें परिवर्तन की आवश्यकता होती है, जो श्रम-गहन और समय लेने वाली है। इसके अलावा, ट्रांसजीन-निर्भर दृष्टिकोण शायद ही ट्रांसफॉर्म-अड़ियल पौधों की प्रजातियों के लिए लागू होते हैं। इसलिए, mirnas के कार्य को सुलझाने के लिए एक तेज और कुशल हानि-के-फ़ंक्शन दृष्टिकोण को विकसित करना आवश्यक है।
परिवर्तन प्रक्रिया की शर्त को बायपास करने के लिए, वायरस-व्युत्पन्न वैक्टर के साथ लक्ष्य नकल (टीएम) रणनीतियों के संयोजन से वायरस-आधारित माइक्रोआरएनए साइलेंसिंग (वीबीएमएस) स्थापित किया गया है। VbMS प्रणाली में, कृत्रिम रूप से डिज़ाइन किए गए टीएम अणुओं को वायरस बैकबोन से क्षणिक रूप से व्यक्त किया जाता है, जो पौधे अंतर्जात miRNAs35,36 के कार्य को विच्छेदित करने के लिए एक शक्तिशाली, उच्च-थ्रूपुट और समय-बचत उपकरण की पेशकश करता है। VbMS शुरू में तम्बाकू रैटल वायरस (TRV)35,36,37 के साथ N. benthamiana और टमाटर में विकसित किया गया था और आलू वायरस X (PVX)38, कपास पत्ती crumple वायरस (ClCrV)39, ककड़ी मोज़ेक वायरस (CMV)40,41,42, चीनी गेहूं मोज़ेक वायरस (CWMV)43 सहित विभिन्न अन्य वायरस अभिव्यक्ति प्रणालियों का उपयोग करके Arabidopsis, कपास, गेहूं, और मक्का के लिए विस्तारित किया गया है , और जौ पट्टी मोज़ेक वायरस (BSMV)44,45.
आलू (सोलनम ट्यूबरोसम) चौथी सबसे महत्वपूर्ण खाद्य फसल है और दुनिया में सबसे व्यापक रूप से उगाई जाने वाली गैर-सीरियल फसल है, मुख्य रूप से इसके उच्च पोषण मूल्य, उच्च ऊर्जा उत्पादन और अपेक्षाकृत कम इनपुट आवश्यकताओं के कारण। आलू की कई विशेषताएं इसे एक आकर्षक डाइकोटिलेडोनस मॉडल प्लांट बनाती हैं। यह एक वनस्पति रूप से प्रचारित पॉलीप्लॉइड फसल है जिसमें उच्च आउटक्रॉसिंग दर, हेटरोजाइगोसिटी और आनुवंशिक विविधता है। हालांकि, आज तक, वीबीएमएस का उपयोग करके आलू में एमआईआरएनए के कार्य की विशेषता वाली कोई रिपोर्ट नहीं है। यहां, हम आलू के पौधों में miRNAs के कार्य का मूल्यांकन करने के लिए एक बंधाव-स्वतंत्र क्लोनिंग (एलआईसी) -अनुकूलित आलू PVX-आधारित VbMS दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं38। हमने वीबीएमएस परख को चित्रित करने के लिए miR165/166 परिवार का चयन किया क्योंकि miR165/166 परिवार और उनके लक्ष्य mRNA और कक्षा III होमियोडोमेन / ल्यू जिपर (HD-ZIP III) प्रतिलेखन कारकों को बड़े पैमाने पर 22,47,48 की विशेषता दी गई है। HD-ZIP III जीन मेरिस्टेम विकास और अंग ध्रुवीयता के प्रमुख नियामक हैं, और miR165/166 फ़ंक्शन के दमन से HD-ZIP III जीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि होती है, जिसके परिणामस्वरूप प्लियोट्रोपिक विकासात्मक दोष जैसे कि कम एपिकल प्रभुत्व और पत्ती ध्रुवीयता के विकृत पैटर्न 22,35,38,41 . आसानी से स्कोरेबल विकासात्मक फेनोटाइप miRNA165/166 के मौन के साथ सहसंबद्ध PVX-आधारित VbMS परख की प्रभावशीलता के सटीक मूल्यांकन को सक्षम करते हैं।
इस अध्ययन में, हम प्रदर्शित करते हैं कि पीवीएक्स-आधारित वीबीएमएस प्रणाली आलू में एमआईआरएनए के कार्य को प्रभावी ढंग से अवरुद्ध कर सकती है। क्योंकि पीवीएक्स-आधारित वायरस-प्रेरित जीन साइलेंसिंग (वीआईजीएस) प्रणाली को कई आलू किस्मों 49,50,51,52 में स्थापित किया गया है, इस पीवीएक्स-आधारित वीबीएमएस दृष्टिकोण को संभवतः द्विगुणित और टेट्राप्लोइड आलू प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:691px;" width="691">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">100 &#181;M dATP and 100 &#181;M dTTP</td>
			<td style="width:188px;">Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA</td>
			<td style="width:120px;">TQAC136</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">3 M Sodium acetate, pH 4.0.</td>
			<td style="width:188px;">Teknova, Hollister, CA 95023, USA</td>
			<td style="width:120px;">#S0297</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:188px;">TCI America, Portland, OR 97203, USA</td>
			<td style="width:120px;">D2666-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Chloroform</td>
			<td style="width:188px;">VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td>
			<td style="width:120px;">VWRV0757-950ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:188px;">TCI America, Portland, OR 97203, USA</td>
			<td style="width:120px;">D0798-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DTT</td>
			<td style="width:188px;">VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td>
			<td style="width:120px;">VWRV0281-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">E. coli DB3.1</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">E. coli DH5&#945;</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>for the destination constructs generated by LIC cloning</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed</td>
			<td>ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA</td>
			<td style="width:120px;">G99260</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs</td>
			<td style="width:188px;">Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, 
			Wilmington, MA, USA</td>
			<td>7958960001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:188px;">VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td>
			<td style="width:120px;">VWRV0944-1L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Koptec Pure Ethanol &#8211; 200 Proof</td>
			<td style="width:188px;">Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA</td>
			<td style="width:120px;">V1005M</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MES</td>
			<td style="width:188px;">TCI America, Portland, OR 97203, USA</td>
			<td style="width:120px;">M0606-250G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MgCl2</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td>
			<td style="width:120px;">MFCD00149781</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">M-MuLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td>
			<td style="width:120px;">M0253L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;">Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td>
			<td style="width:120px;">ND-ONEC-W</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System</td>
			<td style="width:188px;">Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA</td>
			<td style="width:120px;">170-9703</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro</td>
			<td style="width:188px;">Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA</td>
			<td style="width:120px;">950030010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">pH meter</td>
			<td style="width:188px;">Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA</td>
			<td style="width:120px;">Benchtop pH / mV Meter - 860031</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0.</td>
			<td style="width:188px;">VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td>
			<td style="width:120px;">VWRV0883-400ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Phytagel: Gellan Gum</td>
			<td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA</td>
			<td style="width:120px;">J63423-A1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PVX VIGS vector: PVX-LIC</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:167px;">Zhao et al., 2016</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td>
			<td style="width:120px;">4485697</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Real-time PCR reagent: KAPA SYBR&#174; FAST qPCR Master Mix (2x) Kit</td>
			<td style="width:188px;">Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, 
			Wilmington, MA 01887, USA</td>
			<td style="width:120px;">7959389001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Restriction enzyme: SmaI</td>
			<td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td>
			<td>R0141S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix</td>
			<td>Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA</td>
			<td style="width:120px;">95107-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit</td>
			<td style="width:188px;">Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA</td>
			<td style="width:120px;">SKU: D3485-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">RNase Inhibitor Murine</td>
			<td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td>
			<td style="width:120px;">M0314L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">RNAzol RT</td>
			<td style="width:188px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA</td>
			<td style="width:120px;">R4533</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Soil: Metro-Mix 360</td>
			<td>Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA</td>
			<td style="width:120px;">Metro-Mix 360</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">T4 DNA polymerase and buffer</td>
			<td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td>
			<td style="width:120px;">M0203S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

potato virus x-based microrna silencing (vbms) in potato.

वायरस-आधारित माइक्रोआरएनए साइलेंसिंग (वीबीएमएस) पौधों में माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक तेज और कुशल उपकरण है। VbMS प्रणाली विकसित की गई है और Nicotiana benthamiana, टमाटर, Arabidopsis, कपास, और गेहूं और मक्का जैसे मोनोकोट पौधों सहित विभिन्न पौधों की प्रजातियों के लिए लागू किया गया है। यहां, हम आलू में अंतर्जात miRNAs को चुप करने के लिए PVX-आधारित VbMS वैक्टर का उपयोग करके एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। एक विशिष्ट miRNA की अभिव्यक्ति को नीचे गिराने के लिए, ब्याज के miRNA के लक्ष्य नकल (टीएम) अणुओं को डिजाइन किया गया है, पौधे के वायरस वैक्टर में एकीकृत किया गया है, और एग्रोबैक्टीरियम घुसपैठ द्वारा आलू में व्यक्त किया गया है ताकि ब्याज के अंतर्जात miRNA को सीधे बांधा जा सके और इसके कार्य को अवरुद्ध किया जा सके।

चित्रा 2 PVX-STTM165/166 आलू के पौधों (Katahdin) को नसों के साथ पत्ती लामिना के abaxial पक्ष से पत्ती के ऊतकों के अस्थानिक विकास के साथ दिखाता है। तुरही के आकार के पत्ते के गठन जैसे अधिक गंभीर फेनोटाइप भी देखे गए ह?...

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Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato.

हम आलू वायरस एक्स (पीवीएक्स) आधारित माइक्रोआरएनए साइलेंसिंग (वीबीएमएस) प्रणाली के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ताकि आलू में कार्यात्मक रूप से अंतर्जात माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) को चिह्नित किया जा सके। ब्याज के miRNA के लक्ष्य नकल (TM) अणुओं को PVX वेक्टर में एकीकृत किया जाता है और लक्ष्य miRNA या miRNA परिवार को चुप करने के लिए आलू में क्षणिक रूप से व्यक्त किया जाता है।

आलू वायरस एक्स आधारित माइक्रोआरएनए साइलेंसिंग (वीबीएमएस) आलू में।

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...

The traditional approach to analyzing the function of microRNAs in plants primarily relies on the generation of stable knockdown plants. This virus-based microRNA silencing system does not require tedious and time-consuming transformation. Virus-based microRNA silencing is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs in plants that can be applied to a broad range of diploid and tetraploid potato species.Demonstrating the procedure will be Jinping Zhao, a post-doctoral research associate from my laboratory. To design the target mimic module, insert a mismatch sequence into the reverse complement sequence of the microRNA of interest at the site corresponding to the 10th to 11th nucleotides of the microRNA. To amplify the short tandem target mimic fragment, set up a PCR reaction with each primer of interest, a 48 nucleotide space oligo, 10 times PCR buffer, a dNTP mixture, high fidelity PCR DNA polymerase, and double distilled water to a final volume of 50 microliters.Then amplify the microRNA by standard PCR using the parameters as indicated. To purify the short tandem target mimics, add 2.5 volumes of ethanol and a 1/10th volume of three molar sodium acetate to the PCR product. Mix vigorously before centrifuging the reaction at 14, 000 times G for 10 minutes.After removing the supernatant, rinse the pellet with one milliliter of 70%ethanol and allow the pellet to dry, then dissolve the pellet in 20 microliters of double distilled water. To set up a T4 DNA polymerase reaction, mix the purified short tandem target mimic PCR product with 10 times T4 DNA polymerase buffer, one molar dithiothreitol, 100 millimolar dATP, T4 DNA polymerase, and double distilled water to a final volume of five microliters on ice. Then incubate the mixture for 15 minutes at 37 degrees Celsius, followed by a 20-minute incubation at 75 degrees Celsius to inactivate the T4 DNA polymerase.To prepare the PVX-based VBMS construct, digest five micrograms of PVX ligation independent cloning plasmids with 2.5 microliters of SMA1 in a total volume of 100 microliters. Add an equal volume of phenol to chloroform to isoamyl alcohol, add a 25 to 24 to one ratio to the digested PVX ligation independent cloning products with vigorous mixing and collect the product by centrifugation. Add an equal volume of chloroform to isoamyl alcohol at a 24 to one ratio to the supernatant with vortexing before subjecting the tube contents to a second centrifugation.At the end of the spin, transfer the supernatant to a new centrifuge tube and add 2.5 volumes of ethanol and a 1/10th volume of three molar sodium acetate with vigorous mixing. Centrifuge the tube and rinse the pellet with one milliliter of 70%ethanol and vigorous vortexing. Centrifuge the tube again and remove the supernatant to allow the pellet to air dry.Then dissolve the digested PVX ligation independent cloning plasmid pellet in 100 microliters of double distilled water. To set up the T4 DNA polymerase reaction, mix the digested PVX ligation independent cloning vector DNA with 10 times T4 DNA polymerase buffer, one molar dithiothreitol, 100 millimolar dTTP, and T4 DNA polymerase to a final volume of five microliters on ice. Then incubate the mixture at 37 degrees Celsius for 15 minutes, followed by a 20-minute incubation at 75 degrees Celsius to inactivate the T4 DNA polymerase.To clone the short tandem target mimic sequence into the PVX ligation independent cloning vector, mix five microliters of the T4 DNA polymerase-treated short tandem target mimic PCR product with five microliters of the T4 DNA polymerase-treated PVX ligation independent cloning plasmid and incubate the mixture for five minutes at 70 degrees Celsius. At the end of the incubation, cool the tube contents to 22 degrees Celsius in a PCR machine at a rate of 0.1 degrees Celsius per second, leaving the tube in the thermocycler for 30 minutes once the target temperature is reached. At the end of the incubation, transform five microliters of ligation independent cloning reaction product into E.coli DH5 alpha using standard transformation protocols and grow the transformed bacteria on an LB plate containing 50 micrograms per milliliter kanamycin.After verifying the sequences of the short tandem target mimic fragments by terminator cycle sequencing, isolate the PVX VBMS plasmids from the validated clones and transform them into the appropriate Agrobacterium strains. To inoculate four-week-old in vitro potato plants with Agrobacterium containing the PVX VBMS plasmids, pick positive transformants containing PVX VBMS vectors and inoculate the transformants in 50 milliliters of liquid LB containing 50 micrograms per milliliter of kanamycin and 50 micrograms per milliliter of rifampicin for 16 hours at 28 degrees Celsius and 220 revolutions per minute. During the incubation, streak positive Agrobacterium colonies onto at least two new LB plates containing kanamycin and rifampicin and grow the cultures at 28 degrees Celsius for one day.When the optical density at 600 nanometers reaches 1.0, collect the Agrobacterium liquid culture by centrifugation and resuspend the pellet in a sufficient volume of infiltration buffer to adjust the optical density at 600 nanometers to 1.0. After a six-hour incubation at room temperature, load a one milliliter needleless syringe with the Agrobacterium suspension and use one hand to flip and hold an expanded leaf from one potato plant. Using one finger, support the leaf lamina from the adaxial side at the desired site of infiltration.And holding the syringe vertical to the leaf surface with the other hand, infiltrate 100 to 200 microliters of Agrobacterium culture into the abaxial side of the lamina. Next, use a toothpick to collect colonies from the Agrobacterium culture plates and to scratch the stem surface of the first one or two internodes of the infiltrated potato plants and the epidermis of the stem, then grow the infiltrated plants in the greenhouse for two to four weeks. When phenotypes appear, use scissors to collect samples with phenotypes from the VBMS and control plants.Isolate the total RNA from the collected tissues and use reverse transcriptase PCR to analyze the microRNA and target mRNA expression in each sample. In these images, PVX short tandem target mimic 165/166 potato plants with ectopic growth of leaf tissues from the abaxial side of leaf lamina along the veins can be observed. More severe phenotypes such as trumpet-shaped leaf formation have also been observed.In contrast, no phenotypical abnormalities are observed in PVX control plants, demonstrating that the VBSM system is effective in suppressing endogenous microRNA function in tetraploid potato plants. PVX short tandem target mimic 165/166 potato plants exhibit ectopic leaf to tissue growth from the abaxial side of the leaf lamina along the lamina veins, demonstrating that the PVX VBMS system can be applied to other potato varieties, including major potato cultivars. It is essential to simultaneously infiltrate the leafs and to inoculate the stem of the same plant with the same Agrobacterium culture.Transgenic approaches to stably introducing target mimic molecules into potato plants are recommended when the silencing state of the targeted microRNAs needs to be maintained in the offspring generations.

आलू वायरस एक्स आधारित माइक्रोआरएनए साइलेंसिंग (वीबीएमएस) आलू में।

Abstract