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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La fotoimmunoterapia nel vicino infrarosso (NIR-PIT) è una strategia terapeutica emergente per il cancro che utilizza un coniugato anticorpo-fotoassorbitore (IR700Dye) e la luce NIR per distruggere le cellule tumorali. Qui, presentiamo un metodo per valutare l'effetto antitumorale di NIR-PIT in un modello murino di carcinoma polmonare disseminato pleurico e mesotelioma pleurico maligno utilizzando l'imaging a bioluminescenza.

Abstract

L'efficacia della fotoimmunoterapia può essere valutata più accuratamente con un modello murino ortotopico che con uno sottocutaneo. Un modello di disseminazione pleurica può essere utilizzato per la valutazione dei metodi di trattamento per le malattie intratoraciche come il cancro del polmone o il mesotelioma pleurico maligno.

La fotoimmunoterapia nel vicino infrarosso (NIR-PIT) è una strategia di trattamento del cancro sviluppata di recente che combina la specificità degli anticorpi mirati al tumore con la tossicità causata da un fotoassorbitore (IR700Dye) dopo l'esposizione alla luce NIR. L'efficacia di NIR-PIT è stata riportata utilizzando vari anticorpi; tuttavia, solo pochi rapporti hanno mostrato l'effetto terapeutico di questa strategia in un modello ortotopico. Nel presente studio, dimostriamo un esempio di valutazione dell'efficacia del modello di carcinoma polmonare disseminato pleurico, che è stato trattato con NIR-PIT.

Introduzione

Il cancro rimane una delle principali cause di mortalità nonostante decenni di ricerca. Uno dei motivi è che la radioterapia e la chemioterapia sono tecniche altamente invasive, che possono limitare i loro benefici terapeutici. Le terapie a bersaglio cellulare o molecolare, che sono tecniche meno invasive, stanno ricevendo maggiore attenzione. La fotoimmunoterapia è un metodo di trattamento che potenzia sinergicamente l'effetto terapeutico combinando immunoterapia e fototerapia. L'immunoterapia migliora l'immunità tumorale aumentando l'immunogenicità del microambiente tumorale e riducendo la soppressione immunoregolatoria, con conseguente distruzione dei tumori nel corpo. La fototerapia distrugge i tumori primari con una combinazione di fotosensibilizzanti e raggi luminosi e antigeni specifici del tumore rilasciati dalle cellule tumorali migliorano l'immunità tumorale. I tumori possono essere trattati selettivamente utilizzando fotosensibilizzatori in quanto sono specifici e selettivi per le cellule bersaglio. La modalità della fototerapia comprende la terapia fotodinamica (PDT), la terapia fototermica (PTT) e le terapie basate sulla fotochimica1.

La fotoimmunoterapia nel vicino infrarosso (NIR-PIT) è un metodo recentemente sviluppato di fototerapia antitumorale che combina la terapia fotochimica e l'immunoterapia1,2. NIR-PIT è una terapia a bersaglio molecolare che prende di mira specifiche molecole di superficie cellulare attraverso la coniugazione di un colorante di ftaloccianina di silicio nel vicino infrarosso, IRdye 700DX (IR700), a un anticorpo monoclonale (mAb). La membrana cellulare della cellula bersaglio viene distrutta dopo irradiazione con luce NIR (690 nm)3.

Il concetto di utilizzare la terapia della luce mirata combinando fotosensibilizzatori convenzionali e anticorpi o PDT mirata ha più di tre decenni4,5. Studi precedenti hanno tentato di colpire gli agenti PDT convenzionali coniugandoli agli anticorpi. Tuttavia, c'è stato un successo limitato perché questi coniugati sono rimasti intrappolati nel fegato, a causa dell'idrofobicità dei fotosensibilizzatori6,7. Inoltre, il meccanismo di NIR-PIT è completamente diverso da quello del PDT convenzionale. I fotosensibilizzatori convenzionali generano stress ossidativo che deriva da una conversione di energia che assorbe l'energia luminosa, si disloca in uno stato eccitato, passa allo stato suolo e provoca apoptosi. Tuttavia, NIR-PIT provoca una rapida necrosi distruggendo direttamente la membrana cellulare aggregando fotosensibilizzatori sulla membrana attraverso una reazione fotochimica8. NIR-PIT è superiore al PDT mirato convenzionale in molti modi. I fotosensibilizzatori convenzionali hanno bassi coefficienti di estinzione, che richiedono l'attaccamento di un gran numero di fotosensibilizzatori a una singola molecola anticorpale, riducendo potenzialmente l'affinità di legame. La maggior parte dei fotosensibilizzatori convenzionali sono idrofobi, rendendo difficile legare i fotosensibilizzatori agli anticorpi senza compromettere la loro immunoreattività o l'accumulo di bersagli in vivo. I fotosensibilizzatori convenzionali in genere assorbono la luce nell'intervallo visibile, riducendo la penetrazione dei tessuti.

Diversi studi su NIR-PIT mirati a tumori intratoracici come il cancro del polmone e le cellule maligne del mesotelioma pleurico (MPM) sono stati riportati9,10,11, 12,13,14,15,16,17. Tuttavia, solo pochi rapporti hanno descritto l'efficacia di NIR-PIT nel MPM pleurico disseminato o nei modelli di cancro del polmone9,10,11,12. Si ritiene che i modelli di xenotrapianto tumorale sottocutaneo siano modelli tumorali standard e sono attualmente ampiamente utilizzati per valutare gli effetti antitumorali delle nuove terapie18. Tuttavia, il microambiente tumorale sottocutaneo non è permissivo per lo sviluppo di una struttura tissutale appropriata o di una condizione che ricapitola correttamente un vero fenotipo maligno19,20,21,22. Idealmente, dovrebbero essere stabiliti modelli di malattia ortotopica per una valutazione più precisa degli effetti antitumorali.

Qui, dimostriamo un metodo di valutazione dell'efficacia in un modello murino di carcinoma polmonare disseminato pleurico, che è stato trattato con NIR-PIT. Un modello murino di disseminazione pleurica viene generato iniettando cellule tumorali nella cavità toracica e confermato utilizzando la luminescenza della luciferasi. Il topo è stato trattato con un'iniezione endovenosa di mAb coniugata con irradiazione IR700 e NIR al torace. L'effetto terapeutico è stato valutato utilizzando la luminescenza della luciferasi.

Protocollo

Tutti gli esperimenti in vivo sono stati eseguiti in conformità con la Guida per la cura e l'uso delle risorse animali da laboratorio del Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Nagoya (approvazione #2017-29438, #2018-30096, #2019-31234, #2020-20104). Topi nudi omozigoti atimici di sei settimane sono stati acquistati e mantenuti presso l'Animal Center dell'Università di Nagoya. Quando si esegue la procedura nei topi, sono stati anestetizzati con isoflurano (introduzione: 4-5%, mantenimento 2-3%); la zampa è stata premuta con una pinzetta per confermare la profondità dell'anestesia.

1. Coniugazione di IR700 con mAb

  1. Incubare mAb (1 mg, 6,8 nmol) con estere IR700 NHS (66,8 mg, 34,2 nmol, 5 mmol/L in DMSO) in 0,1 mol/L Na2HPO4 (pH 8,6) a 15-25 °C per 1 h.
  2. Purificare la miscela usando una colonna (ad esempio, Sephadex). Preparare e lavare la colonna con PBS. Quindi, applicare la miscela sulla colonna e raccogliere la goccia, che contiene l'anticorpo coniugato IR700 purificato. Questo anticorpo coniugato IR700 è indicato come anticorpo fotosensibilizzatore coniugato (APC).
  3. Misurare la proteina e la concentrazione di IR700 nell'APC.
    1. Preparare le curve di calibrazione per proteine e IR700 utilizzando uno spettrofotometro.
    2. Mescolare le concentrazioni standard di albumina con un kit di analisi proteica seguendo il protocollo del kit (vedere Tabella dei materiali,colorazione proteica Coomassie Brilliant Blue (CBB).) Misurare l'assorbanza dell'albumina a 595 nm di lunghezza d'onda e tracciare la curva di calibrazione (una formula di approssimazione lineare) per la proteina usando la seguente equazione: y = ax + b (x: concentrazione, y: assorbanza).
    3. Ottenere curve di calibrazione per IR700 con assorbimento a 690 nm utilizzando la stessa procedura. La concentrazione standard di IR700 è raccomandata a 0,1-5 μM (0,1954-9,77 μg/mL).
    4. Misurare la concentrazione proteica e la concentrazione IR700 nell'APC utilizzando una curva di calibrazione [x = (y-b)/a (x: concentrazione, y: assorbanza)].
    5. Determinare il numero di coloranti IR700 legati per mAb con i risultati della concentrazione molare.
      NOTA: è importante determinare il numero di coniugazione ottimale di molecole IR700 per molecola mAb. Generalmente, circa tre molecole IR700 legate su una singola molecola di mAb sarebbero efficaci sia in vitro che in vivo. Molti IR700 legati per anticorpo (ad esempio, sei) rendono più facile essere intrappolati nel fegato durante gli esperimenti in vivo. Il rapporto tra gli anticorpi legati a IR700 era compreso tra 1:2 e 1:4. La proporzione di IR700 è stata ridotta, se necessario.
  4. Eseguire l'elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) come conferma per la formazione di un APC. Immagine del gel a 700 nm utilizzando un imager fluorescente e macchia la proteina nel gel usando un kit di colorazione proteica seguendo il protocollo del kit (vedi Tabella dei materiali,colorazione della proteina CBB).

2. Generazione di un modello di disseminazione pleurica

  1. Preparare cellule bersaglio che esprimono luciferasi e sospendere 1,0 × 106 cellule bersaglio in 100 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)
    NOTA: le cellule tumorali intratoraciche come il cancro del polmone e il MPM sono adatte come cellule bersaglio. Le cellule che esprimono luciferasi sono state preparate tramite la trasfezione del gene luciferasi e l'alta espressione della luciferasi è stata confermata dopo > passaggi cellulari 10. Le cellule sono state coltivate in un mezzo integrato con siero bovino fetale al 10% e penicillina (100 UI / mL) e streptomicina (100 mg / mL). Il numero di cellule è stato regolato in base al tasso di crescita del tumore e al corso temporale del trattamento (1,0. × 105-6,0 × 106 cellule / peso corporeo).
  2. Preparare topi nudi atimici omozigoti femmina di 8-12 settimane, con un peso corporeo preferibile di 19-21 g.
  3. Anestetizzare i topi durante la procedura con isoflurano (introduzione: 4-5%, mantenimento 2-3%); premere la coda con una pinzetta per confermare che non vi è alcuna reazione.
  4. Fare un tappo con polistirene espanso e fissare il tappo all'ago da 30 G in modo che la punta rimanga a 5 mm per prevenire lesioni polmonari. Piegare la punta dell'ago con una pinna pulita o premendola contro un oggetto duro pulito con etOH al 70% per evitare lo pneumotorace (Figura 1).
    ATTENZIONE: Fare attenzione a non trafiggersi. Utilizzare una pincivola per piegare l'ago. Non tenere il tappo quando lo si attacca all'ago. È più sicuro attaccare il tappo prima di riempire le cellule nella siringa.
  5. Riempire una siringa (1 mL) con cellule bersaglio e collegare un ago da 30 G con un tappo.
  6. Disinfettare il torace dell'animale con il 70% di EtOH prima della procedura.
  7. Perforare un ago nel petto del topo attraverso lo spazio intercostale. A causa della resistenza mentre colpiva contro le costole in quel momento, la punta dell'ago si muoveva su e giù. Dopo aver attraversato lo spazio intercostale, premere la siringa contro il mouse e iniettare 100 μL di cellule bersaglio (Figura 2).
    NOTA: Il topo respira profondamente quando l'ago entra correttamente nella cavità toracica. Con la flessione della punta dell'ago, lo pneumotorace e l'iniezione inappropriata di cellule nel polmone potrebbero essere evitati.
    NOTA: Si raccomanda la puntura della parete toracica destra per evitare il rischio di puntura della parete cardiaca.
  8. Rotolare il topo 2-3 volte per diffondere le cellule in tutta la cavità toracica.
  9. Riportare il mouse in una gabbia pulita e calda e monitorare fino ad a deambulatorio. Dopo la procedura, il mouse si sveglierà dall'anestesia e si comporterà normalmente.

3. Misurazione della bioluminescenza

NOTA: Il software utilizzato per l'acquisizione dei dati è elencato nella Tabella dei Materiali.

  1. Per confermare la generazione del modello di disseminazione pleurica, valutare le immagini di bioluminescenza ogni giorno dopo aver iniettato le cellule nella cavità toracica.
  2. Anestetizzare i topi (fase 2.3) e iniettare per via intraperitoneale D-luciferina (15 mg/mL, 200 μL).
  3. Assicurarsi che il mouse stia respirando normalmente prima e dopo l'imaging. Utilizzare un riscaldatore se necessario per prevenire l'ipotermia durante l'anestesia.
  4. Dieci minuti dopo l'iniezione, posizionare il mouse nell'apparecchiatura di misurazione per immagini a bioluminescenza (BLI). Per l'acquisizione di immagini, aprire il Pannello di controllo di acquisizione del software. Selezionare Luminescente, Fotografiae Sovrapposizione (Figura 3).
  5. Impostate il tempo di esposizione come Auto. Imposta Binning come piccolo.
  6. Impostare f/stop come 1 per luminescente e 8 per fotografia; f/stop controlla la quantità di luce ricevuta dal rilevatore di dispositivi ad accoppiamento caricato.
  7. Impostate il campo visivo come C.
  8. Quando il campione del mouse è pronto per l'imaging, fare clic su Acquisisci per l'acquisizione dell'immagine. Topi con sufficiente attività di luciferasi sono stati selezionati per ulteriori studi.
    NOTA: Un modello di disseminazione pleurica adatto mostra una forte luminescenza sul sito diffuso nel torace se visto dal lato ventrale. Se le immagini BLI non sono diffuse nel torace e solo nel sito di iniezione, il tumore può essere trapiantato per via sottocutanea.
  9. Dopo aver visualizzato l'immagine, impostate il formato di visualizzazione su Radianza. Aprite il pannello Tavolozza strumenti (Figura 4A).
  10. Seleziona Strumenti ROI. Si consiglia di utilizzare il cerchio per spaziare l'area bioluminescente sulle immagini.
  11. Fare clic su Misura ROI per misurare l'intensità bioluminescente superficiale (Figura 4B).
  12. Utilizzare Configura misurazione nell'angolo sinistro del pannello di misurazione del ROI per selezionare i valori/le informazioni necessarie. Esportare questa tabella di dati come file .csv (Figura 4C).
  13. Utilizzare i valori di Flusso totale (p/s) come quantificazione dell'intensità bioluminescente nel file .csv.

4. Tomografia per immagini a luminescenza diffusa (DLIT)

NOTA: Il software utilizzato per l'acquisizione dei dati è elencato nella Tabella dei Materiali.

  1. Attivare il pulsante Armato a raggi X.
  2. Anestetizzare i topi (fase 2.3) e quindi iniettare D-luciferina (15 mg / mL, 200 μL) per via intraperitoneale nei topi. Per riprendere DLIT in modo continuo da 3.2 a 3.7, salta questo passaggio.
  3. Dieci minuti dopo l'iniezione, impostare il mouse nell'apparecchiatura BLI.
  4. Aprire il Pannello di controllo di acquisizione del software. Selezionare Luminescente, Fotografia, CT, Mouse Standard-Onee Sovrapposizione. Altre impostazioni erano le stesse di 3.4-3.6 (Figura 5A).
  5. Selezionare l'Imaging Wizard nel Pannello di controllo acquisizione.
  6. Selezionare Bioluminescenza e quindi DLIT (Figura 5B).
  7. Selezionare Firefly come lunghezza d'onda da misurare (Figura 5C).
  8. Impostare il soggetto di imaging come mouse,i parametri di esposizione come impostazioni automatiche,il campo visivo come C-13,4 cme l'altezza del soggetto come 1,5 cm (Figura 5D).
  9. Spingere i raggi X saranno prodotti quando energizzati. Acquisisci.
  10. Aprire i dati dell'immagine sequenziale CT.
  11. Apri Topografia superficie (Surface Topography) nella tavolozza degli strumenti. Selezionare Mostra (Figura 6A).
  12. Regolare la soglia in quanto il display viola mostra solo la superficie del corpo (Figura 6B). Quindi, selezionate il mouse nudo soggetto e fate clic su Genera superficie. Assicurarsi che il contorno del mouse sia disegnato con precisione (Figura 6C).
  13. Aprire la tavolozza degli strumenti, scheda Proprietà ricostruzione 3D DLIT. Selezionare Proprietà tessuto come tessuto del mouse e Spettro sorgente come lucciola (Figura 6D). Quindi, aprire la scheda Analizza e confermare i dati per ogni dato di lunghezza d'onda selezionato. Infine, fare clic sul pulsante Ricostruisci (Figura 6E).
  14. Confermare la presenza di BLI nella cavità toracica nell'immagine DLIT configurata.

5. NIR-PIT per il modello di disseminazione pleurica in vivo

  1. Misurare la dose di luce del laser a lunghezza d'onda 690 nm (NIR) con un misuratore di potenza e regolare l'uscita a 100 mW/ cm2.
    NOTA: la luce laser è coerente con una dimensione precisa della bobina; pertanto, l'energia luminosa cambia a malapena indipendentemente dalla distanza entro 50 cm. Se ci sono molti eventi avversi, come ustioni, ridurre la potenza entro l'intervallo di 40 mW / cm2.
  2. Pulire la coda con etOH al 70% e iniettare per via endovenosa APC (100 μg) attraverso la vena della coda 24 ore prima dell'irradiazione NIR. Applicare pressione sul sito di iniezione per controllare il sanguinamento.
    NOTA: Regolare il volume di APC a 50-200 μL per iniezione.
  3. Anestetizzare i topi (passaggio 2.3) e posarli sulla schiena. Per evitare l'irradiazione NIR al sito non bersaglio, schermare altri siti con un foglio di alluminio (Figura 7A). Irradiare con luce NIR con un laser di 100 J/cm2; se il tumore viene disseminato di nuovo alla pancia, la dose di irradiazione della luce NIR potrebbe essere divisa in più direzioni (Figura 7B).
    NOTA: Aggiustare la dose a 30-150 J/cm2 a seconda dei risultati in vitro e degli eventi avversi come ustioni.
  4. Quando l'irradiazione NIR è completa e il topo è sveglio, restituirlo alla gabbia.
  5. Osservare il BLI e misurare il ROI nel tempo (ogni giorno) (Vedi 3.2-3.12).
  6. Per l'imaging ex vivo, eutanasizzare topi con anidride carbonica 24 ore dopo l'iniezione apc, immediatamente prima dell'irradiazione NIR.
    1. Per osservare l'interno del torace del topo, rimuovere il torace e tagliare le costole e lo sterno. Cattura l'immagine di fluorescenza (700 nm) insieme al controllo senza somministrazione APC. Quindi, applicare D-luciferina (150 μg / mL) sul torace esposto e il BLI è stato preso (fare riferimento 3.2-3.7).

Risultati

L'anticorpo anti-podoplanina NZ-1 è stato coniugato con IR700 per generare NZ-1-IR700. Abbiamo confermato il legame di NZ-1 e IR700 su una SDS-PAGE (Figura 8). L'H2373 che esprime la luciferasi (H2373-luc) è stato preparato trasfezionando cellule maligne di mesotelioma (H2373) con un gene della luciferasi10.

Abbiamo anestetizzato topi nudi omozigoti femmina di 8-12 settimane e iniettato 1 × 105 cellule H2373-luc nella cavità ...

Discussione

In questo studio, abbiamo dimostrato un metodo per misurare l'effetto terapeutico di NIR-PIT sul modello di disseminazione pleurica del MPM. L'uccisione cellulare altamente selettiva è stata eseguita con NIR-PIT; quindi, il tessuto normale è stato appena danneggiato23,24,25. Con questo tipo di uccisione selettiva delle cellule, NIR-PIT ha dimostrato di essere sicuro nei modelli disseminati

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Nessuno

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na Solution with Phenol RedWako209-016941for cell culture
1mL syringeTERUMOSS-01Tfor mice experiment
30G needleNipro1907613for mice experiment
BALB/cSlc-nu/nuJapan SLC
Collidal Blue Staining KitInvitrogenLC6025use for gel protein staining
Coomassie (bradford) Plus protein assayThermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)PI-23200for measuring the APC concentration
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Wako043-07216use for conjugation of IR700
D-Luciferin (potassium salt)Cayman Chemical14681for bioluminescence imaging and DLIT
GraphPad Prism7GraphPad softwarefor statistical analysis
Image StudioLi-Cor Biosciencesfor analyzing 700 nm fluorescent image
IRDye 700DX Ester Infrared DyeLI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)929-70011
isofluraneWako095-06573for mice anesthesia
IVIS Spectrum CTPerkinElmerfor capturing bioluminescent image and DLIT
Living ImagePerkinElmerfor analyzing bioluminescent image and DLIT
Na2HPO4SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)S9763use for conjugation of IR700
NIR LaserChangchun New Industries Optoelectronics TechnologyMRL-III-690Rfor NIR irradiation
Novex WedgeWell 4 to 20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 wellInvitrogenXP04202BOXuse for SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (x4)InvitrogenNP0007use for SDS-PAGE
Optical power meterThorlabs (Newton, NJ, USA)PM100for measuring the output of the NIR laser 
PBS(-)Wako166-23555
Pearl Trilogy imaging systemLi-Cor Biosciencesfor capturing 700 nm fluorecent image
Penicilin-Streptomycin Solution (x100)Wako168-23191for cell culture
Puromycin DihydrochlorideThermoFisherA1113803for luciferase transfection
RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral PrticlesPerkinElmerCLS960002for luciferase transfection
RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol RedWako189-02025for cell culture
Sephadex G25 column (PD-10) GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)17-0851-01use for conjugation of IR700
UV-1900iShimadzufor measuring the APC concentration

Riferimenti

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