Ensayos de la enfermedad de ladrido de raíz seca en el garbanzo: una metodología detallada

Resumen

Este estudio presenta metodologías para estudiar los mecanismos patomorfoológicos y moleculares subyacentes a la interacción entre garbanzo yrizoctonia bataticola. El método del papel hinchado es útil para estudiar rápidamente las respuestas del genotipo del garbanzo, mientras que el método de la olla enferma se puede utilizar para imponer simultáneamente la sequía y la infección por R. bataticola y la pantalla tolerante a los genotipos.

Resumen

La enfermedad de la putrefacción de la raíz seca (DRR) es una amenaza emergente de estrés biótico para el cultivo de garbanzos en todo el mundo. Es causada por un patógeno fúngico transmitido por el suelo, Rhizoctonia bataticola. En la literatura, los protocolos paso a paso completos y detallados sobre los ensayos de enfermedades son escasos. Este artículo proporciona detalles completos sobre los pasos involucrados en la configuración de una técnica de papel hinchado para la detección rápida de genotipos para la resistencia a la RR. La técnica del papel hinchado es fácil y menos costosa. Otro método, basado en el enfoque de la olla enferma, es una imitación de la infección natural y se puede aplicar para estudiar los componentes que interactúan (planta, patógeno y medio ambiente) involucrados en el triángulo de la enfermedad.

Además, en la naturaleza, la RR se produce principalmente en las zonas de cultivo de garbanzos de secano, donde la humedad del suelo retrocede a medida que avanza el crecimiento de los cultivos. Se sabe que el estrés por sequía predispone a las plantas de garbanzos a la enfermedad de la RR. La comprensión patomorfológica y molecular de la interacción entre plantas y patógenos bajo estrés por sequía puede allanar el camino para la identificación de variedades élite resistentes a la RR desde la reserva de germoplasma de garbanzos. Este artículo proporciona una metodología escalonada para la preparación de una olla enferma y el posterior ensayo de la enfermedad. En general, la información presentada en este documento ayudará a los investigadores a preparar el inóculo fúngico R. bataticola, mantener este patógeno, establecer la técnica de papel de hinchazón, preparar el cultivo enfermo y la olla enferma, y evaluar la infección por patógenos en plantas de garbanzos.

Introducción

La podredumbre de la raíz seca (DRR) es una de las enfermedades económicamente significativas en el garbanzo^1,2. Es una enfermedad específica de la raíz causada por Rhizoctonia bataticola (teleomorfo, Macrofomina phaseolina). Las plantas infectadas carecen de raíces laterales y poseen raíces quebradizas y follaje amarillo^1,3. Se ha informado que el estrés por DRR bajo sequía es una amenaza emergente para el cultivo de garbanzos^1,2,3. Además, se ha informado que la incidencia de la RR se ha agravado en condiciones de sequía en condiciones de campo^1,2,3. DrR es más frecuente en las zonas de secano que en los campos de regadío⁴. La utilización de variedades resistentes es la manera de superar la enfermedad y eludir el uso de^{fungicidas 1,13}. Debido a que el germoplasma de garbanzos disponible en todo el mundo alberga una variación genética para el rasgo^5,el cribado e identificación de genotipos resistentes/susceptibles son críticos para la cría molecular para la mejora de los cultivos.

Los ensayos de enfermedades robustos, fáciles y rentables son esenciales para investigar los patrones de infección por R. bataticola en el garbanzo. El ensayo de enfermedad primaria utilizado para observar la respuesta de los genotipos de garbanzos a la infección por R. bataticola es la técnica de papel hinchado^1,4. Es una técnica simple y se puede ejecutar utilizando inóculo de hongos líquidos, plántulas con raíces y papel de hinchazón estéril. Sin embargo, esta técnica no se ha utilizado al máximo porque no hay ningún protocolo paso a paso disponible en la literatura.

Mientras tanto, la técnica de la olla enferma implica la preparación de un posible cultivo enfermo y la imposición de estrés por sequía. Dado que el estrés por sequía agrava la incidencia de la enfermedad de la RR³, es esencial estudiar la interacción planta-patógeno bajo estrés por sequía^6,7. La técnica de la olla enferma proporciona la plataforma para un estudio simultáneo, promoviendo mejores posibilidades para el cribado del germoplasma y la comprensión de la base mecanicista de la interacción. Los cambios patomorfológicos, como el aumento de la longitud de la raíz y la reducción del número de raíz lateral, inherentes a la enfermedad de RR, se pueden abordar utilizando la técnica de la maceta enferma^1,3,7.

En este documento, se presenta un protocolo detallado para el papel hinchado y las técnicas de maceta enferma, que se puede utilizar para estudiar la interacción entre el garbanzo y R. bataticola y el germoplasma de garbanzos de pantalla. Los detalles de los materiales utilizados en el estudio se indican en la Tabla de materiales.

Protocolo

1. Aislamiento de R. bataticola y almacenamiento

1. Detalles del genotipo de garbanzos y los síntomas de la RR
   1. Utilice plantas de garbanzos (genotipo, JG 62) que generalmente muestran síntomas típicos de DRR, como raíz primaria seca y quebradiza sin raíces laterales y microesclerotia debajo de la corteza y dentro de la pith^1,3.
2. Recogida y lavado
   1. Desarraiga las plantas que muestran síntomas como raíz primaria foliar de color paja seca y raíz primaria quebradiza con microsclerotia bajo la capa de epidermis. Durante el desarraigo, una parte importante de las raíces permanecerá dentro del suelo ya que las raíces infectadas son frágiles. Retire los restos de tierra gruesos unidos a la raíz. Cortar las raíces por separado y recogerlas en sobres de papel (27,5 cm x 12 cm) con la etiqueta adecuada y colocarlas en una caja de recogida de muestras.
   2. Después de transportar muestras al laboratorio, coloque las raíces en un vaso de precipitados de 200 ml y cúbralas con malla (malla de nylon con el tamaño de poro de 3 mm de diámetro), y lave bien las raíces con agua corriente del grifo para eliminar las partículas de suelo adherentes.
   3. Use agua de ósmosis inversa (RO) para enjuagar una vez al final.
3. Esterilización superficial
   1. Romper las raíces en cuatro trozos con 2 cm de longitud cada una con una cuchilla de bisturí y ponerlas en un vaso limpio de 200 ml.
   2. Montar agua RO autoclavada, 2% NaOCl, tarro de descarte y papel de hinchazón autoclavado (5 cm²) dentro de la cámara de flujo laminar.
   3. Lavar las raíces con 50 ml de agua RO autoclaveda tres veces y luego con 50 mL de 2% NaOCl durante 10 min. Lavar las raíces con 50 ml de agua RO tres veces más para eliminar el NaOCl.
   4. Blot secar las raíces colocando las raíces en papel hinchado autoclavado y dejar hasta que las raíces se sequen.
4. Medios de comunicación e incubación
   1. Retire los bordes de las raíces con una hoja de bisturí esterilizada. Divida las raíces con la cuchilla y utilice los fórceps esterilizados para colocarlas en un agar dextrosa de patata (PDA) media petri placa que contiene sulfato de estreptomicina (50 mg L^-1) y ampicilina (50 mg L^-1).
   2. Cierre la placa, selle con parafilma e incubar en una incubadora a 28oC durante dos días en la oscuridad.
5. Método de punta hyphal
   1. Después de dos días de incubación, lleve las placas a la cámara de flujo laminar. Corte la punta del crecimiento hiphal⁸ bajo un estereomicroscopio (estereomicroscopio educativo Leica EZ4) y transfiéralo a una placa PDA fresca con sulfato de estreptomicina y ampicilina.
   2. Incubar las placas en la incubadora a 28oC durante diez días en la oscuridad.
6. Almacenamiento y mantenimiento del inóculo fúngico R. bataticola
   1. Haga inclinaciones PDA en tubos de ensayo y transfiera un tapón de agar fúngico desde una placa de cultivo de diez días de edad utilizando el bucle de inoculación esterilizado por llama. Selle la tapa del tubo de ensayo con parafilm.
   2. Incubar las inclinaciones a 28oC durante diez días en la oscuridad.
   3. Selle la tapa con parafilm y guárdela a 4oC en el frigorífico para su uso futuro.
   4. Subcultura cada seis meses para mantener el hongo.
7. Mantenimiento de la virulencia
   1. Infectar las plantas con puro inóculo fúngico preparado como se menciona en la técnica de la olla enferma³. Aislar el mismo hongo de las plantas infectadas (posttes de Koch)⁹ y utilizarlo para otros experimentos.
      NOTA: En este estudio, se utilizó una cepa aislada de campo del hongo (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)

2. Técnica de papel de hinchazón

NOTA: La técnica del papel hinchado implica la preparación de inóculo de hongos líquidos, preparación de plántulas y evaluación de enfermedades.

1. Preparación del líquido R. bataticola inoculum
   NOTA: El inóculo fúngico líquido R. bataticola contiene micelia y microsclerotia. Ambas estructuras actúan como inóculo primario.
   1. Preparar 500 ml de medios PDB en un matraz de 1.000 ml y autoclavelo a 121 lb durante 15 min.
   2. Después de que el medio se enfríe, inocular el caldo con un bucle lleno de tapón de agar fúngico de un cultivo de inclinación fúngica e incubar a 28 oC durante cinco días en una coctelera a 180 rpm en la oscuridad.
   3. Montar un embudo de vidrio autoclaved o plástico (10 cm), matraz cónico de un litro y dos capas de malla (10 cm² tamaño) (malla de nylon con el tamaño de los poros de 3 mm de diámetro) en la mesa. Filtra los micelios y microesclerotias fúngicas usando la malla. Seque el hongo en papel hinchado autoclavado.
   4. Pesar 100 g de micelio para 50% de inóculo y mantener a temperatura ambiente.
2. Preparación de la planta de garbanzos
   1. Seleccione 50 semillas sanas (en este estudio, se utilizó el genotipo JG 62 susceptible de DRR), colóquelas en un vaso de precipitados de 100 ml y cúbralas con una malla.
   2. Lave primero las semillas con agua del grifo para eliminar los restos del suelo.
   3. Tome el vaso de precipitados con semillas en la cámara de flujo laminar y lávelas con 50 ml esterilizadas de agua RO tres veces durante 1 min por lavado.
   4. Esterilice las semillas con 50 ml de 2% de NaOCl acuoso durante 2 min con agitación continua y lave las semillas con 50 ml de agua esterilizada cinco veces durante 1 min cada una.
   5. Llenar una bolsa de polietileno (47,5 cm x 25 cm) con Soilrite (una mezcla de perlita expandida de grado hortícola, musgo de turba irlandesa y vermiculita exfoliada en igual proporción, es decir, 1/3:1/3:1/3), sembrar las 50 semillas esterilizadas en superficie de dos cm de profundidad, y mantener en una cámara/habitación de crecimiento con 28 oC ± temperatura de 2oC, fotoperiodo de 16 h con una intensidad de luz de 150 m^{a 2} s a¹s y humedad relativa del 70%. Regarlos con agua RO y arrancar las plantas ocho días después de la siembra.
   6. Lave las raíces en el agua del grifo para eliminar las partículas de Soilrite. Enjuague las raíces con agua RO esterilizada y guárdalas en el agua RO en un vaso de precipitados de 1000 ml.
3. Preparación de papel hinchado en bandejas
   1. Tome un papel hinchado y córtelo en trozos (30 cm × 23 cm) en números suficientes para cumplir con las réplicas.
   2. Empaque las hojas en una bolsa de polietileno autoclaveable y autoclavelas a 121 libras durante 15 minutos y guárdalas en un horno de aire caliente para secarlo.
   3. Doble cada hoja de papel hinchada por la mitad.
   4. Coloque el papel sobre una bandeja de plástico limpia y limpia, como se muestra en la Figura 2i-iv.
4. Inoculación de plantas por inmersión
   1. Disolver 100 g de inóculo fúngico en agua RO autoclaveada de 200 ml en un vaso de precipitados de 200 ml para obtener un 50% de inóculo.
   2. Sumerja las raíces de la planta en el inóculo preparado durante 1 min con movimiento intermitente hacia arriba y hacia abajo para asegurar la fijación uniforme del inóculo fúngico.
5. Colocar las plantas en el papel hinchado
   1. Humedezca el lado inferior del papel de hinchazón colocado en la bandeja con agua RO estéril. Coloque las plantas en el papel de una manera donde sólo las raíces están cubiertas por el papel, y las tomas se dejan fuera.
   2. Ciérralo doblando la parte superior del papel hinchado y moje todo el papel para proporcionar suficiente agua para sostener el crecimiento de la planta.
   3. Regar la bandeja una vez al día y mantener las bandejas a 28 oC. Observe los síntomas como necrosis, pudrición de la raíz y amarilleo de las hojas diariamente.

3. Técnica de la olla enferma

NOTA: La técnica de la olla enferma implica la preparación de un inóculo virulento y una maceta enferma, el mantenimiento del nivel de humedad y la evaluación de los síntomas de la enfermedad.

1. Preparación del sustrato
   1. Tome un kg de cualquier semilla de garbanzo disponible comercialmente. Retire las semillas infectadas (semillas con crecimiento de hongos, manchas de infección y daños por insectos). Colóquelos en vaso de plástico de 5 L y lávelos con agua del grifo a fondo de 3 a 4 veces para eliminar los desechos principales.
   2. Lavar las semillas con 2 L de agua RO tres veces y remojar las semillas de 1 kg en un vaso de precipitados de 5 L con tres veces más de agua durante cinco h.
   3. Una vez que las semillas absorben el agua, vuelva a lavarlas con agua RO tres veces para eliminar los exudados de la semilla.
   4. Retire el agua por completo y empaque las semillas en botellas de mermelada (300 ml, 12 cm de altura, 6 cm de diámetro y 155 g de peso) a aproximadamente 1/4^de capacidad (100 g por botella de mermelada) y cierre las botellas con tapas. Empaque diez botellas de mermelada en una bolsa de plástico autoclavable (48 cm x 30 cm) autoclave dos veces a 121 libras durante 15 minutos continuamente.
   5. Secar las semillas a 40oC en un horno durante la noche para eliminar las gotas de agua dentro de la botella.
2. Preparación de la cultura enferma
   1. Encienda la cámara de flujo laminar de nivel BSL-2. Limpie bien el suelo con 70% de etanol y encienda UV durante 15 minutos. A continuación, mantenga las semillas dentro de la cámara de flujo laminar.
   2. Tomar 10 días de edad recién aislado cultivo de R. bataticola (parte 1). Luego, tome tres tapones de agar fúngico (4 mm de diámetro) usando una punta de pipeta estéril o un barrenador de corcho, y colóquelos en botellas de mermelada asépticamente. Cubra las botellas con tapas y selle con parafilm.
   3. Agitar las botellas para mezclar el disco de hongos con las semillas de garbanzo uniformemente.
   4. Incubar las botellas a 30oC durante 15 días o la oscuridad.
   5. Tome botellas de mermelada con crecimiento de hongos negros(Figura 4iii)y transfiera el cultivo enfermo (semillas con microsclerotia) de botellas de mermelada a una placa petri de vidrio utilizando fórceps estériles. Secarlos a temperatura ambiente durante dos días en una placa de petri de vidrio.
   6. Polvo de la masa fúngica utilizando un mortero y pestillo, y almacenar el polvo a 4 oC.
   7. Autoclave Soilrite dos veces a 121 lbs durante 15 min.
   8. Seque la mezcla de Soilrite autoclaved bajo una sombrilla.
   9. Mezclar el polvo de hongos con Soilrite al 50% p/p, llenar las ollas con la mezcla y mantenerlas a temperatura ambiente durante un día.
   10. Sembrar una semilla de garbanzo susceptible de DRR esterilizada por superficie (macetas redondas de 10 cm)(Tabla de Materiales)y mantener un nivel de humedad del 80% de capacidad de campo (FC).
   11. Observe los síntomas como necrosis y pudrición de la raíz desarraigando las plantas después de la germinación.
3. Evaluación de la eficiencia de la maceta enferma
   NOTA: Las plantas muestran síntomas foliares amarillos cuando las raíces están completamente podridas.
   1. Desarrollar una puntuación de la enfermedad basada en los números de la lesión (manchas necróticas)(Figura suplementaria 2C)y la gravedad de la podredumbre de la raíz. Las macetas enfermas que muestran el 90% de la muerte de las plantas se pueden utilizar más.
4. Examen de genotipos
   1. Preparar el cultivo enfermo en grandes cantidades y mezclarlo con Soilrite esterilizado o suelo de campo (5% p/p) en macetas de 30 cm de altura. Regar las ollas para humedecer la superficie y dejarlas intactas durante siete días.
   2. Sembrar una semilla esterilizada en superficie por maceta redonda de 10 cm y tres semillas por macetas redondas de 30 cm y regarlas adecuadamente.
   3. Observe los síntomas de pudrición foliar amarilla y de la raíz.
5. Sequía combinada e infección por R. bataticola
   1. Imponer estrés por sequía siguiendo los protocolos mencionados en Sinha et al. (2019).

Resultados

Este estudio tenía como objetivo demostrar técnicas como el papel hinchado y las técnicas de la olla enferma para facilitar la comprensión patomorfológica y molecular de la interacción entre plantas y patógenos bajo estrés por sequía. Para lograr esto, las plantas que presentan síntomas de DRR^1,3,4 fueron recogidos de un campo de garbanzos, y el hongo fue aislado utilizando el método de punta hipórica

Discusión

La técnica del papel hinchado proporciona un enfoque sencillo para examinar los genotipos de garbanzos en condiciones de laboratorio. La inoculación por inmersión permite la investigación de la interacción de forma temporal con un fácil control sobre la carga de inóculo(Figura complementaria 1) y facilita el cribado in vitro. Además, incluso se pueden utilizar plántulas jóvenes. El cultivo de hongos de cinco días de edad (Figura 1B) puede producir suficiente inóc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungus- Rhizoctonia bataticola	Pathogen inoculum	Indian Type Culture Collection No. 8365	GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370)
Soilrite mix	Soil medium in the lab	Keltech Energies Limited, Bangalore, India	http://www.keltechenergies.com/
Filter paper	Blotting paper to support the plant growth	Himedia	http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
Pot	Growing plants	10 and 30 cm size pots	Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html
Potato dextrose agar/broth	Culture and maintain the fungus	Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
Incubator	Culture the fungus	LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker	http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131
Growth chamber	Growing plants in controlled condition	Model No. A1000, Conviron, Canada	https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
Laminar airflow	Carrying out aseptic exercises	Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000	https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
Mesh	Filtering the fungal mycelia	Nylon mosquito net	Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size
Autoclave	Autoclaving media and chickpea seeds	Autoclave	http://www.scientificsystems.in/autoclave
Microscopes	Visualizing the infection ang fungal mycelia	SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope	https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
Weighing balance	Weighing fungus and chemicals	Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW	https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC	Fungus staining	Sigma	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN
Aniline blue	Fungus staining	Himedia	http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901