Analyse de l’ARN de microdissection à capture laser pour analyse d’expression génique spécifique aux tissus spatiaux et temporels chez les plantes

Résumé

Présenté ici est un protocole pour la microdésection laser-capture (LCM) des tissus végétaux. LCM est une technique microscopique pour isoler les zones de tissu d’une manière sans contamination. La procédure comprend la fixation des tissus, l’incorporation de paraffine, la sectionnement, l’extraction de LCM et d’ARN. L’ARN est utilisé dans l’analyse spécifique aux tissus en aval et résolue temporellement des transcriptomes.

Résumé

Le développement d’un organisme multicellulaire complexe est régi par des types de cellules distincts qui ont des profils transcriptionnels différents. Pour identifier les réseaux de régulation transcriptionnels qui régissent les processus de développement, il est nécessaire de mesurer les profils d’expression des gènes spatiaux et temporels de ces différents types de cellules. Par conséquent, il est essentiel de mieux comprendre le contrôle spatio-temporel de l’expression génique pour mieux comprendre comment les processus biologiques et développementaux sont réglementés. Ici, nous décrivons une méthode de microdissection de capture laser (LCM) pour isoler un petit nombre de cellules de trois organes d’embryon d’orge au cours d’un cours de temps pendant la germination suivie du profilage de transcription. La méthode consiste en la fixation des tissus, le traitement des tissus, l’incorporation de paraffine, la sectionnement, l’extraction de LCM et d’ARN suivie d’une PCR ou d’un RNA-seq en temps réel. Cette méthode nous a permis d’obtenir des profils spatiaux et temporels des transcriptomes d’organes de semence à partir de différents nombres de cellules (des dizaines à des centaines), fournissant une spécificité tissulaire beaucoup plus grande que les analyses typiques des tissus en vrac. À partir de ces données, nous avons pu définir et comparer les réseaux de réglementation transcriptionnels ainsi que prévoir les facteurs de transcription réglementaires des candidats pour les tissus individuels. La méthode doit s’appliquer à d’autres tissus végétaux avec un minimum d’optimisation.

Introduction

Le développement et la croissance des plantes impliquent l’action coordonnée des réseaux de régulation transcriptionnels au sein de différentes cellules qui existent dans un environnement cellulaire complexe. Pour comprendre l’activité de ces réseaux de réglementation, nous avons besoin de la connaissance de l’expression des gènes spatiaux et temporels dans différents types de cellules à travers les stades de développement. Cependant, les analyses de l’expression des gènes sont plus couramment effectuées dans des organes entiers ou des échantillons de tissus en vrac en raison du défi technique d’isoler et d’analyser un petit nombre de cellules. La méthode que nous décrivons ici a permis d’obtenir l’analyse spatiale et temporelle de transcritome tissulaire-spécifique en couplant LCM avec l’ARN-seq.

LCM a été développé il y a deux décennies par Emmert-Buck et ses collègues¹. La technique a permis aux chercheurs d’isoler précisément les cellules individuelles ou les grappes de cellules de leur environnement en utilisant une visualisation microscopique directe et la manipulation avec un faisceau étroit laser¹. Depuis lors, la méthode a été largement utilisée dans la biologie du cancer et la pathologie^2,3. De nombreux groupes de recherche végétale ont également adapté LCM pour l’utilisation avec différentes espèces végétales et différents types de tissus^{4,5,6,7,8,9,10,11}. Récemment, plusieurs articles ont également utilisé LCM sur les graines eudicot et monocoques pour étudier l’embryon, les endospermes et d’autres structures de semences pendant le développement des semences et la germination^10,12,13. La plupart des autres méthodes d’isolement unicellulaire couramment utilisées telles que le micro-pipetage, le tri cellulaire, la séparation magnétique et les plates-formes microfluidiques dépendent de la digestion enzymatique ou de l’homogénéisation mécanique pour dissocier les cellules. Cela peut perturber l’expression des gènes, en introduisant des artefacts techniques qui confondent l’interprétation des données^14,15. Ces méthodes exigent également une connaissance préalable des gènes marqueurs pour chaque type de cellule pour relier les cellules dissociées à leur emplacement spatial et au vrai type de cellule. Un autre groupe de techniques dépend de l’isolement basé sur l’affinité des structures subcellulaires au lieu de cellules entières, par exemple INTACT (Isolation des noyaux marqués dans les types de cellules) et TRAP (Transducing Ribosome Affinity Purification)^16,17. Cependant, l’étiquetage et la purification des noyaux ou des ribosomes sont techniquement difficiles chez les espèces végétales qui n’ont pas de protocoles de transformation bien établis. LCM profite de la fixation rapide des tissus pour préserver les niveaux de transcription et l’identification histologique conventionnelle par visualisation directe des cellules dans leur contexte normal de tissu/organe, ce qui permet aux cellules discrètes d’être isolées dans un court laps de temps^18,19.

Le protocole présenté ici est une méthode optimisée pour l’isolement de cellules spécifiques ou de types de cellules des sections tissulaires des graines de céréales, qui peuvent être appliquées à la plupart des cellules qui peuvent être identifiées histologiquement. LCM fournit une méthode sans contact d’isolement cellulaire, réduisant considérablement la contamination et augmentant l’intégrité de l’ARN récupéré. En outre, la méthode illustre la puissance du LCM sur les études à grande échelle du génome à partir de petites quantités de matériaux biologiques. Nous décrivons également l’amplification linéaire de l’ARN pour produire suffisamment de matériel d’entrée pour les analyses de transcription/transcription.

Il y a dix étapes principales dans ce protocole d’ARN-seq de LCM pour les transcriptomes spatiaux et temporels spécifiques aux tissus, y compris la fixation des échantillons de tissu, la déshydratation, l’infiltration de paraffine, l’incorporation, la section, le LCM, l’extraction d’ARN, l’amplification d’ARN, la quantification de l’ARN et le qRT-PCR et/ou l’ARN-seq (Figure 1).

Figure 1 : Organigramme de LCM suivi de l’ARN-seq ou du qRT-PCR. LCM est une technique spatialement précise et sans contact pour recueillir les cellules à partir de sections de tissus fixes à l’aide d’un faisceau laser sous visualisation microscopique. Le processus commence par la fixation d’échantillons de tissus, suivi d’une déshydratation à l’aide d’une série de gradients d’éthanol et de xylène, et s’est terminé par une infiltration de paraffine. Le processus peut être entièrement automatisé à l’aide d’un processeur de tissus. Une fois que le tissu est infiltré avec de la paraffine, il est incorporé dans un moule avec de la paraffine en fusion à l’aide d’une station d’intégration. La section est effectuée à l’aide de microtomes réglés à l’épaisseur désirée. Les diapositives sont préparées et LCM effectuée immédiatement avant que l’ARN ne soit extrait des cellules capturées. L’extraction de l’ARN est suivie directement de deux cycles d’amplification de l’ARN avant qRT-PCR et/ou ARN-seq. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Protocole

Comme le produit final est l’ARN, prenez soin d’éviter de contaminer le travail avec RNases. Porter des gants est un must. Utiliser le pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) -eau traitée, tampons, etc. Tampons autoclave et cuire la verrerie avant utilisation.

1. Fixation des tissus

1. Préparer le fixatif de choix en fonction des espèces et des types de tissus; pour les semences d’orge, utiliser le fixatif de Farmer (75 % d’éthanol, 25 % d’acide acétique glaciaire (v/v)).
2. Refroidir le fixatif sur la glace avant la récolte des tissus.
3. Recueillir le matériel végétal d’intérêt et, si nécessaire, le disséquer en morceaux de taille appropriée pour s’insérer dans le moule d’incorporation sélectionné. Pour les graines d’orge, couper la graine en deux longitudinalement pour aider à la pénétration de la solution fixative et pour s’insérer dans le moule d’incorporation.
4. Submerger le tissu dans au moins 10x de volume de fixatif de glace. Pour les graines d’orge, submerger les graines coupées en deux dans le fixatif.
5. Utilisez l’infiltration sous vide pour accélérer la pénétration du fixatif. Les tissus doivent couler après l’infiltration sous vide du fixatif. Pour les graines d’orge, utiliser 30 min d’infiltration sous vide.
6. Remplacer le fixatif et l’incuber à 4 °C pour permettre au fixatif de pénétrer complètement le tissu. Pour les graines d’orge, incuber les échantillons pendant la nuit (~12-16 h).
   REMARQUE : Les tissus plus minces ou petits exigeront un temps de fixation plus court en raison du taux de diffusion plus élevé du fixatif dans le tissu.
7. Retirer le tissu du fixatif et transférer le tissu dans les cassettes, puis commencer le traitement des tissus.
   REMARQUE : Les tissus petits ou fragiles, tels que les tissus foliaires, peuvent être placés dans des cassettes pour les fixer afin de s’assurer qu’ils ne sont pas endommagés pendant la fixation. Des sacs de biopsie, des tampons ou des enveloppements pourraient être utilisés pour maintenir le tissu solidement à l’intérieur des cassettes pendant les étapes de fixation des tissus et de traitement des tissus.

2. Traitement des tissus

1. Utiliser un processeur de tissu automatisé à l’étape 2 avec un minimum de 10 chambres de solution et 2 chambres de paraffine chauffées (voir tableau des matériaux).
2. Vérifiez qu’il existe des quantités suffisantes de solutions dans chaque chambre; remplacer les solutions après quelques utilisations du processeur tissulaire.
3. Placer les cassettes avec du tissu dans le panier métallique. Attachez le panier en métal à son support au-dessus de la chambre 1. Le support tournera et « dunk and dip » les cassettes dans les chambres, suivant le programme désigné.
4. Définissez le programme en effectuant des clics de bouton sur les panneaux de commande du processeur de tissu qui impliquent la durée de réglage de chaque chambre.
5. Appuyez sur le bouton «Démarrer» pour démarrer le programme de traitement. Le programme suivant est conçu pour les graines d’orge et fonctionne toute la nuit (~18 h)
   1. Effectuer la déshydratation en trempant la cassette pendant 1 h 30 min chacun dans la série de gradient d’éthanol (75%, 85%, 100%, 100%, et 100% (v/v) éthanol).
   2. Effectuer le déblaiement à l’éthanol : gradient de xylène pendant 1 h 30 min chacun à 75:25, 50:50, 25:75 (éthanol : xylène %, v/v). Puis tremper la cassette pendant 1 h 30 min chacun de 100% xylène puis 100% xylène.
   3. Effectuer l’infiltration de paraffine à 55-60 °C pendant 1 h 30 min deux fois dans la paraffine fondue.
      REMARQUE : La température des chambres chauffantes de paraffine peut être réglée à l’arrière du processeur de tissu.
6. Le lendemain matin, retirez les cassettes du processeur de tissu et passez à l’incorporation de paraffine.
   REMARQUE : Le temps de programme peut varier d’un type de tissu à l’autre. Le vide et/ou l’agitation peuvent être utilisés pendant le traitement des tissus pour accélérer l’infiltration de solutions sélectionnées en appuyant sur les boutons «V» et/ou «agitation» sur le panneau de commande du processeur tissulaire.

3. Incorporation de paraffine

1. Utilisez une machine d’intégration à cette étape (voir Tableau des matériaux).
2. Prédéfinir la machine d’incorporation pour allumer au moins quelques heures avant l’intégration afin de laisser le temps à la paraffine dans les réservoirs de fondre complètement.
3. Allumez la plaque froide avant de commencer.
4. Incorporer des échantillons dans des moules en maintenant les échantillons en position à l’aide de forceps fins et en distribuant de la paraffine fondue dans le moule. Assurer une bonne orientation des échantillons à chaque fin expérimentale. Pour les semences d’orge, orienter la graine longitudinale vers la direction de coupe pour obtenir des sections longitudinales.
   REMARQUE : Les moules d’incorporation sont disponibles dans différentes tailles. Sélectionnez une taille appropriée pour permettre à l’échantillon d’être positionné et intégré correctement. L’orientation des échantillons doit être prise en compte en fonction des besoins expérimentaux. Si des sections longitudinales sont nécessaires, l’échantillon doit être orienté longitudinale vers la direction de coupe, tandis que pour les sections transversales, l’échantillon doit être orienté parallèlement à la direction de coupe.
5. Placez une cassette propre sur le moule et assurez-vous que suffisamment de paraffine couvre entièrement toute la cassette pour tenir l’échantillon sur la cassette.
6. Placez le moule sur la plaque froide et laissez la paraffine se régler complètement (10-20 min) avant de libérer le bloc de la moisissure.
7. Procéder à la sectionnage ou le transfert des blocs à 4 °C pour le stockage.
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Les blocs intégrés peuvent être stockés à 4 °C pendant une période pouvant aller jusqu’à trois mois.

4. Préparation de lames membranaires de polyéthylène naphtalate (PEN)

1. Submerger les lames de membrane PEN dans la solution de désactivation RNase pendant 3 s suivies de deux brèves lavages dans l’eau traitée par DEPC pour enlever les RNases sur les lames. Sécher les lames dans un incubateur de 37 °C pour enlever la solution laissée.
2. Traitement uv les lames à l’aide d’une lampe UV dans une armoire à débit laminaire pendant 30 min pour améliorer les propriétés hydrophiles pour l’adhérence améliorée de paraffine.

5. Sectionnage

1. Utilisez un microtome dans l’étape de sectionnage (voir Tableau des matériaux).
2. Placez une nouvelle lame dans le support du couteau, et gardez toujours la garde du couteau en l’état lorsqu’il n’est pas activement sectionné
   ATTENTION : Les lames de microtome sont extrêmement pointues et peuvent causer des dommages importants lorsqu’elles sont manipulées de manière inappropriée.
   REMARQUE : Il y a deux mécanismes de verrouillage sur le microtome, l’un est sur le côté de la machine et l’autre sur la poignée de la roue. Les deux doivent être engagés lorsqu’ils ne sont pas activement sectionnant.
3. Ajuster le bloc du couteau pour qu’il soit le plus près possible de l’échantillon sans toucher. Assurez-vous que le bras microtome n’entre jamais en plein contact avec le bloc de couteau car cela causera des dommages structurels catastrophiques au microtome.
4. Allumez la plaque froide avant de commencer. Gardez les blocs de paraffine sur la plaque froide avant de sectioner et de refroidir les blocs si nécessaire pendant la section pour empêcher les blocs de ramollir.
5. Remplissez le bain d’eau avec de l’eau traitée par dePC et chauffez à 42 °C avant de commencer.
6. Couper les blocs à la profondeur désirée (où la section qui vous intéresse) et les blocs de paraffine de section à l’épaisseur désirée (6-10 μm) à l’aide du microtome; un bloc bien sectionné formera un « ruban » au bord de la lame. Pour les graines d’orge, section d’une épaisseur de 8 μm.
7. Transférer délicatement les rubans du microtome vers le bain d’eau à l’aide d’un pinceau fin ou de forceps fins, en veillant à ce que le ruban soit plat à la surface de l’eau.
8. Tenez une lame à un angle de 45°, à l’aide d’un mouvement vers le haut, soulevez un ruban hors de l’eau sur la glissière et retirez soigneusement l’excès d’eau avec un tissu sans peluche.
9. Glisse sèche pendant 30 min à 37 °C pour éliminer toute eau restante sous la paraffine.
10. Procéder à l’enlèvement ou au stockage à 4 °C dans une boîte fermée dans des conditions de déshydratation (à utiliser dans les jours).
11. Retirer la paraffine en lavant les lames 3x pour 20 s chacune en xylène, suivie de 2x lavages de 30 s dans 100% (v/v) d’éthanol et 2x lavages de 30 s dans 70% (v/v) éthanol.
12. Passez immédiatement à la microdésection de capture au laser après l’enlèvement de la paraffine.
    REMARQUE : Cryosection est une méthode alternative qui a été couplée avec succès avec LCM. La préparation de l’échantillon pour la cryosection diffère.

6. Microdésection de capture laser

1. Utilisez un microscope à microdissection à capture laser (voir tableau des matériaux)pour microdissectiser les cellules provenant de sections de tissus dé-paraffinisés et séchés.
2. Chargez les diapositives sur les trois emplacements disponibles.
3. Utilisez les bouchons adhésifs spéciaux des tubes de collecte pour recueillir les échantillons capturés. La capture sans liquide (collecte « sèche ») minimise l’activité de RNase. Chargez les tubes de collecte dans les fentes disponibles.
4. Déplacez l’étape pour localiser la région de l’échantillon qui doit être coupée. Cela peut être fait à l’aide de la souris ou du joystick de la machine LCM, ou les touches fléchées sur le clavier.
5. Pour optimiser la vitesse de coupe, la réduction de l’énergie et de la mise au point, la pression laser catapultant l’énergie (LPC) de l’énergie et de se concentrer, d’abord coupé sur un segment vierge libre de tissu sur la lame de la membrane. Pour les semences d’orge, vitesse de coupe = 18, CutEnergy = 52 CutFocus = 63, LPCEnergy = 78, LPC focus = 61 à 10x grossissement.
   REMARQUE : La mise au point de coupe et l’énergie doivent être ajustées pour les différentes diapositives, les différents tissus et les zones capturées, mais les règles générales sont la puissance de catapultation est plus élevée que la puissance de coupe et le laser doit être défocus pour catapulter. Plus le grossissement de la lentille objective est élevé, plus le focus du laser est petit et plus l’énergie est élevée.
6. Utilisez les outils De dessin pour sélectionner des cellules en décrivant la zone d’intérêt.
7. Sélectionnez la fonction RoboLPC de la barre d’outils de la fonction pour catapulter les cellules dans les bouchons adhésifs en fonction des paramètres optimisés obtenus en coupant sur un segment noir ci-dessus.
   REMARQUE : Les paramètres de LCM varient d’un type de tissu à l’autre ainsi que l’épaisseur de la section, la dureté des tissus et les lentilles objectives. Par conséquent, il est préférable d’optimiser chaque diapositive sur une zone de membrane ordinaire sans spécimen de tissu avant de couper l’échantillon réel.
8. Utilisez les outils Indicateur pour marquer les régions d’intérêt pour les localiser immédiatement en sélectionnant cet indicateur dans la liste des éléments.
9. Vérifiez par "CapCheck" pour inspecter le bouchon adhésif pour confirmer que des échantillons ont été capturés. En règle générale, le LCM de 10 à 15 sections (~200 cellules) par bouchon est nécessaire pour l’extraction de l’ARN.
10. Gardez les échantillons capturés sur la glace. Procéder immédiatement à l’extraction de l’ARN afin d’éviter la dégradation de l’ARN.
    REMARQUE : Certaines microscopies LCM sont équipées d’une lumière fluorescente qui permet de capturer des cellules étiquetées avec des marqueurs fluorescents.

7. Extraction de l’ARN

1. Utilisez un kit d’isolation de l’ARN à faible entrée (voir Tableau des matériaux)pour l’extraction de l’ARN après LCM. Ces kits sont conçus pour récupérer l’ARN total de haute qualité de manière cohérente à partir de moins de dix cellules.
2. Isoler l’ARN total des types de cellules capturées selon les instructions du fabricant, y compris le traitement DNase à la colonne.
   REMARQUE : La première étape de l’extraction de l’ARN où le tube est inversé et cligné est cruciale pour s’assurer que les échantillons capturés sur le couvercle sont en contact avec le tampon d’extraction ajouté.

8. Amplification de l’ARN

1. Utiliser un kit d’amplification de l’ARN antisens (ARN) (voir tableau des matériaux) pour l’amplification de l’ARN extrait par transcription in vitro afin de produire suffisamment d’ARN pour la synthèse de la bibliothèque ARN-seq.
2. Effectuer deux tours d’amplification à l’aide du kit d’amplification de l’ARN selon les instructions du fabricant.
   REMARQUE : Il est important de préchauffer le thermocycler et le couvercle à la température indiquée par le fabricant du kit (voir tableau des matériaux). Une autre approche au lieu de l’amplification de l’ARN consiste à utiliser un kit de préparation de la bibliothèque à faible entrée pour synthétiser la bibliothèque directement à partir de l’ARN extrait.

9. Quantification de l’ARN

1. Quantifier et qualifier l’ARN à l’aide d’un système automatisé d’électrophorèse (voir tableau des matériaux).
   REMARQUE : Un système automatisé d’électrophorèse est préférable car il nécessite moins d’échantillon (1-2 μL) et fournit une image et un électrophérogramme en forme de gel pour chaque échantillon individuel.

10. qRT-PCR et/ou ARN-seq

1. Synthétisez l’ADN cD À partir de l’ARN pour qRT-PCR ou pour faire des bibliothèques ARN-seq à l’aide de kits de bibliothèque STANDARD ARN-seq.

Résultats

Nous avons généré des transcriptomes spécifiques aux tissus spatiaux et temporels à partir de graines d’orge pendant la germination à l’aide de notre protocole LCM ARN-seq¹⁰. L’étude a été réalisée en appliquant l’ARN-seq LCM à un petit nombre de cellules de trois organes embryonnaires (plumule, pointe radicule, scutellum) tous les 8 h sur un cours de 48 h pendant la germination (0-48 h, 7 points de temps) (Figure 2A,B).

Discussion

De nombreuses études d’expression génétique spécifiques aux tissus ont été limitées par la dissection à la main d’échantillons, qui prend beaucoup de temps, qui demande beaucoup de main-d’œuvre, présente un risque élevé de contamination et ne peut utiliser que des échantillons qu’un agent humain est suffisamment habile pour récolter. LCM est une technique précise et sans contact pour recueillir les cellules à partir de sections de tissus fixes à l’aide d’un faisceau laser actionné mécaniqu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid 100 % ACS/R.	AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)	VWRC20104.323
AdhesiveCap 200 opaque	Zeiss	415190-9181-000
Clear base moulds 8 X 10	Leica	3803015
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	40718-25ML
High Sensitivity RNA ScreenTape	Agilent	5067-5579
Low­profile disp.blades DB80LS	Leica	14035843489
MembraneSlide 1.0 PEN	Zeiss	415190-9041-000
MessageAmp II aRNA Amplification Kit	Ambion (ThermoFisher)	AMB17515
On-Column DNase I Digestion Set	Sigma-Aldrich	DNASE70
Ovation RNA-Seq System V2	NuGen (Integrated Science)	7102-08
Paraffin (Surgipath Paraplast)	Leica	39601006
PicoPure RNA Isolation Kit	ABI (ThermoFisher)	KIT0214
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Ambion (ThermoFisher)	AM9780
Xylene	AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)	VWRC28975.360
Leica Benchtop Tissue Processor	Leica Biosystems	TP1020
Leica Heated Paraffin Embedding Module	Leica Biosystems	EG1150H
Leica Cold Plate	Leica Biosystems	EG1150C
Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets	LAF Technologies Pty Ltd	Safemate 1.5
Leica Fully Automated Rotary Microtome	Leica Biosystems	RM2265	with PALMRobo v 4.6 software
Zeiss PALM MicroBeam LCM system	Zeiss miscroscopy
TapeStation	Agilent	TapeStation 2200