نموذج انسداد القصبة الهوائية الجنينية عبر الرحم في الفئران

Summary

نماذج حيوانية مختلفة من الفتق الحجابي الخلقي والانسداد القصبي الجنيني تقدم مزايا وعيوب فيما يتعلق بالقضايا الأخلاقية والتكلفة والصعوبة الجراحية والحجم ومعدلات البقاء على قيد الحياة وتوافر الأدوات الوراثية. يوفر هذا النموذج أداة جديدة لدراسة تأثير كل من انسداد القصبة الهوائية وزيادة الضغط الإنارة على نمو الرئة.

Abstract

الانسداد القصبي الجنيني (TO)، وهو طريقة علاج راسخة، يعزز نمو الرئة الجنينية والبقاء على قيد الحياة في الفتق الحجابي الخلقي الحاد (CDH). بعد TO، الاحتفاظ بالسوائل الظهارية المفرزة يزيد من الضغط الإنعباسي ويحفز نمو الرئة. وقد تم تعريف نماذج حيوانية مختلفة لفهم الفيزيولوجيا المرضية للCDH و TO. ولكل منها مزاياها وعيوبها الخاصة مثل صعوبة هذه التقنية، وحجم الحيوان، والتكلفة، وارتفاع معدلات الوفيات، وتوافر الأدوات الوراثية. هنا، يتم وصف نموذج عبر الرحم رواية من مورين الجنين TO. تم تخدير الفئران الحامل، وتعرض الرحم عن طريق استئصال البطن في منتصف الخط. تم ربط القصبة الهوائية للأجنة المختارة بخياطة واحدة عبر الرحم وضعت خلف القصبة الهوائية ، وشريان السباتي واحد ، وعروق وداجي واحد. وأغلق السد وسمح له بالتعافي. تم جمع الأجنة قبل الالتهام مباشرة. كانت نسبة وزن الرئة إلى الجسم في الأجنة إلى الأجنة أعلى من تلك الموجودة في الأجنة المسيطرة. يوفر هذا النموذج للباحثين أداة جديدة لدراسة تأثير كل من TO وزيادة الضغط الإنارة على نمو الرئة.

Introduction

يحدث الفتق الحجابي الخلقي (CDH) في 1:2500 حالة حمل وينتج عنه نقص التنسج الرئوي وارتفاع ضغط الدم الرئوي الوليدي^{1و2و3و4و5و6.} انسداد القصبة الهوائية الجنيني (TO) هو علاج سابق للولادة في مرضى CDH الشديدين الذين يشملون تنظير الجنين في الأسبوع الحملي 26-30 الذي يتم فيه وضع بالون فوق كارينا مباشرة ثم إزالته في الأسبوع الحملي^{الثاني والثلاثين.} هذا مؤقت للحث على نمو الرئة الجنين ويحسن البقاء على قيد الحياة. متلازمة انسداد مجرى الهواء العالي الخلقية هي حالة قاتلة مرتبطة بتضخم الرئة ، والتي ألهمت الجراحين لإجراء انسداد اصطناعي للرغامى لتعزيز الاحتفاظ بالسوائل الظهارية المفرزة. هذا الانسداد زيادة الضغط الإنارة ونمو الرئة المستحث⁷. ومع ذلك ، ينبغي عكس انسداد لتمكين نضوج الخلايا الظهارية.

وقد وضعت نماذج حيوانية مختلفة من CDH و TO - ovine، أرنب، الجرذ، والفأر - لفهم الفيزيولوجيا المرضية من CDH و TO. ولكل منها مزاياها وعيوبها الخاصة مثل صعوبة هذه التقنية، وحجم الحيوان، والتكلفة، وارتفاع معدلات الوفيات، وتوافر الأدوات الوراثية. على الرغم من أن التقنية الجراحية المستخدمة لنموذج ovine تشبه إلى حد كبير تلك المستخدمة في البشر ويمكن عكسها ، فإن العيوب الرئيسية لهذا النموذج هي حساب الحيوان ، وفترة الحمل الطويلة ، والعدد المحدود من العمليات الجراحية الممكنة. نموذج الأرنب لديه فترة حمل أقصر وأقل تكلفة من نموذج الأغنام. ومع ذلك ، فإن نموذج الأرنب لا رجعة فيه^8،9. نموذج مورين لديه أقل تكلفة، أكبر عدد من الأجنة لكل حمل، الجينوم الأكثر اتصفا، والأدوات المتاحة على نطاق واسع للتحليلات الخلوية والجزيئية. ومع ذلك، فإن العيب الرئيسي هو عدم إمكانية عكس TO، مما يمنع الفهم الكامل لتأثير TO. هنا ، يتم تقديم طريقة تجمع بين جميع مزايا النماذج المذكورة سابقا وتخلق نموذجا سهلا ، يمكن عكسه ، والحد الأدنى من غزو القوارض.

Protocol

وقد امتثلت جميع التجارب لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبرات (منشورات المعاهد القومية للصحة رقم 80023، المنقحة لعام 1978). تمت الموافقة على الإجراء مع بروتوكول IACUC #2016-0068 من قبل مؤسسة سينسيناتي لأبحاث الأطفال اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها.

1. إعداد

1. لتزاوج الفئران البرية المتطابقة مع العمر C57BL/6 ، ضعها في نفس القفص في الساعة 6:00 مساء .m وفصلها في الساعة 9:00 صباحا .m في اليوم التالي.
2. لتحديد اليوم الجنيني 0 (E0)، انظر إلى المكونات المهبلية، التي تحتوي على منطقة خارجية متجانسة متصلة بجدار المهبل ومنطقة داخلية ليفية وتشمل بعض الحيوانات المنوية التي تشكل كتلا متشابكة مختلطة مع ألياف المواد المكونات.
3. سجل وزن الفئران في وقت التزاوج.
4. إعادة وزن الفئران على E10 لضمان الحمل المستمر.
5. إجراء الجراحة على E16.5 (المرحلة القناة المبكرة).
6. تعقيم الأدوات التي سيتم استخدامها أثناء الجراحة: مقص، حامل إبرة، ملقط، المشابك، والسكاكين الجراحية ومقابض.
7. قبل تسخين منصة الجراحة إلى 24 درجة مئوية وإعداد المالحة الدافئة (24 درجة مئوية) قبل الجراحة.
8. خلق بيئة دافئة للتعافي، وترك الطعام الرطب داخل القفص للتغذية المبكرة.
9. البقاء مع الحيوانات التي تعمل حتى يتمكنوا من إطعام أنفسهم.
10. الحفاظ على الفئران التي تعمل وحدها في أقفاص الفردية بعد الجراحة.

2. التخدير

1. تطبيق تحت الجلد 0.1 ملغ / كغ من البوبرينورفين إلى السدود الحوامل 1 ساعة قبل الإجراء.
2. استخدام استنشاق 5 مل / ساعة من ايزوفلوران للتحريض و 2 مل / ساعة بشكل مستمر خلال عملية التخدير.
3. مراقبة تحركات ذقن الفئران الحامل.

3. استئصال البطن

1. تنظيف سطح البطن مع الكحول واليود بوفيدوني. الحفاظ على الظروف العقيمة طوال العملية.
2. إجراء شق عمودي لاستئصال البطن من السدود الحوامل. قطع جميع الطبقات بشكل منفصل.
3. تحديد قرون الرحم على كل جانب.
4. تحديد الأجنة المرشحة للجراحة.
   ملاحظة: لا تعمل على الأجنة الأقرب إلى المهبل.
5. تعمل على جنينين في كل قرن الرحم إذا كان هناك عدد زوجي من الأجنة على كل جانب (4 معظم الوقت)، وعلى 1 الجنين في كل قرن الرحم إذا كان هناك عدد فردي من الرحم (3 معظم الوقت).

4. انسداد القصبة الهوائية

1. استخدام نظارات التكبير 2.5x للتصور.
2. وضع القرن الرحم بطريقة عرضية.
3. تأخذ الجراء، التي تواجه صعودا، بين إصبعين باستخدام عيون الجراء والذيل كدليل لوضع الجنين.
4. تطبيق ضغط لطيف على رأس الجرو للسماح تمديد الرأس، وبالتالي، تصور الرقبة.
5. استخدام خياطة البولي بروبلين 6.0 مع إبرة atraumatic لأداء TO (الشكل 1). إبقاء المشيمة على الجانب وبعيدا عن نقاط الدخول والخروج من الإبرة.
6. أدخل الإبرة بشكل عرضي عبر جانب الرحم بعيدا عن المشيمة عبر الجزء^{الأمامي} من الرقبة.
7. تحريك الإبرة بلطف حتى خط الوسط من الرقبة وتوجيهها إلى الجزء الأمامي، ثم الخروج من الرقبة بين القصبة الهوائية ومقابل غمد السباتي والرحم.
8. عقدة خياطة، مع الحرص على الحفاظ على سلامة الأغشية وجدار الرحم، والحفاظ على الحبل السري آمنة أثناء عقدة.

الشكل 1: انسداد القصبة الهوائية. (أ) خياطة عبر الرحم تمر عبر الرقبة. (ب)التمثيل التخطيطي للهياكل بعد خياطة يمر عبر وقبل عقدة. المختصرات: C = الشريان السباتي. J = الوريد الوداجي; T = القصبة الهوائية; E = المريء; V = فقرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. إغلاق جدار البطن

1. استبدل قرن الرحم في البطن.
2. حقن 2 مل من المالحة المعقمة الدافئة في تجويف الصفاق قبل الإغلاق.
3. وضع خياطة البوليجلاتين قيد التشغيل 5/0 لإغلاق جدار البطن، وإغلاق الجلد مع خياطة الحرير غير الجارية.
4. تطبيق 0.1 ملغ / كغ من البوبرينورفين intraperitoneally لمسكنات، والسماح لانتعاش السد في حاضنة دافئة.

6. الحصاد

1. تطبيق التخدير على السد الحوامل، وحصاد جميع الأجنة في E18.5 عن طريق القسم القيصري.
2. تحقق من صلاحية الأجنة من خلال مشاهدة تحركات الأجنة.
3. استخدام ما لا يقل عن تقنيتين مختلفتين للقتل الرحيم: الاختناق ثاني أكسيد الكربون وخلع عنق الرحم.
4. إزالة الجثث وفقا لتنظيم المختبر البيطري.
5. وزن جميع الأجنة.
6. إجراء شق عمودي على الصدر لاستئصال الصدر لإزالة الرئتين.
7. تشريح الرئتين من الأجنة، ووزنها لحساب إجمالي نسبة الوزن الرئة إلى الجسم (LBWR = (وزن الرئة اليسرى + وزن الرئة الأيمن)/وزن الجسم x100).

7. الأنسجة

1. المفاجئة تجميد الأنسجة في النيتروجين السائل، والقطع الأمثل مركب درجة الحرارة، والجليد الجاف.
2. قطع العينات في أقسام 10 ميكرومتر باستخدام cryostat، وجبل لهم على الشرائح المغلفة بولي ليسين.
3. خبز الشرائح في 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها، ووصمة عار الشرائح المخبوزة مع hematoxylin وeosin قبل تركيبها للحصول على صورة في التكبير 10-20x باستخدام المجهر واسعة النطاق.

8. معالجة الأنسجة لتحليل البروتين والحمض النووي

1. المفاجئة تجميد الرئتين الجنين تشريح، وتجانس لهم في 300 ميكرولتر من العازلة المقايسة المناعية الإشعاعية. جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق عند 18000 × غرام.
2. استخراج وقياس البروتين والحمض النووي والجيش الملكي النيبالي^10،12.

النتائج

فحصت هذه الدراسة 37 جنينا: 20 (54.1٪) كما TO مقابل 17 (45.9٪) كسيطرة. وبما أنه لا يمكن انسداد القصبة الهوائية في 4 أجنة في مجموعة TO ، فقد تم استبعادها من الدراسة. لم يكن هناك فرق كبير في معدل الوفيات في كلتا المجموعتين: 4 أجنة (25٪) في مجموعة TO و 2 الأجنة (12٪) في مجموعة التحكم (p=0.334، نسبة الا...

Discussion

تصف هذه الطريقة إجراء جراحيا للانسداد القصبي الجنيني في الفئران وتأثيره على نمو الرئة. هناك بعض الخطوات الهامة في البروتوكول التي يجب أن يتم تنفيذها بعناية من أجل TO ناجحة. دفء المنصة التي تجري عليها الجراحة والمحلول الملحي الذي يتم إدخاله إلى تجويف الصفاق أمر بالغ الأهمية لتطور الحمل. بال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine	Par Pharmaceutical	NDC 42023-179-05	For regional anesthesia
Isoflurane	Halocarbon Life Sciences	NDC 66794-017-25	For general anesthesia
Magnification glasses	USA Medical-Surgical	SLR-250LBLK	At least 2.5x
Nikon 90i microscope	Nikon	3417	Motorized Fluorescence
Nucleospin Tissue Kit	Macherey-Nagel, Düren, Germany	740952.5	DNA isolation
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher, IL, USA	23225	Protein quantification
Polyglactin suture	Ethicon	VCP451H	4-0, 24 mm, cutting
Polylysine slides	VWR	48382-117	Microscope adhesion slides
Polypropylene suture	Ethicon	Y432H	6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint
RIPA buffer	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	R0278-50ml	Protein isolation
Silk suture	Ethicon	VCP682G	4-0, 24 mm, cutting
Trizol	Invitrogen	15596026	RNA isolation