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Resumo

Função de barreira epitelial intestinal disregulada e respostas imunológicas são marcas de doença inflamatória intestinal que permanecem mal investigadas devido à falta de modelos fisiológicos. Aqui, descrevemos um modelo de alça intestinal de camundongos que emprega um segmento intestinal bem vascularizado e exteriorizado para estudar a permeabilidade mucosa e o recrutamento de leucócitos in vivo.

Resumo

A mucosa intestinal é forrada por uma única camada de células epiteliais que forma uma barreira dinâmica que permite o transporte paracelular de nutrientes e água, evitando a passagem de bactérias luminais e substâncias exógenas. Uma violação dessa camada resulta em maior permeabilidade ao conteúdo luminal e recrutamento de células imunes, ambas marcas de estados patológicos no intestino, incluindo doença inflamatória intestinal (DII).

Os mecanismos que regulam a função da barreira epitelial e a migração transepitelial (TEpM) de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) são incompletamente compreendidos devido à falta de métodos experimentais in vivo que permitem análises quantitativas. Aqui, descrevemos um modelo experimental murino robusto que emprega um segmento intestinal exteriorizado de íleo ou cólon proximal. O laço intestinal exteriorizado (iLoop) é totalmente vascularizado e oferece vantagens fisiológicas sobre abordagens baseadas em câmara ex vivo comumente usadas para estudar permeabilidade e migração de PMN através de monocamadas de células epiteliais.

Demonstramos duas aplicações deste modelo em detalhes: (1) medição quantitativa da permeabilidade intestinal através da detecção de dextrans rotulados por fluorescência no soro após injeção intraluminal, (2) avaliação quantitativa do PMN migrado através do epitélio intestinal para o lúmen intestinal após introdução intraluminal de quimioattractants. Demonstramos viabilidade deste modelo e fornecemos resultados utilizando o iLoop em camundongos sem a proteína epitelial associada à junção JAM-A em comparação com os controles. O JAM-A tem sido mostrado para regular a função da barreira epitelial, bem como pmn TEpM durante respostas inflamatórias. Nossos resultados utilizando o iLoop confirmam estudos anteriores e destacam a importância do JAM-A na regulação da permeabilidade intestinal e do PMN TEpM in vivo durante a homeostase e doença.

O modelo iLoop fornece um método altamente padronizado para estudos in vivo reprodutíveis de homeostase intestinal e inflamação e aumentará significativamente a compreensão da função da barreira intestinal e inflamação mucosa em doenças como o DII.

Introdução

A mucosa intestinal abrange uma única camada de células epiteliais intestinais colunares (IECs), células imunes de lamina propria subjacentes e mucosa muscular. Além de seu papel na absorção de nutrientes, o epitélio intestinal é uma barreira física que protege o interior do corpo de bactérias luminais, patógenos e antígenos dietéticos. Além disso, IECs e células imunes lamina propria coordenam a resposta imune induzindo tolerância ou resposta, dependendo do contexto e estímulos. Foi relatado que o rompimento da barreira epitelial pode preceder o aparecimento de inflamação patológica da mucosa e contribuir para a doença inflamatória intestinal (DII) que abrange tanto a colite ulcerativa quanto a doença de Crohn1,2,3,4,5,6,7. Indivíduos com colite ulcerativa apresentam migração transepitetelial excessiva (TEpM) de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) formando abscessos cripticos, achado que tem sido associado à gravidade da doença8,9. Embora a função da barreira epitelial comprometida e as respostas imunes excessivas sejam marcas do DII, faltam ensaios in vivo experimentais para realizar avaliações quantitativas da permeabilidade intestinal e do recrutamento de células imunes na mucosa intestinal.

Os métodos mais comuns utilizados para estudar a permeabilidade epitelial intestinal e o PMN TEpM empregam abordagens ex vivo baseadas em câmaras usando monocamadas IEC cultivadas em pastilhas de membrana porosa semi-permeável10,11,12. A integridade da barreira epitelial é monitorada por medidas de resistência elétrica transeptelial (TEER) ou pelo flux paracelular do isothionato fluoresceína (FITC) rotulado de dextran de apical ao compartimento basal13,14,15. Da mesma forma, o PMN TEpM é tipicamente estudado em resposta a um quimioattractant que é adicionado na câmara inferior16. O PMN é colocado na câmara superior e após um período de incubação, o PMN que migrou para o compartimento basal são coletados e quantificados. Embora esses métodos sejam úteis, fáceis de executar e muito reprodutíveis, eles são obviamente abordagens reducionistas e não representam necessariamente um reflexo preciso das condições in vivo.

Em camundongos, um ensaio comum para estudar a permeabilidade paracelular intestinal é por gavage oral do FITC-dextran e posterior medição da aparência FITC-dextran no soro sanguíneo13,17. A desvantagem deste ensaio é que representa uma avaliação da integridade geral da barreira do trato gastrointestinal e não da das contribuições regionais intestinais. Além disso, o azul Evans é comumente usado para avaliar vazamento vascular in vivo18 e também tem sido empregado para avaliar a permeabilidade mucosa intestinal em camundongos e ratos19,20,21. A quantificação de Evans azul na mucosa intestinal requer extração de tecido empregando incubação em formamide durante a noite. Portanto, o mesmo tecido não pode ser usado para estudar permeabilidade epitelial intestinal e infiltração de neutrófilos.

Aqui destacamos um protocolo simples que reduz o número de animais necessários para coletar dados reprodutíveis sobre permeabilidade mucosa cólon e migração transepitelial leucócito in vivo. Recomendamos, portanto, o uso de fitc-dextrans que são facilmente detectáveis no soro sanguíneo sem comprometer a integridade das alças intestinais que podem ser colhidas para análise posterior. Note-se que as alças ligadas intestinais têm sido utilizadas em várias espécies (incluindo rato, rato, coelho, bezerro) para estudar infecção bacteriana (como Salmonella, Listeria monocytogenes e Escherichia coli)22,23,24,25, bem como permeabilidade intestinal26; no entanto, até onde sabemos, não há estudos que investiguem mecanismos de PMN TEpM em regiões específicas do intestino, como íleo ou cólon que estejam comumente envolvidos no IBD.

Aqui descrevemos o modelo de alça intestinal do camundongo (iLoop) que é um método in vivo microcirúrgico robusto e confiável que emprega um segmento intestinal bem vascularizado e exteriorizado do íleo ou do cólon proximal. O modelo iLoop é fisiologicamente relevante e permite a avaliação da integridade da barreira intestinal e do PMN TEpM em camundongos vivos sob anestesia. Demonstramos duas aplicações: 1) quantificação dos níveis de soro de 4 kDa FITC-dextran após administração intraluminal no iLoop 2) quantificação de PMN transmigrado no lloop lúmen após injeção intraluminal do potente chemottractant Leukotriene B4 (LTB4)27. Além disso, utilizando o modelo iLoop com ratos ou ratos jam-a-nulosque abrigam perda seletiva de JAM-A em IECs(Villin-cre; Jam-a fl/fl) em comparação com os camundongos de controle, somos capazes de corroborar estudos anteriores que relataram uma grande contribuição para a proteína associada à junção apertada JAM-A à permeabilidade intestinal e transmigração de neutrófilos15,28,29,30,31.

O modelo iLoop é um método altamente funcional e fisiológico que pode ser usado para corroborar ensaios in vitro. Além disso, este é um modelo experimental versátil que permite o estudo de vários reagentes que podem ser injetados no lúmen de loop, incluindo quimiocinas, citocinas, patógenos bacterianos, toxinas, anticorpos e terapêuticas.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes e políticas dos Institutos Nacionais de Saúde e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan.

1. Preparação pré-operatória

NOTA: Este método foi gerado empregando camundongos adultos de origem genética C57BL/6, de 8 a 12 semanas. Todos os camundongos foram mantidos sob rigorosas condições específicas de livre patógenos com acesso ad libitum à comida e água normais. Os resultados foram obtidos utilizando C57BL/6, Jam-a - ratos nulos(Jam-a-/-) ou camundongos que abrigam perda seletiva de JAM-A em IECs (Villin-cre; Jam-afl/fl) e o ninhado Jam-afl/fl controles como descrito anteriormente30.

  1. Preparação da área
    1. Faça uma cirurgia em área limpa. O modelo de Loop intestinal, no entanto, é uma cirurgia de não sobrevivência que não requer técnica asséptica/estéril. Observe as práticas veterinárias de saneamento e utilize instrumentos cirúrgicos limpos (ou seja, esfregados com sabão, enxaguados com água seguido de 70% de etanol).
    2. Ligue uma placa cirúrgica controlada pela temperatura (ou almofadas de aquecimento) e fonte de luz adaptada para evitar que o animal se recupere da hipotermia durante a anestesia e a cirurgia.
    3. Prepare as ligaduras cortando segmentos de 6 cm de suturas cirúrgicas de seda 4-0 não absorvíveis.
    4. Prepare as gazes de algodão (5 cm x 5 cm) que são cortadas no centro seguindo uma forma elipsoide. Estes serão usados para cobrir a laparotomia midline e evitar o contato direto entre o iLoop exteriorizado e a pele animal. Mergulhe as gazes cortadas na solução de sal balanceado (HBSS) da Hanks em um recipiente de placa de petri.
    5. Prepare cotonetes de algodão molhado embebidos em HBSS quentes que serão usados para manusear órgãos e iLoop exteriorizado.
    6. Prepare a seringa de 10 mL cheia de HBSS quente e conecte-se a um tubo de alimentação amarelo. Esta seringa será usada para hidratar tecidos expostos durante a cirurgia e para lavar suavemente o iLoop de conteúdo fecal.
  2. Preparação animal
    1. Anestesiar o animal de acordo com o protocolo animal aprovado. Neste protocolo, uma mistura de isoflurane e oxigênio é administrada através de um vaporizador de anestesia. De acordo com as instruções do fabricante, ajuste a taxa de fluxo de oxigênio para 1 L/min. Coloque o vaporizador em 5% e pré-carregue a câmara de indução. Após 5 min, reduza o vaporizador de isoflurane para 2% - 2,5%.
    2. Coloque o animal na câmara de indução por 3 min a 5 minutos, depois transfira o animal para uma placa de cirurgia aquecida e conecte um plugue de nariz anestesia. Contenha o animal em posição supina pelos quatro membros usando fita adesiva.
      NOTA: Como alternativa à anestesia, uma mistura de cetamina (80 mg/kg - 100 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg - 10 mg/kg) diluída em solução salina (0,9% NaCl) pode ser administrada por injeção intraperitoneal. A anestesia deve ser mantida durante toda a cirurgia por administração intramuscular de cetamina/xilazina (em 0,1 - 0,25 vezes de doses iniciais) para garantir a profundidade anestésico. Se disponível, um vaporizador de anestesia isoflurane é altamente recomendado para garantir melhor reprodutibilidade, sobrevivência e prevenir a dor animal.
    3. Aplique pomada oftalmológica em ambos os olhos para evitar a proficação da córnea.
    4. Realizar um exame físico que inclua frequência cardíaca (cerca de 500 batidas/min) e ritmo, cor da membrana mucosa (rosa), tempo de recarga capilar (< 2 s), taxa respiratória (não inferior a 40 - 60 respirações/min) e temperatura (36,5 °C)32.
    5. Antes de prosseguir para os próximos passos, avalie a profundidade anestésico pelo reflexo de retirada do pedal. Empregue um estímulo doloroso (pinça) da pele entre os dedo dos dedo dos dedo e/ou almofadas dos dedo do dedo do dedo. Mouse responderá contraindo e removendo sua perna. Este reflexo do pedal desaparece quando o animal é anestesiado profundamente.
      NOTA: O monitoramento de sinais vitais e reflexo do pedal são recomendados em todo o período de anestesia no mínimo a cada 15 minutos. As diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) para avaliação da profundidade anestésico recomendam o monitoramento da seguinte cor da membrana da cauda, pé e mucosa (como língua). Cor rosa como normal e pálida ou azul como indicativo de diminuição da perfusão sanguínea ou problema respiratório; b Avaliação do padrão respiratório como respiração regular versus irregular. Uma sonda de temperatura retal, um oxímetro de roedores e monitores de frequência cardíaca podem ser usados para a avaliação da temperatura corporal, batimentos cardíacos e respiratórios, respectivamente.

2. Geração do laço ileal

  1. Preparação da pele: Esfregue a pele da linha média abdominal com cotonetes de álcool ou esponja de gaze encharcada com 70% de etanol. Não molhe uma ampla área de pele com álcool para evitar hipotermia.
  2. Usando uma tesoura, faça uma laparotomia midline. Faça uma incisão vertical no meio do abdômen (cerca de 2 cm de comprimento) e exponha o peritônio. Tenha cuidado para não ferir órgãos intra-abdominais.
  3. Coloque gaze de algodão molhado pré-cortada sobre a cavidade intra-abdominal exposta.
  4. Use cotonetes de algodão molhado para mobilizar e exteriorizar o caecum. Coloque cuidadosamente o caecum na gaze de algodão molhado.
    NOTA: O caecum está localizado no quadrante caudal esquerdo da cavidade abdominal na maioria dos camundongos independentes do sexo do animal.
  5. Use cotonetes de algodão molhado para mobilizar e exteriorizar suavemente o ímuto do qual a seção terminal (extremidade distal) está presa ao caecum(Figura 1B).
  6. Implante pelo menos 6 cm de íleo terminal na gaze de algodão molhado sem interrupção dos vasos mesenéricos e suprimento de sangue. O suprimento de sangue é mantido se não houver sangramento e o tecido mantiver sua cor rosa(Figura 1B).
    NOTA: Evite a secagem de tecidos expostos mantendo os tecidos úmidos o tempo todo com HBSS quente (a cada 2 - 3 minutos) usando seringa de 10 mL presa a um tubo de alimentação amarelo (passo 1.1.6).
  7. Perto do caecum, identifique a artéria principal que fornece o íleo na mesenteria. Em seguida, localize dois locais de ligadura na mesenteria que estão livres de vasos sanguíneos críticos.
  8. Usando fórceps de tecido contundente, pegue firmemente o íleo terminal (mais próximo do caecum) e usando fórceps finos, fenestrate a mesenteria evitando vasos sanguíneos. Coloque a sutura de seda através da perfuração e amarre um nó cirúrgico para criar a primeira ligadura (extremidade distal do laço).
  9. Use a régua para medir 4 cm de distância da primeira ligadura e criar a segunda ligadura (extremidade proximal do loop) como mencionado na etapa 2.8 (Figura 1C).
  10. Com uma tesoura fina cuidadosamente cortada ao lado de cada ligadura para isolar o laço ileal de 4 cm, mantendo o suprimento sanguíneo intacto e a membrana mesentórica.
    NOTA: Corte as duas extremidades do segmento exteriorizado do iLoop, depois lave suavemente como um passo necessário que previne a interferência com o conteúdo luminal (matéria fecal), facilitando até mesmo a dispersão dos estímulos FITC-dextrans ou chemotac em toda a extensão do segmento isolado, bem como permitindo uma quantificação mais precisa dos leucócitos por citometria de fluxo. Este procedimento também permite distensão uniforme da mucosa após injeção de volumes especificados de reagente e melhor reprodutibilidade entre animais.
  11. Lave suavemente o conteúdo do segmento de laço ileal com HBSS quente usando um tubo de alimentação amarelo flexível ligado a uma seringa de 10 mL (ver passo 1.1.6).
  12. Ligate as duas extremidades cortadas do laço ileal lavado usando sutura de seda.
  13. Use uma seringa de 1 mL com agulha de 30 G para injetar lentamente 250 μL de reagente, como FITC-dextrans (etapa 4.2) ou quimiocina (passo 5.3) no lúmen intestinal. O laço ileal inflará causando uma distensão moderada da mucosa (Figura 1D).
    NOTA: Injete reagente no lúmen de loop no lado oposto da artéria mesentérica. Tenha cuidado para não retirar o laço ileal do animal enquanto injeta para evitar rasgar vasos sanguíneos e induzir sangramento.
  14. Usando cotonetes de algodão molhado, coloque suavemente de volta o laço ileal, íleo proximal e caecum.
  15. Use um suporte de agulha, fórceps anatômicos e suturas de seda não absorvíveis 3.0 com agulha de corte reversa para fechar a parede abdominal.
  16. Coloque o animal em uma câmara de anestesia regulada pela temperatura durante o período de incubação.

3. Geração do laço de cólon proximal (pcLoop)

NOTA: Para obter detalhes sobre ratos que foram usados para a geração do pcLoop, consulte as informações fornecidas no início da seção de protocolo.

  1. Realize as etapas 2.1. - 2.4. como descrito acima para o laço ileal.
  2. Usando cotonetes de algodão molhado, exteriorize todo o íleo e coloque-o no topo de uma gaze de algodão molhado. Identifique o cólon proximal e o suprimento de sangue localizado no mesocólon. Mobilize o cólon proximal e usando fórceps finos criam a primeira ligadura em uma área livre de vasos no mesocólon a cerca de 0,5 cm distal do caecum(Figura 2B).
  3. Meça 2 cm da primeira ligadura e crie uma segunda ligadura em uma área livre de suprimento de sangue no mesocólon(Figura 2C).
  4. Usando uma tesoura fina cuidadosamente cortada ao lado de cada ligadura para isolar um pcLoop de 2 cm de comprimento.
    NOTA: Como mencionado na nota na etapa 2.10, é importante cortar ambas as extremidades para isolar um pcLoop que é suavemente limpo de conteúdo luminal. Corte cuidadosamente o tecido colonial e o mesocólon para evitar que pequenos vasos sangrem no lúmen intestinal. Se necessário, use cauteria térmica para limitar o sangramento no local da incisão.
  5. Lave suavemente o pcLoop com HBSS quente para remover fezes usando um tubo de alimentação amarelo flexível ligado à seringa de 10 mL (ver passo 1.1.6).
  6. Ligate as duas extremidades cortadas do pcLoop lavado usando sutura de seda.
  7. Use uma seringa de 1 mL com agulha de 30G para injetar lentamente 200 μL de reagente, como FITC-dextrans (etapa 4.2) ou quimiocina (passo 5.3) no lúmen intestinal. O pcLoop vai inflar causando uma distensão moderada da mucosa (Figura 2D).
    NOTA: Injete o reagente no lúmen pcLoop no lado oposto da artéria mesentérica. Garanta a consistência entre os animais e crie um pcLoop de 2 cm de comprimento para garantir a mesma distensão da mucosa.
  8. Utilize cotonetes de algodão molhado para colocar suavemente de volta o pcLoop ligado, íleo e caecum na cavidade abdominal.
  9. Use um suporte de agulha, fórceps anatômicos e suturas de seda não absorvíveis 3.0 com agulha de corte reversa para fechar a parede abdominal.
  10. Coloque o animal em uma câmara de anestesia regulada pela temperatura durante o período de incubação.

4. Avaliação quantitativa da permeabilidade intestinal: ensaio FITC-dextran de 4 kDa

  1. Realize um loop ileal ou pcLoop (como descrito acima).
  2. Utilizando uma seringa de 1 mL com agulha de 30 G, injete no lúmen intestinal de 250 μL (íleo - passo 2,13) ou 200 μL (cólon - passo 3,7) de solução fitc-detranx de 4 kDa (1 mg / mL em HBSS). Mantenha a solução FITC-dextran nãousada protegida da luz para preparar a curva padrão após a coleta de soro.
  3. Para o loop ileal siga os passos 2.14 a 2.16, para as etapas pcLoop 3.8 a 3.10. Brevemente, coloque os órgãos e o iLoop de volta no lugar na cavidade abdominal, feche a parede abdominal.
  4. Coloque o animal por 120 minutos em uma câmara de anestesia aquecida.
  5. Após o período de incubação abra a parede abdominal, obtenha acesso ao coração e realize punção cardíaca usando uma seringa de 1 mL com agulha 25G para coletar o sangue. Transfira sangue para um tubo ativador de coágulos de soro de 1,3 mL, misture suavemente e mantenha no gelo protegido da luz. Colete pelo menos 500 μL de sangue por rato.
    NOTA: Os animais são eutanizados quando estão sob anestesia usando um método físico como decapitação ou luxação cervical, e de acordo com o protocolo animal aprovado.
  6. Tubo ativador de coágulo de soro centrífuga por 5 min a 10.000 x g à temperatura ambiente de acordo com as recomendações do fabricante. Colete o soro (supernante) e transfira para um tubo de centrífuga de 1,7 mL. Mantenha o tubo no gelo e protegido da luz.
  7. Quantificação da fluorescência no soro sanguíneo
    1. Prepare uma curva padrão de FITC-dextran 4 kDa em soro de ratos de controle (soro fisiológico ou HBSS é uma alternativa válida). Crie uma diluição serial de duas vezes com uma concentração inicial de 1 mg/mL FITC-dextran. As concentrações FITC-dextran 4 kDa medidas variam entre 0,25 mg/mL e 2 μg/mL.
    2. Transfira o volume igual da amostra e os padrões para uma placa preta de 96 poços (fundo plano) e meça FITC em um leitor de placa de fluorescência (Excitation 490 nm, Emission 520 nm), de acordo com as instruções do fabricante e protocolos publicados33. Calcule a concentração FITC com base na curva padrão ou nos valores de permeabilidade presentes conforme a mudança de dobra normalizada para o grupo de controle experimental.

5. Avaliação quantitativa do PMN migrado para o lúmen intestinal após estimulação intraluminal com quimiocinas

NOTA: Pouquíssimos PMN residem na mucosa intestinal no nível de linha de base. O pré-tratamento de animais com citocinas pró-inflamatórias resulta em um ambiente inflamatório que facilita o recrutamento de PMN da corrente sanguínea para a mucosa intestinal.

  1. Utilizando uma seringa de 1 mL com agulha de 30 G, realize a injeção intraperitoneal (i.p.) de uma solução estéril de 100 ng de Tumor Necrosis Factor-α (TNFα) e 100 ng de Interferon-γ (INFγ) em 200 μL de Salina Tampão Fosfato (PBS).
  2. Após 4 - 24 h de pré-tratamento com citocinas pró-inflamatórias, realize um loop ileal ou pcLoop (como descrito acima).
  3. Utilizando uma seringa de 1 mL com agulha de 30 G, injete no lúmen intestinal 250 μL (íleo - passo 2,13) ou 200 μL (cólon - passo 3,7) da solução quimioattractant Leukotriene B4 (LTB4) 1 nM no HBSS.
    NOTA: Leukotrieno B4 (LTB4) é usado neste protocolo como um potente quimioattractant para PMN. Outros quimioattractants como N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLF) ou quimiokine (C-X-C motivo) ligante 1 (CXCL1/KC) também podem ser usados para induzir o recrutamento significativo de PMN no lúmencólon 30.
  4. Para o loop ileal siga os passos 2.14 a 2.16. Para o pcLoop siga os passos 3.8 a 3.10. Brevemente, coloque os órgãos e o iLoop de volta no lugar na cavidade abdominal, feche a parede abdominal.
  5. Coloque o animal por 60 minutos em uma câmara de anestesia aquecida.
  6. Coleta do conteúdo do loop intestinal
    1. Prepare soluções e armazene no gelo: Para o laço ileal e pcLoop, prepare um tampão de lavagem contendo 2 mM ácido ethylenediaminetetraacético (EDTA), 5 mM Dithiothreitol (DTT) e 2% FBS em PBS estéril sem cálcio e magnésio.
    2. Após o período de incubação e sob manutenção de anestesia, abra a parede abdominal e retire o iLoop (laço ileal ou pcLoop). Eutanize os animais quando estão sob anestesia usando um método físico como decapitação ou luxação cervical, e de acordo com o protocolo animal aprovado.
    3. Enxágüe o laço com PBS frio para remover qualquer contaminante sanguíneo residual e absorver o excesso de PBS com lenços umedecidos. Colete cuidadosamente o conteúdo do loop em um tubo centrífuga de 1,7 mL (cerca de 250 μL para loop ileal e 200 μL para pcLoop). Lave o laço com 500 μL de tampão de lavagem a frio e, imediatamente após a coleta, coloque o tubo no gelo.
      NOTA: O DTT ajuda a dissolver o muco. Se o teor luminal do iLoop for muito viscoso (dependendo do fundo genético do camundongo), dilui-o 1:2 ou 1:3 com tampão de lavagem contendo DTT.
    4. Passe a solução de conteúdo luminal através de um filtro de malha de nylon de 35 μm usando um tubo de fundo redondo de 5 mL com tampa de coador celular. Esta etapa ajuda a remover fragmentos de tecido e agregados celulares. Enxágüe o coador celular com 1 mL de tampão de lavagem.
    5. Tubo de centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o supernasciente, enxágue a pelota com 500 μL - 1 mL de tampão de lavagem, depois centrífuga a 400 x g por 5 min, 4 °C.
    6. Resuspend iLoop cápsula de célula luminal em 200 μL de tampão de citometria de fluxo (FCB) contendo 2% de FBS em PBS estéril sem cálcio e magnésio. As células podem ser mantidas em um tubo ou transferidas para uma placa inferior redonda de 96 poços para coloração e análise de citometria de fluxo.
  7. Coloração e análise da Citometria de Fluxo
    1. Controles de compensação: glóbulos brancos
      1. Prepare uma seringa de 1 mL com agulha de 25 G pré-preenchida com edta estéril de 0,5 M (pH 8.0). 10% de EDTA por volume sanguíneo esperado (100 μL de EDTA para 1 mL de sangue).
      2. Coletar sangue sob anestesia por punção cardíaca. Transfira sangue para um tubo de 1,7 mL, depois centrífuga a 400 x g por 10 min, 4 °C.
        NOTA: Enquanto o camundongo estiver sob anestesia, use um método físico para confirmar a morte de acordo com o protocolo animal aprovado (como a luxação cervical).
      3. Aspire o supernatante. Resuspenque a pelota em 1 mL de tampão de lise amônio-cloreto-potássio (ACK) para a lise dos glóbulos vermelhos. Incubar por 3 min - 5 min no gelo. Centrífuga 400 x g por 5 min, 4 °C. Se a pelota ainda estiver vermelha, repita este passo tampão de lise ACK até que a pelota fique branca.
      4. Resuspenque a pelota em 1 mL FCB e placa 0,5 x 106- 1 x 106 de células por poço. Prepare cinco poços de uma placa de fundo redondo de 96. Coloque a placa no gelo.
        NOTA: Use a mesma placa de 96 poços que contém o conteúdo luminal do loop (ver etapa 5.6.6).
    2. Coloração de citometria de fluxo
      1. Centrifugar a placa de 96-well por 5 min a 400 x g, 4 °C. Descarte o supernasce e resuspenque as pelotas com 50 μL de Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 como um Bloco de Fc (1 μg por 100 μL de FCB). Incubar por 5 min - 10 min no gelo.
      2. Imunostaining do conteúdo luminal iLoop: Prepare uma mistura contendo todos os anticorpos conjugados fluorocromo (diluição 1:50 na FCB): anti-CD45-PerCP, anti-CD11b-PE e anti-Ly-6G-Alexa Fluor 647. Adicione 50 μL da combinação por poço, para um volume final de 100 μL.
      3. Imunostaining dos glóbulos brancos para compensações (diluição de 1:50 em FCB): Use 50 μL somente de FCB (amostra não manchada, bem 1), 50 μL de cada anticorpo fluorocromático-conjugado individual (poços 2 - 4), 50 μL da combinação de todos os anticorpos fluorocromático-conjugados (bem 5). Volume final de 100 μL.
      4. Incubar a placa por 30 minutos no gelo protegido da luz.
      5. Centrifugar a placa por 5 min a 400 x g,4 °C. Descarte o supernaspe e lave com 200 μL de FCB. Repita esta etapa de lavagem duas vezes.
      6. Adicione FCB 150 μL/well às amostras de sangue.
      7. Adicione 100 μL/bem FCB à amostra de conteúdo luminal iLoop. Em seguida, 50 μL/poço de contas fluorescentes de contagem.
    3. Análise de citometria de fluxo
      1. Portão para eventos positivos cd45 e para a expressão de Ly-6G-/Gr-1 e CD11b30.
      2. Use 100 μL do volume amostral como condição de parada.
      3. Calcule o número absoluto de PMN que migrou para o lúmen iLoop seguindo as informações fornecidas pelo fabricante das contas de contagem fluorescente.
        NOTA: Os dados podem ser apresentados como (1) número total de PMN no lúmen30,34,35, (2) número de PMN por grama de tecido, bem como (3) número de PMN por mm3 utilizando a fórmula para o volume de um cilindro: V= π(pi) r 2 h (V para volume, r para raio e h para altura).

Resultados

Uma representação esquemática dos modelos ileal loop e pcLoop é retratada na Figura 1 e Figura 2, respectivamente. As imagens anatômicas exibem as etapas críticas do procedimento, incluindo a exteriorização do segmento intestinal (Figura 1B e Figura 2B),identificação de um local apropriado para ligaduras que permite perturbação mínima do suprimento de sangue

Discussão

Os mecanismos responsáveis pela desregulação da função da barreira intestinal e o recrutamento de células imunes em condições patológicas como o IBD são incompletamente compreendidos. Aqui, detalhamos um modelo robusto in vivo murine que emprega um segmento intestinal exteriorizado bem vascularizado de cólon ileum ou proximal e permite a avaliação da permeabilidade intestinal, estudos de migração de neutrófilos, bem como outras aplicações.

O iLoop é uma cirurgia de não recu...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Dr. Sven Flemming da Universidade de Wuerzburg por suas contribuições para o estabelecimento do modelo proximal de laço de cólon, Sean Watson pela gestão das colônias de ratos e Chithra K. Muraleedharan por ajudar na aquisição das fotos do modelo iLoop. Este trabalho foi apoiado pela German Research Foundation/DFG (BO 5776/2-1) para KB, R01DK079392, R01DK072564 e R01DK061379 para C.A.P.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment and Material
BD Alcohol SwabsBD326895
BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8"BD305122
BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2"BD305106
BD 1ml Tuberculin Syringe Without NeedleBD309659
15ml Centrifuge TubeCorning14-959-53A
Corning 96-Well Solid Black Polystyrene MicroplateFisherScientific07-200-592
Corning Non-treated Culture Dish, 10cmMilliporeSigmaCLS430588
Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterileFisherScientific25806 2WC
Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2"Medex3249-1
EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units)E-Z SystemsEZ-7000
Falcon Centrifuge Tube 50ml VWR21008-940
Fisherbrand Colored Labeling TapeFisherScientific15-901-10R
Halsey Needle Holder (needle holder) FST12001-13
Kimwipes, small (tissue wipe)FisherScientific06-666
1.7ml Microcentrifuge Tubes Thomas Scientific c2170
Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube)Sarstedt 41.1501.105
Moria Fine ScissorsFST14370-22
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh)Falcon352235
Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular LubricantDechra12920060
Ring Forceps (blunt tissue forceps)FST11103-09
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YDFisherScientificNC9452680
Semken Forceps (anatomical forceps)FST1108-13
Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting HenryScheinSS694
Student Fine Forceps, AngledFST91110-10
10ml Syringe PP/PE without needleMillipore Sigma Z248029
96 Well Cell Culture PlateCorning3799
Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mmInstechFTP-20-30
Solutions and Buffers
Accugene 0.5M EDTALonza51201
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing BufferBioWhittaker10-548E
Hanks' Balanced Salt SolutionCorning21-023-CV
Phosphate-Buffered Saline without Calcium and MagnesiumCorning21-040-CV
Reagents
Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8)BioLegend127610
CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70)ThermoFisher12-0112-81
CountBright Absolute Counting BeadsInvitrogenC36950
DithiotreitolFisherScientificBP172-5
Fetal Bovine Serum, heat inactivatedR&D Systems511550
Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000Sigma60842-46-8
IsofluraneHalocarbon12164-002-25
Leukotriene B4Millipore Sigma71160-24-2
PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11)BD Pharmingen557235
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block)BD Bioscience553142
Recombinant Murine IFN-γPeprotech315-05
Recombinant Murine TNF-αPeprotech315-01A

Referências

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