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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Viene descritta una metodologia per la determinazione dei requisiti di impollinazione negli ibridi giapponesi di tipo prugna, che combina le impollinazioni sul campo e in laboratorio e le osservazioni dei tubi pollinici sotto la microscopia a fluorescenza con l'identificazione dei genotipi Smediante PCR e il monitoraggio della fioritura per la selezione degli impollinatori.

Abstract

Le cultivar di prugne giapponesi comunemente coltivate sono ibridi interspecifici derivati da incroci tra l'originale Prunus salicina con altre specie di Prunus. La maggior parte degli ibridi presenta un'auto-incompatibilità gametofita, che è controllata da un singolo e altamente polimorfo S-locus che contiene più alleli. La maggior parte degli ibridi coltivati sono auto-incompatibili e hanno bisogno di polline da un donatore compatibile per fertilizzare i loro fiori. Stabilire i requisiti di impollinazione nella prugna giapponese sta diventando sempre più importante a causa dell'elevato numero di nuove cultivar con requisiti di impollinazione sconosciuti. In questo lavoro, viene descritta una metodologia per la determinazione dei requisiti di impollinazione negli ibridi giapponesi di tipo prugna. L'auto(in)compatibilità è determinata dall'impollinazione manuale sia sul campo che in laboratorio, seguita dal monitoraggio dell'allungamento del tubo pollinico con microscopia a fluorescenza e anche dal monitoraggio della maturazione dei frutti sul campo. La selezione delle cultivar impollinatori viene valutata combinando l'identificazione dei genotipi Smediante analisi PCR con il monitoraggio del tempo di fioritura in campo. Conoscere le esigenze di impollinazione delle cultivar facilita la selezione delle cultivar per la progettazione di nuovi frutteti e consente la diagnosi precoce dei problemi di produttività legati alla carenza di impollinazione nei frutteti consolidati.

Introduzione

La prugna giapponese (Prunus salicina Lindl.) è originaria della Cina1. Nel 19 ° secolo, questacoltura è stata introdotta dal Giappone negli Stati Uniti, dove è stata incrociata con altre prugne diploidi nordamericane2. Nel 20° secolo, alcuni di questi ibridi sono stati diffusi nelle regioni temperate di tutto il mondo. Al giorno d'oggi, il termine "prugna giapponese" si riferisce a una vasta gamma di ibridi interspecifici derivati da incroci tra l'originale P. salicina con fino a 15 altri diploidi Prunus spp.3,4,5.

La prugna giapponese, come altre specie della famiglia delle Rosacee, presenta l'auto-incompatibilità gametofita (GSI), che è controllata da un singolo e altamente polimorfo S-locuscontenente più alleli6. Il -locus Scontiene due geni che codificano per una ribonucleasi (S-RNasi) espressa nel pistillo, e una proteina F-box (SFB) espressa nel granello di polline7. Nella reazione di auto-incompatibilità, quando l'allele Sespresso nel granello di polline (aploide) è lo stesso di uno dei due espressi nel pistillo (diploide), la crescita del tubo pollinico attraverso lo stile viene arrestata a causa della degradazione dell'RNA del tubo pollinico da parte dell'azione della S-RNasi8. Poiché questo processo impedisce la fecondazione del gametofito femminile nell'ovulo, GSI promuove l'outcrossing tra cultivar.

Sebbene alcune cultivar di prugne giapponesi siano autocompatibili, la maggior parte delle cultivar attualmente coltivate sono auto-incompatibili e hanno bisogno di polline da donatori intercompatibili per fertilizzare i loro fiori3. Nelle specie di drupacee del genere Prunus come la mandorla9,l'albicocca10,11, 12 e la ciliegiadolce 13,i requisiti di impollinazione delle cultivar possono essere stabiliti da diversi approcci. L'auto-(in)compatibilità può essere determinata dall'autoimpollinazione dei fiori in campo e dal successivo monitoraggio dell'allegagione, o dalle autoimpollinazioni semi-in vivo in condizioni controllate in laboratorio e dall'osservazione di tubi di polline al microscopio14,15,16,17,18 . Le relazioni di incompatibilità tra cultivar possono essere determinate da impollinazioni incrociate in campo o in laboratorio utilizzando polline della cultivar potenziale impollinatrice e dall'identificazione diS-alleli di ciascuna cultivar mediante analisi PCR14,15,16,19,20,21,22 . In specie come la ciliegia dolce o la mandorla, l'auto(in)compatibilità può essere valutata anche mediante l'identificazione di particolari alleli S associati all'autocompatibilità, come S4' nella ciliegia dolce13 o Sf nella mandorla23.

Diversi programmi di allevamento di prugne dei principali paesi produttori stanno rilasciando una serie di nuove cultivar2,14,molte delle quali con requisiti di impollinazione sconosciuti. In questo lavoro, viene descritta una metodologia per la determinazione dei requisiti di impollinazione negli ibridi giapponesi di tipo prugna. L'auto-(in)compatibilità è determinata da autoimpollinazioni sia sul campo che in laboratorio, seguite da osservazioni di tubi di polline sotto la microscopia a fluorescenza. La selezione delle cultivar impollinatori combina l'identificazione dei genotipi Smediante analisi PCR con il monitoraggio del tempo di fioritura in campo.

Protocollo

1. Impollinazione manuale sul campo

  1. Estrazione del polline
    1. Per ottenere il polline, raccogliere i boccioli di fiori allo stadio D24, secondo lo stadio 57 sulla scala BBCH25,26.
      NOTA: Sono necessari più boccioli di fiori nella prugna giapponese che in altre specie di Prunus perché le loro antere producono meno polline.
    2. Rimuovere le antere utilizzando una rete di plastica (dimensioni dei pori 2 mm x 2 mm) e posizionarle su carta a temperatura ambiente per 24 ore fino alla deiscenza dell'anther.
    3. Setacciare i grani di polline attraverso una rete sottile (0,26 mm x 0,26 mm di dimensione dei pori) e conservarli in un tubo di vetro da 10 ml con un tappo a 4 °C fino all'uso.
  2. Impollinazione di fiori evirati
    1. Quando tra il 10% e il 20% dei fiori sono aperti, selezionare ed etichettare diversi rami. Rimuovere i fiori aperti e i giovani boccioli, lasciando solo boccioli di fiori allo stadio D24, secondo lo stadio 57 sulla scala BBCH25,26.
    2. Rimuovere i petali, i sepali e gli stami tra 800 e 1.000 boccioli di fiori per trattamento con unghie o pinzette.
    3. Impollinare a mano i pistilli con l'aiuto di un pennello fine 24 ore dopo l'evirazione. Alcuni rami contengono metà dei pistilli con polline della stessa cultivar e l'altra metà con polline compatibile di altre cultivar come controllo. Fare attenzione a non contaminare la punta delle dita o il pennello con grani di polline di altre cultivar.
    4. Registra i conteggi settimanali di fiori e frutti in via di sviluppo per caratterizzare il modello di goccia di frutta e quantificare l'allegagione finale in ogni trattamento di impollinazione.
  3. Impollinazione supplementare sul campo
    1. Pochi giorni prima dell'apertura dei primi fiori, racchiudere alberi selezionati in una gabbia a rete da 0,8 mm per evitare l'arrivo di insetti impollinatori.
    2. Quando il 10%-20% dei fiori è aperto, selezionare ed etichettare diversi rami per trattamento di impollinazione, lasciando 1.000-1.500 fiori per trattamento.
    3. Il giorno successivo, quando i fiori sono aperti, impollinare ogni fiore con l'aiuto di un pennello con il polline corrispondente (polline della stessa cultivar per l'autoimpollinazione e di altre cultivar compatibili come controllo dell'impollinazione incrociata).
    4. Impollinare a giorni alterni fino a quando tutti i fiori si aprono.
    5. Registra i conteggi settimanali dei fiori e dei frutti in via di sviluppo dall'antesi al raccolto per caratterizzare il modello di goccia di frutta e quantificare l'allegagione finale in ogni trattamento di impollinazione.

2. Impollinazioni manuali in laboratorio

  1. Raccogli 50-100 fiori nella fase D24, secondo la fase 57 sulla scala BBCH25,26.
  2. In laboratorio, evirare 30 fiori per trattamento (auto-impollinazione e cross-impollinazione).
    NOTA: L'evirazione deve essere effettuata con attenzione per evitare danni ai pistilli.
  3. Fai un taglio fresco sulla base di ogni pedicello di fiori sott'acqua prima di metterlo su un pezzo di schiuma da fiorista bagnata (un pezzo di schiuma per ogni trattamento di impollinazione).
  4. Impollinare manualmente ogni pistillo 24 ore dopo utilizzando un pennello fine con polline raccolto in precedenza (vedere paragrafo 1.1). Impollinare un set di pistilli con polline della stessa cultivar e l'altro set con polline di una cultivar compatibile come controllo.
  5. Lasciare i pistilli impollinati 72 ore dopo l'impollinazione a temperatura ambiente. La schiuma floreale deve essere continuamente bagnata con acqua.
  6. Fissare i pistilli in una soluzione fissativa di etanolo/acido acetico (3:1) per almeno 24 ore a 4 °C. Sostituire il fissativo con etanolo al 75%. I campioni possono essere conservati in questa soluzione a 4 °C fino all'uso27.
    NOTA: assicurarsi che i campioni siano completamente immersi nella soluzione.

3. Osservazioni microscopiche

  1. Valutazione della germinazione in vitro del polline
    1. Per elaborare il terreno di germinazione del polline, sciogliere 25 g di saccarosio su 250 ml di acqua distillata, quindi aggiungere 0,075 g di nitrato di calcio [Ca(NO3)2] e 0,075 g di acido borico (H3BO3).
    2. Aggiungere 2 g di agar alla soluzione e mescolare fino a completa dissoluzione28.
    3. Per sterilizzare il mezzo, autoclavelo a 120 °C per 20 min. Raffreddare il mezzo e, prima che si solidifichi, distribuire 3 ml per capsula di Petri sterile (55 mm x 12 mm) in una cappa a flusso laminare sterile. Dopo la media solidificazione, conservare le piastre di Petri avvolte in un foglio di alluminio a 4 °C fino all'uso.
    4. Spargere il polline di ogni cultivar precedentemente utilizzata come donatore di polline nelle impollinazioni controllate in due piastre di Petri e incubarle a 25 °C per 24 ore.
      NOTA: Il mezzo di coltura inoculato può essere osservato al microscopio immediatamente dopo o conservato a -20 °C fino all'uso. A tale scopo, le piastre di Petri devono essere cambiate dal congelatore al frigorifero 24 ore prima delle osservazioni al microscopio.
    5. Per osservare i grani di polline, preparare una soluzione blu anilina all'1% (v /v) che macchia callosio. In primo luogo, preparare una soluzione tribasica di fosfato di potassio 0,1 N (K3PO4) sciogliendo 7,97 g di K3PO4 in 1.000 ml di acqua distillata. Per elaborare la soluzione blu di anilina all'1% (v/v), sciogliere 1 mL di blu anilina in 100 mL di 0,1 N K3PO4.
    6. Aggiungere 2-3 gocce di soluzione blu di anilina a ciascuna piastra di Petri e osservare dopo 5 minuti al microscopio a epifluorescenza UV utilizzando il filtro eccitere BP340-390 e il filtro barriera LP425. Contare i grani di polline vitali e non vitali in tre campi per piatto, ogni campo contenente 100-200 grani di polline, in due piastre di Petri per ogni cultivar.
  2. Crescita del tubo di polline
    1. Risciacquare i pistilli fissi con acqua distillata tre volte (1 h ciascuno, 3 h in totale) e trasferire al 5% (p/v) di solfito di sodio (Na2SO3)a 4 °C per 24 h. Per preparare questa soluzione, sciogliere 5 g di solfito di sodio in 100 ml di acqua distillata.
    2. Autoclave i pistilli a 120 °C per 8 min in solfito di sodio al 5% (p/v) per ammorbidire i tessuti.
    3. Schiacciare i pistilli ammorbiditi in una goccia di soluzione blu anilina all'1% (v / v) sotto un vetro di copertura su un vetrino per macchiare callosio.
    4. Osserva la crescita del tubo di polline lungo lo stile al microscopio con epifluorescenza UV usando il filtro eccitere BP340-390 e il filtro barriera LP425.

4. Determinazione delle relazioni di incompatibilità

  1. Estrazione del DNA dalle foglie
    1. Per estrarre il DNA, raccogliere 3-4 foglie giovani di ogni cultivar nel campo, preferibilmente in primavera.
      NOTA: il DNA può anche essere estratto da foglie mature, ma il DNA da foglie giovani ha meno composti fenolici.
    2. Isolare il DNA utilizzando un kit commerciale e seguire il kit di protocollo fornito (vedi Tabella dei materiali).
    3. Quantificare la concentrazione di DNA e valutare la qualità del DNA di ciascun campione a 260 nm in uno spettrofotometro a microvolume UV-Vis. Regolare la concentrazione di DNA a 10 ng/μL.
  2. Condizioni PCR per l'amplificazione dei frammenti
    1. Etichetta 0,2 mL di tubi e tappi PCR.
    2. Preparare i reagenti PCR secondo la Tabella 1 e lasciarli scongelare sul ghiaccio.
    3. Impostare un volume di master mix di ogni coppia di primer in un microtubo da 1,5 mL in base al numero di reazioni più il 10% di eccesso, considerando un volume di 16 μL per reazione. Aggiungere i reagenti seguendo l'ordine nella Tabella 1 e mescolare accuratamente.
    4. Aliquota 16 μL della miscela master in ogni tubo PCR da 0,2 mL contenente 4 μL di modello di DNA o 4 μL di acqua distillata sterilizzata come controllo negativo (C-). Utilizzare il DNA di cultivar con genotipo noto come controlli positivi. Mescolare delicatamente, chiudere i tubi di reazione con i tappi e centrifugare a 2.000 x g per 30 s per raccogliere l'intero volume nella parte inferiore del tubo di reazione.
    5. Posizionare i tubi di reazione nel termociclatore e impostare il programma PCR utilizzando il seguente profilo di temperatura: una fase iniziale di 3 min a 94 °C, 35 cicli di 1 min a 94 °C, 1 min a 56 °C e 3 min a 72 °C e una fase finale di 7 min a 72 °C20.
  3. Elettroforesi e stima della dimensione del frammento
    1. Per preparare un mini gel di acarosio all'1,7% (p/v), sciogliere 0,68 g di acarosio e 40 ml di tampone TBE 1x in un matraccio Erlenmeyer da 100 ml. Sciogliere la soluzione riscaldando in un forno a microonde a 600 W a intervalli di 30 s per evitare l'ebollizione.
    2. Lasciare che la soluzione rimanga sul banco per raffreddarsi, quindi aggiungere 3,5 μL di soluzione colorante di acido nucleico.
    3. Posizionare il vassoio di gel nel supporto di fusione e mettere il pettine selezionato nello stampo in gel. Assicurati di avere abbastanza pozzi per ogni prodotto PCR e scala del DNA.
    4. Versare la soluzione di agarose nello stampo gel e lasciarlo raffreddare fino alla polimerizzazione. Rimuovere il pettine del gel polimerizzato. Posizionare il gel nel sistema di elettroforesi orizzontale contenente abbastanza 1x tampone TBE per coprire la superficie del gel.
    5. Caricare il primo e l'ultimo pozzo con 2 μL della scala di peso molecolare del DNA (scala del DNA da 1 kb). Caricare 3 μL di ciascun prodotto della PCR negli altri pozzi. Chiudere la camera, accendere l'alimentazione e far funzionare il gel a 100 V per 30 minuti.
    6. Osservare il gel sotto la luce UV utilizzando un sistema di documentazione del gel. Utilizzare la scala del peso molecolare del DNA per determinare la dimensione del frammento amplificato e confrontarlo con i controlli positivi al fine di identificare gli alleli corrispondenti.

5. Monitoraggio delle date dei fiori

  1. Monitorare la fenologia di diversi alberi di ogni cultivar alla fioritura in anni diversi. Stabilire la durata del periodo di fioritura dal primo (circa il 5%) agli ultimi fiori aperti (circa il 95%). La piena fioritura è considerata quando almeno il 50% dei fiori si trova allo stadio F24, secondo lo stadio 65 sulla scala BBCH25,26.
  2. Per confrontare le date di fioritura delle cultivar intercompatibili e determinare quelle che coincidono al momento della fioritura ogni anno, elaborare un calendario dei tempi di fioritura con i dati di diversi anni.

Risultati

Ogni bocciolo di fiore di prugna giapponese contiene un'infiorescenza con 1-3 fiori. Come in altre specie di drupacee, ogni fiore è composto da quattro spirali: carpello, stami, petali e sepali, che si fondono formando una coppa alla base del fiore. Le strutture floreali sono più piccole di altri frutti a nocciolo, con un pistillo corto e fragile circondato dagli stami che contengono una piccola quantità di grani di polline. A piena fioritura, i fiori di ogni infiorescenza appaiono separati su brevi gambi, mostrando i...

Discussione

La metodologia qui descritta per i requisiti di impollinazione delle cultivar di prugne giapponesi richiede la determinazione dell'auto-(in)compatibilità di ciascuna cultivar mediante impollinazioni controllate sul campo o in laboratorio e la successiva osservazione della crescita del tubo pollinico con microscopia a fluorescenza. Le relazioni di incompatibilità sono stabilite dalla caratterizzazione degli alleli Smediante genotipizzazione molecolare. Infine, la selezione degli impollinatori viene eseguita dal...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata finanziata dall'Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 e RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón —Fondo sociale europeo, Unione europea (Grupo Consolidado A12-17R) e Junta de Extremadura —Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero è stato sostenuto da una borsa di studio del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología del Messico (CONACYT, 471839).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic Acid GlacialPanreac131008.1611
AgariNtRON Biotechnology25999
Aniline blueDifco8504-88
Boric Acid (H3BO4)Panreac131015.1210
Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2·4H2O)Panreac131231.1211
CoverglassDeltalabD10246024 mm x 60 mm
Digital CameraImaging Developmet SystemsUI-1490SE
Digital Camera Software SuiteImaging Developmet Systems4.93.0.
DNA OligosThermoFisher Scientific
dNTP Mix, 10 mM eachThermoSischer ScientificR0193
DreamTaq Green DNA polymeraseThermoFisher ScientificEP0713
Ethanol 96°VWR-Chemicals83804.360
1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb)Invitrogen15615-016Size: 250µg; Conc: 1.0 µg/µl
Gel Documentation SystemBio-Rad1708195
Hand CounterTamacoTM-4
Image Lab SoftwareBio-RadImage Analyse System for Gel Documentation System
MetaPhor AgaroseLonza50180
Microcentrifuge 5415 REppendorfZ605212
Microscope with UV epiflurescenceLeicaDM2500Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425
MicroslidesDeltalabD10000426 mm x 76 mm
Mini Electrophoresis SystemFisherbrand14955170
MinicentrifugeThermoFisher Scientific15334204
NanoDrop 1000 SpectrophotometerThermoFisher ScientificND1000
Petri DishesDeltalab20020155 mm x 14 mm
Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4·1.5H2O)Panreac141513
Primer forward 'Pru C2'ThermoFisher Scientific
Primer forward Pru T2'ThermoFisher Scientific
Primer reverse 'PCER'ThermoFisher Scientific
RedSafe Nucleic Acid Staining SolutioniNtRON Biotechnology21141
SaccharosePanreac131621.1211
Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3)Panreac131717.1211
Speedtools plant DNA extraction KitBiotools21272
TBE Buffer (10X)PanreacA0972,5000PE
Thermal Cycler T100Bio-Rad1861096
Thermomixer comfortEppendorfT1317
Vertical Autoclave Presoclave IIJP Selecta4001725
VortexFisherbrand11746744

Riferimenti

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