Secuenciación de ARN-Secuenciación de ARN-Captura láser para Análisis de Expresión Genética Espacial y Temporal Específica de Tejidos en Plantas

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para la microdisección de captura láser (LCM) de tejidos vegetales. LCM es una técnica microscópica para aislar áreas de tejido de una manera libre de contaminación. El procedimiento incluye fijación de tejido, incrustación de parafina, seccionamiento, LCM y extracción de ARN. El ARN se utiliza en el análisis de transcriptomas de transcriptomas específicos del tejido aguas abajo y resueltos temporalmente.

Resumen

El desarrollo de un organismo multicelular complejo se rige por tipos celulares distintos que tienen diferentes perfiles transcripcionales. Para identificar las redes reguladoras transcripcionales que rigen los procesos de desarrollo es necesario medir los perfiles de expresión génica espacial y temporal de estos tipos de células individuales. Por lo tanto, la comprensión del control espacio-temporal de la expresión génica es esencial para comprender cómo se regulan los procesos biológicos y de desarrollo. Aquí, describimos un método de microdisección de captura láser (LCM) para aislar un pequeño número de células de tres órganos embrionarios de cebada durante un curso de tiempo durante la germinación seguido de perfiles de transcripción. El método consiste en fijación de tejidos, procesamiento de tejidos, incrustación de parafina, seccionamiento, LCM y extracción de ARN seguido de PCR en tiempo real o ARN-seq. Este método nos ha permitido obtener perfiles espaciales y temporales de transcriptomas de órganos de semillas de diferentes números de células (decenas a cientos), proporcionando una especificidad tisular mucho mayor que los análisis típicos de tejido a granel. A partir de estos datos pudimos definir y comparar redes reguladoras transcripcionales, así como predecir los factores de transcripción regulatorias candidatos para tejidos individuales. El método debe ser aplicable a otros tejidos vegetales con una optimización mínima.

Introducción

El desarrollo y crecimiento de las plantas implican la acción coordinada de las redes reguladoras transcripcionales dentro de diferentes células que existen en un entorno celular complejo. Para entender la actividad de estas redes reguladoras, requerimos el conocimiento de la expresión génica espacial y temporal dentro de diferentes tipos de células en todas las etapas del desarrollo. Sin embargo, los análisis de la expresión génica se llevan a cabo más comúnmente en órganos enteros o muestras de tejido a granel debido al desafío técnico de aislar y analizar un pequeño número de células. El método que describimos aquí ha permitido obtener análisis de transcriptomas espaciales y temporales específicos del tejido mediante el acoplamiento de LCM con RNA-seq.

LCM fue desarrollado hace dos décadas por Emmert-Buck y colegas¹. La técnica permitió a los investigadores aislar con precisión células individuales o grupos de células de su entorno utilizando la visualización microscópica directa y la manipulación con un láser de haz estrecho^1. Desde entonces el método ha sido ampliamente utilizado en la biología del cáncer y la patología^2,3. Muchos grupos de investigación vegetal también han adaptado LCM para el uso con diferentes especies de plantas y diferentes tipos de tejidos^{4,,5,6,7,8,9,10,11}. Recientemente, varios trabajos también han utilizado LCM sobre semillas eudicot y monocot para estudiar embriones, endospermas y otras estructuras de semillas durante el desarrollo de semillas y la germinación^10,,12,,13. La mayoría de los otros métodos de aislamiento de una sola célula comúnmente utilizados, como micro-pipetting, clasificación celular, separación magnética y plataformas microfluídicas dependen de la digestión enzimática o homogeneización mecánica para disociar las células. Esto puede perturbar la expresión génica, introduciendo artefactos técnicos que confunda la interpretación de los datos^14,15. Estos métodos también requieren el conocimiento previo de los genes marcadores para cada tipo de célula para relacionar las células disociadas con su ubicación espacial y el tipo de célula verdadero. Otro grupo de técnicas depende del aislamiento basado en afinidad de estructuras subcelulares en lugar de células enteras, por ejemplo INTACT (Aislamiento de núcleos etiquetados en tipos de celdas) y TRAP (Traducción de la purificación de afinidad ribosoma)^16,17. Sin embargo, el etiquetado y la purificación de afinidad de núcleos o ribosomas son técnicamente desafiantes en especies vegetales que no tienen protocolos de transformación bien establecidos. LCM aprovecha la fijación rápida del tejido para preservar los niveles de transcripción y la identificación histológica convencional mediante la visualización directa de las células dentro de su contexto normal de tejido/órgano, lo que permite aislar las células discretas en un corto período de tiempo^18,,19.

El protocolo presentado aquí es un método optimizado para el aislamiento de células o tipos celulares específicos de las secciones tisulares de las semillas de cereales, que se puede aplicar a la mayoría de las células que pueden ser identificadas histológicamente. LCM proporciona un método sin contacto de aislamiento celular, reduciendo en gran medida la contaminación y aumentando la integridad del ARN recuperado. Además, el método ilustra el poder de la MTC en estudios genómicos a gran escala a partir de pequeñas cantidades de materiales biológicos. También describimos la amplificación lineal del ARN para generar suficiente material de entrada para análisis de transcripción/transcriptoma posterior.

Hay diez pasos principales en este protocolo LCM RNA-seq para transcriptomas espaciales y temporales específicos de los tejidos, incluyendo la fijación de muestras de tejido, deshidratación, infiltración de parafina, incrustación, seccionamiento, LCM, extracción de ARN, amplificación de ARN, cuantificación de ARN y qRT-PCR y/o ARN-seq (Figura 1).

Figura 1: Diagrama de flujo de LCM seguido de RNA-seq o qRT-PCR. LCM es una técnica espacialmente precisa y libre de contacto para recoger células de secciones de tejido fijo utilizando un rayo láser bajo visualización microscópica. El proceso comienza con la fijación de muestras de tejido, seguido de deshidratación utilizando una serie de gradientes de etanol y xileno, y terminado con infiltración de parafina. El proceso se puede automatizar completamente mediante el uso de un procesador de tejidos. Una vez que el tejido se infiltra con parafina, se incrusta en un molde con parafina fundida utilizando una estación de incrustación. El seccionamiento se lleva a cabo utilizando microtomos ajustados al espesor deseado. Se preparan las diapositivas y se realiza LCM inmediatamente antes de que el ARN se extraiga de las células capturadas. La extracción de ARN es seguida directamente por dos rondas de amplificación de ARN antes de qRT-PCR y/o ARN-seq. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

Como el producto final es ARN, tenga cuidado de evitar contaminar el trabajo con ARN. Usar guantes es imprescindible. Utilice agua tratada con pirocarbonato de dietil (DEPC), tampones, etc. Búferes de autoclave y cristalería de hornear antes de su uso.

1. Fijación de tejidos

1. Preparar fijador de elección dependiendo de la especie y los tipos de tejido; para la semilla de cebada, utilice el fijador del agricultor (75% etanol, 25% ácido acético glacial (v/v)).
2. Enfríe el fijador en hielo antes de cosechar los tejidos.
3. Recoger el material vegetal de interés y, si es necesario, diseccionarlo en trozos de tamaño adecuado para caber en el molde de incrustación seleccionado. Para la semilla de cebada, corte la semilla en la mitad longitudinalmente para ayudar a la penetración de la solución fijadora y para encajar en el molde de incrustación.
4. Sumerja el tejido en al menos 10 veces el volumen de fijador helado. Para la semilla de cebada, sumerja la semilla cortada en la mitad en el fijador.
5. Utilice la infiltración de vacío para acelerar la penetración de la fijación. Los tejidos deben hundirse después de la infiltración al vacío del fijador. Para la semilla de cebada, utilice 30 minutos de infiltración de vacío.
6. Sustituya el fijador e incubar a 4 oC para permitir que el fijador penetre completamente en el tejido. Para la semilla de cebada, incubar las muestras durante la noche (12-16 h).
   NOTA: Los tejidos más delgados o pequeños requerirán un tiempo de fijación más corto debido a la mayor tasa de difusión de fijador en el tejido.
7. Retire el tejido del fijador y transfiera el tejido a los casetes y luego comience el procesamiento del tejido.
   NOTA: El tejido pequeño o frágil, como el tejido de la hoja, se puede colocar en casetes para asegurarse de que no se dañe durante la fijación. Las bolsas, almohadillas o envolturas de biopsia se pueden utilizar para mantener el tejido de forma segura dentro de los casetes durante los pasos de fijación de tejidos y procesamiento de tejidos.

2. Procesamiento de tejidos

1. Utilice un procesador de tejido automatizado en el paso 2 con un mínimo de 10 cámaras de solución y 2 cámaras de parafina calentadas (ver Tabla de materiales).
2. Compruebe que hay cantidades adecuadas de solución en cada cámara; reemplazar las soluciones después de cada pocos usos del procesador de tejidos.
3. Coloque los casetes con tejido en la cesta metálica. Coloque la cesta metálica en su soporte por encima de la cámara 1. El soporte rotará y "dunk and dip" los cassettes en las cámaras, siguiendo el programa designado.
4. Ajuste el programa realizando clics de botón en los paneles de control del procesador de tejido que implican el ajuste del tiempo para cada cámara.
5. Pulse el botón "Inicio"para iniciar el programa de procesamiento. El siguiente programa está diseñado para semillas de cebada y se ejecuta durante la noche (18 h)
   1. Realice la deshidratación sumergiendo el cassette durante 1 h 30 minutos cada uno en la serie de gradientes de etanol (75%, 85%, 100%, 100% y 100% (v/v) etanol).
   2. Realice la limpieza con etanol: gradiente de xileno durante 1 h 30 min cada uno a 75:25, 50:50, 25:75 (etanol: % de xileno, v/v). A continuación, sumerja el cassette durante 1 h 30 min cada uno de 100% xileno y luego 100% xileno.
   3. Realizar la infiltración de parafina a 55-60 oC durante 1 h 30 min dos veces en parafina fundida.
      NOTA: La temperatura de las cámaras del calentador de parafina se puede ajustar en la parte posterior del procesador de tejido.
6. A la mañana siguiente, retire los casetes del procesador de tejidos y proceda a la incrustación de parafina.
   NOTA: El tiempo del programa puede variar entre diferentes tipos de tejido. El vacío y/o la agitación se pueden utilizar durante el procesamiento de tejidos para acelerar la infiltración de soluciones seleccionadas pulsando los botones "V" y/o "agitación"en el panel de control del procesador de tejidos.

3. Incrustación de parafina

1. Utilice una máquina de incrustación en este paso (consulte Tabla de materiales).
2. Preestablecer la máquina de incrustación para que se encienda al menos unas horas antes de la incrustación para permitir tiempo para que la parafina en los depósitos se derrita por completo.
3. Encienda la placa fría antes de empezar.
4. Incruste las muestras en moldes sosteniendo las muestras en posición utilizando fórceps finos y dispensando parafina fundida en el molde. Asegurar la orientación adecuada de las muestras para cada propósito experimental. Para la semilla de cebada, orientar la semilla longitudinal a la dirección de corte para obtener secciones longitudinales.
   NOTA: Los moldes de incrustación vienen en diferentes tamaños. Seleccione un tamaño adecuado para permitir que la muestra se coloque e incruste correctamente. La orientación de las muestras debe considerarse en función de las necesidades experimentales. Si se requieren secciones longitudinales, la muestra debe orientarse longitudinalmente a la dirección de corte, mientras que para las secciones transversales la muestra debe orientarse paralelamente a la dirección de corte.
5. Coloque un cassette limpio sobre el molde y asegúrese de que la suficiente parafina cubra completamente todo el cassette para sujetar la muestra en el cassette.
6. Coloque el molde sobre la placa fría y deje que la parafina se ajuste completamente (10-20 min) antes de liberar el bloque del molde.
7. Proceda a la seccionamiento o transferencia de los bloques a 4 oC para su almacenamiento.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Los bloques embebidos se pueden almacenar a 4 oC durante un máximo de tres meses.

4. Preparación de portaobjetos de membrana de naftalina de polietileno (PEN)

1. Sumerja los portaobjetos de membrana PEN en la solución de desactivación de RNase durante 3 s seguido de dos breves lavados en agua tratada con DEPC para eliminar las ADNs en los portaobjetos. Seque los portaobjetos en una incubadora de 37oC para eliminar la solución sobrante.
2. Tratamiento UV de los portaobjetos utilizando una lámpara UV en un armario de flujo laminar durante 30 minutos para mejorar las propiedades hidrófilas para mejorar la adherencia a la parafina.

5. Seccionamiento

1. Utilice un microtoma en el paso de seccionamiento (consulte Tabla de materiales).
2. Coloque una nueva cuchilla en el portacuchillas y mantenga siempre la protección del cuchillo cuando no se secise activamente
   ADVERTENCIA: Las cuchillas microtomos son extremadamente afiladas y pueden causar daños significativos cuando se manipulan de manera inadecuada.
   NOTA: Hay dos mecanismos de bloqueo en el microtomo, uno está en el lado de la máquina y el otro está en el mango de la rueda. Ambos deben participar cuando no se seccionan activamente.
3. Ajuste el bloque de cuchillas para que esté lo más cerca posible de la muestra sin tocarlo. Asegúrese de que el brazo de microtomo nunca entre en contacto completo con el bloque de cuchillas, ya que esto causará daños estructurales catastróficos al microtoma.
4. Encienda la placa fría antes de empezar. Mantenga los bloques de parafina en la placa fría antes de secciones y vuelva a enfriar los bloques cuando sea necesario durante el seccionamiento para evitar que los bloques se ablanden.
5. Llene el baño de agua con agua tratada con DEPC y caliente a 42 oC antes de comenzar.
6. Recortar bloques a la profundidad deseada (donde la sección que le interesa) y bloques de parafina de sección en el espesor deseado (6-10 m) utilizando el microtoma; un bloque bien seccionado formará una "cinta" en el borde de la hoja. Para semillas de cebada, sección con 8 m de espesor.
7. Transfiera suavemente cintas desde el microtoma al baño de agua con un cepillo de pintura fino o fórceps finos, asegurándose de que la cinta esté plana en la superficie del agua.
8. Sostenga un portaobjetos en un ángulo de 45o, utilizando un movimiento hacia arriba, levante una cinta del agua sobre el portaobjetos y retire cuidadosamente el exceso de agua con un tejido libre de pelusas.
9. Secar los toboganes durante 30 minutos a 37 oC para eliminar el agua restante debajo de la parafina.
10. Proceder a la extracción de parafina o almacenar a 4 oC en una caja cerrada en condiciones de deshidratación (que se utilizará en el plazo de varios días).
11. Retire la parafina lavando los portaobjetos 3x durante 20 s cada uno en xileno, seguido de lavados 2x de 30 s en etanol 100% (v/v) y 2 lavados de 30 s en etanol 70% (v/v).
12. Proceda inmediatamente a la microdisección de captura láser después de retirar la parafina.
    NOTA: La criociructación es un método alternativo que se ha acoplado con éxito con LCM. La preparación de la muestra para la criocisión será diferente.

6. Microdisección de captura láser

1. Utilice un microscopio de microdisección de captura láser (ver Tabla de materiales)para microdiseccionar las células de las secciones de tejido desfilizado y seco.
2. Cargue las diapositivas en las tres ranuras disponibles.
3. Utilice las tapas adhesivas especiales de los tubos de recogida para recoger las muestras capturadas. Capturar sin líquido (colección seca) minimiza la actividad de la RNase. Cargue los tubos de recogida en las ranuras disponibles.
4. Mueva la etapa para localizar la región de la muestra que se debe cortar. Esto se puede hacer usando el ratón o el joystick de la máquina LCM, o las teclas de flecha en el teclado.
5. Para optimizar la velocidad de corte, la energía de corte y el enfoque, la energía y el enfoque de la catapultación de presión láser (LPC), primero se corta en un segmento en blanco libre de tejido en el portaobjetos de membrana. Para la semilla de cebada, la velocidad de corte es 18, CutEnergy a 52 CutFocus a 63, LPCEnergy a 78, enfoque LPC a 61 a 10x de aumento.
   NOTA: El enfoque de corte y la energía tienen que ser ajustados para diferentes diapositivas, diferentes tejidos, y el área capturada, pero las reglas generales son la potencia de catapultación es mayor que la potencia de corte y el láser tiene que ser desenfocado para la catapultación. Cuanto mayor sea el aumento de la lente objetivo, menor será el enfoque del láser y mayor será la energía.
6. Utilice las herramientas Dibujo para seleccionar celdas delineando el área de interés.
7. Seleccione la función RoboLPC en la barra de herramientas de funciones para catapultar las células en las tapas adhesivas en función de los parámetros optimizados obtenidos cortando en un segmento negro arriba.
   NOTA: Los parámetros de LCM varían entre los tipos de tejido, así como el grosor de la sección, la dureza del tejido y las lentes objetivas. Por lo tanto, es mejor optimizar cada diapositiva en un área de membrana simple sin muestra de tejido antes de cortar la muestra real.
8. Utilice las herramientas Marcar para marcar las regiones de interés para localizarlas inmediatamente seleccionando esa marca en la lista de elementos.
9. Compruebe mediante el botón "CapCheck" para inspeccionar la tapa adhesiva para confirmar que las muestras fueron capturadas. Típicamente, LCM de 10-15 secciones (200 células) por tapa se requiere para la extracción de ARN.
10. Mantenga las muestras capturadas en hielo. Proceda inmediatamente para la extracción de ARN para evitar la degradación del ARN.
    NOTA: Algunas microscopíaS LCM están equipadas con luz fluorescente que permite la captura de células etiquetadas con marcadores fluorescentes.

7. Extracción de ARN

1. Utilice un kit de aislamiento de ARN de entrada baja (consulte Tabla de materiales)para la extracción de ARN después de LCM. Estos kits están diseñados para recuperar ARN total de alta calidad consistentemente de menos de diez células.
2. Aísle el ARN total de los tipos de células capturados de acuerdo con las instrucciones del fabricante, incluido el tratamiento DNase en columna.
   NOTA: El primer paso de la extracción de ARN donde el tubo está invertido y parpadeado es crucial para asegurar que las muestras capturadas en la tapa estén en contacto con el búfer de extracción añadido.

8. Amplificación del ARN

1. Utilice un kit de amplificación de ARN antisrés (ARN) (ver Tabla de materiales) para una amplificación del ARN extraído por la transcripción in vitro para producir un ARN suficiente para la síntesis de la biblioteca de ARN-seq.
2. Realice dos rondas de amplificación utilizando el kit de amplificación de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   NOTA: Es importante precalentar el termociclista y la tapa a la temperatura indicada por el fabricante del kit (ver Tabla de Materiales). Un enfoque alternativo en lugar de amplificación de ARN es utilizar un kit de preparación de biblioteca de entrada baja para sintetizar la biblioteca directamente del ARN extraído.

9. Cuantificación del ARN

1. Cuantifique y califique el ARNr mediante un sistema automatizado de electroforesis (ver Tabla de materiales).
   NOTA: Se prefiere un sistema automatizado de electroforesis, ya que requiere menos muestra (1-2 l) y proporciona una imagen en forma de gel y un electroferograma para cada muestra individual.

10. qRT-PCR y/o ARN-seq

1. Sintetice el ADNc del ARN para qRT-PCR o para crear bibliotecas RNA-seq utilizando kits de biblioteca RNA-seq estándar.

Resultados

Generamos transcriptomas espaciales y temporales específicos de tejidos a partir de semillas de cebada durante la germinación utilizando nuestro protocolo LCM RNA-seq¹⁰. El estudio se llevó a cabo aplicando LCM ARN-seq a un pequeño número de células de tres órganos embrionarios (plumule, radicle tip, scutellum) cada 8 h durante un curso de tiempo de 48 horas durante la germinación (0-48 h, 7 puntos de tiempo) (Figura 2A,B).

Discusión

Muchos estudios de expresión génica específicos de los tejidos se han visto limitados por la disección manual de muestras, que consume mucho tiempo, requiere mucho trabajo, tiene un alto riesgo de contaminación y sólo puede utilizar muestras de que un agente humano es lo suficientemente hábil para cosechar. LCM es una técnica precisa y sin contacto para recoger células de secciones de tejido fijo utilizando un rayo láser operado mecánicamente bajo visualización microscópica.

Una b...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid 100 % ACS/R.	AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)	VWRC20104.323
AdhesiveCap 200 opaque	Zeiss	415190-9181-000
Clear base moulds 8 X 10	Leica	3803015
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	40718-25ML
High Sensitivity RNA ScreenTape	Agilent	5067-5579
Low­profile disp.blades DB80LS	Leica	14035843489
MembraneSlide 1.0 PEN	Zeiss	415190-9041-000
MessageAmp II aRNA Amplification Kit	Ambion (ThermoFisher)	AMB17515
On-Column DNase I Digestion Set	Sigma-Aldrich	DNASE70
Ovation RNA-Seq System V2	NuGen (Integrated Science)	7102-08
Paraffin (Surgipath Paraplast)	Leica	39601006
PicoPure RNA Isolation Kit	ABI (ThermoFisher)	KIT0214
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Ambion (ThermoFisher)	AM9780
Xylene	AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)	VWRC28975.360
Leica Benchtop Tissue Processor	Leica Biosystems	TP1020
Leica Heated Paraffin Embedding Module	Leica Biosystems	EG1150H
Leica Cold Plate	Leica Biosystems	EG1150C
Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets	LAF Technologies Pty Ltd	Safemate 1.5
Leica Fully Automated Rotary Microtome	Leica Biosystems	RM2265	with PALMRobo v 4.6 software
Zeiss PALM MicroBeam LCM system	Zeiss miscroscopy
TapeStation	Agilent	TapeStation 2200