JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Дисрегулируемая функция кишечного эпителиального барьера и иммунные реакции являются отличительными признаками воспалительных заболеваний кишечника, которые остаются плохо изученными из-за отсутствия физиологических моделей. Здесь мы описываем модель кишечной петли мыши, которая использует хорошо васкуляризованный и экстериоризованный сегмент кишечника для изучения проницаемости слизистой оболочки и рекрутации лейкоцитов in vivo.

Аннотация

Слизистая оболочка кишечника выстлена одним слоем эпителиальных клеток, который образует динамический барьер, позволяющий параклеточный транспорт питательных веществ и воды, одновременно предотвращая прохождение просветных бактерий и экзогенных веществ. Нарушение этого слоя приводит к увеличению проницаемости для просветного содержимого и рекрутирования иммунных клеток, которые являются отличительными признаками патологических состояний в кишечнике, включая воспалительное заболевание кишечника (ВЗК).

Механизмы, регулирующие эпителиальную барьерную функцию и трансэпителиальную миграцию (TEpM) полиморфноядерных нейтрофилов (PMN), изучены не полностью из-за отсутствия экспериментальных методов in vivo, позволяющих проводить количественный анализ. Здесь мы описываем надежную экспериментальную модель мышечных животных, которая использует экстериоризованный кишечный сегмент подвздошной или проксимальной кишки. Экстериоризированная кишечная петля (iLoop) полностью васкуляризирована и предлагает физиологические преимущества по сравнению с подходами на основе камер ex vivo, обычно используемыми для изучения проницаемости и миграции PMN через монослои эпителиальных клеток.

Мы подробно демонстрируем два применения этой модели: (1) количественное измерение кишечной проницаемости путем обнаружения флуоресцентно меченого декстрана в сыворотке крови после внутрипросветной инъекции, (2) количественная оценка мигрировавших ПМН через эпителий кишечника в просвет кишечника после внутрипросветного введения хемоатрактантов. Мы демонстрируем осуществимость этой модели и предоставляем результаты с использованием iLoop у мышей, у которых отсутствует эпителиальный плотный соединительный связанный белок JAM-A по сравнению с контрольной частью. Было показано, что JAM-A регулирует функцию эпителиального барьера, а также PMN TEpM во время воспалительных реакций. Наши результаты с использованием iLoop подтверждают предыдущие исследования и подчеркивают важность JAM-A в регуляции кишечной проницаемости и PMN TEpM in vivo во время гомеостаза и заболевания.

Модель iLoop обеспечивает высоко стандартизированный метод воспроизводимых in vivo исследований кишечного гомеостаза и воспаления и значительно улучшит понимание кишечной барьерной функции и воспаления слизистой оболочки при таких заболеваниях, как ВЗК.

Введение

Слизистая оболочка кишечника включает в себя один слой столбчатых эпителиальных клеток кишечника (IIC), лежащих в основе иммунных клеток lamina propria и слизистых мышц. Помимо своей роли в поглощении питательных веществ, эпителий кишечника является физическим барьером, который защищает внутреннюю часть организма от просветных комменсальных бактерий, патогенов и диетических антигенов. Кроме того, ИЭК и иммунные клетки lamina propria координируют иммунный ответ, вызывая либо толерантность, либо реакцию в зависимости от контекста и стимулов. Сообщалось, что нарушение эпителиального барьера может предшествовать возникновению патологического воспаления слизистой оболочки и способствовать воспалительным заболеваниям кишечника (ВЗК), охватывающим как язвенныйколит,так и болезнь Крона1,2,3,4,5,6,7. Лица с язвенным колитом представляют чрезмерную трансэпителиальную миграцию (TEpM) полиморфноядерных нейтрофилов (PMN), образующих абсцессы крипты, что было связано с тяжестью заболевания8,9. Хотя нарушенная эпителиальная барьерная функция и чрезмерные иммунные реакции являются отличительными признаками ВЗК, отсутствуют экспериментальные анализы in vivo для выполнения количественных оценок проницаемости кишечника и рекрутации иммунных клеток в слизистую оболочку кишечника.

Наиболее распространенные методы, используемые для исследования проницаемости эпителия кишечника и PMN TEpM, используют подходы на основе камер ex vivo с использованием монослоев МЭК, культивируемых на полупроницаемых пористых мембранных вставках10,11,12. Целостность эпителиального барьера контролируется либо измерениями трансэпителиального электрического сопротивления (TEER), либо параклеточного потока флуоресцеина изотиоцианата (FITC), меченого декстраном от апикального до базального компартмента13,14,15. Аналогичным образом, PMN TEpM обычно изучается в ответ на хемоатрактант, который добавляют в нижнюю камеру16. ПМН помещают в верхнюю камеру, и после инкубационного периода ПМН, которые мигрировали в базальный отсек, собирают и количественно оценивают. Хотя эти методы полезны, просты в исполнении и очень воспроизводимы, они, очевидно, являются редукционистскими подходами и не обязательно представляют собой точное отражение условий in vivo.

У мышей распространенным анализом для изучения кишечной параклеточной проницаемости является пероральный прием FITC-декстрана и последующее измерение появления FITC-декстрана в сыворотке крови13,17. Недостатком этого анализа является то, что он представляет собой оценку общей барьерной целостности желудочно-кишечного тракта, а не регионального кишечного вклада. Кроме того, синий Эванс обычно используется для оценки сосудистой утечки in vivo18, а также был использован для оценки проницаемости слизистой оболочки кишечника у мышей и крыс19,20,21. Количественная оценка синего цвета Эванса в слизистой оболочке кишечника требует извлечения из ткани с использованием инкубации в формамиде в течение ночи. Поэтому одну и ту же ткань нельзя использовать для изучения проницаемости эпителия кишечника и нейтрофильной инфильтрации.

Здесь мы выделяем простой протокол, который уменьшает количество животных, необходимых для сбора воспроизводимых данных о проницаемости слизистой оболочки толстой кишки и трансэпителиальной миграции лейкоцитов in vivo. Поэтому мы рекомендуем использовать FITC-декстранс, которые легко обнаруживаются в сыворотке крови без ущерба для целостности кишечных петель, которые могут быть собраны для дальнейшего анализа. Следует отметить, что кишечные лигированные петли использовались у различных видов (включая мышь, крысу, кролика, теленка) для изучения бактериальной инфекции (такой как Salmonella, Listeria monocytogenes и Escherichia coli)22,23,24,25, а также кишечной проницаемости26; однако, насколько нам известно, нет исследований, изучающих механизмы PMN TEpM в определенных областях кишечника, таких как подвздошная кишка или толстая кишка, которые обычно участвуют в ВЗК.

Здесь мы описываем модель кишечной петли мыши (iLoop), которая является надежным и надежным микрохирургическим методом in vivo, который использует хорошо васкуляризованный и экстериоризованный кишечный сегмент подвздошной или проксимальной толстой кишки. Модель iLoop физиологически актуальна и позволяет оценить целостность кишечного барьера и PMN TEpM на живых мышах под наркозом. Мы демонстрируем два применения: 1) количественная оценка сывороточных уровней 4 кДа FITC-декстрана после внутрипросветного введения в iLoop 2) количественная оценка трансмигрированного PMN в просвете iLoop после внутрипросветного введения мощного хемоттрактанта Лейкотриена B4 (LTB4)27. Кроме того, использование модели iLoop с мышами Jam-a-null или мышами, переносимыми селективную потерю JAM-A на IIC(Villin-cre; Jam-a fl/fl) по сравнению с контрольными мышами, мы можем подтвердить предыдущие исследования, в которых сообщалось о значительном вкладе в плотное соединение-ассоциированный белок JAM-A в проницаемость кишечника и трансмиграцию нейтрофилов15,28,29,30,31.

Модель iLoop является высокофункциональным и физиологическим методом, который может быть использован для подтверждения анализов in vitro. Кроме того, это универсальная экспериментальная модель, которая позволяет изучать различные реагенты, которые могут быть введены в просвет петли, включая хемокины, цитокины, бактериальные патогены, токсины, антитела и терапевтические средства.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами и политикой Национальных институтов здравоохранения и одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных в Мичиганском университете.

1. Предоперационная подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был получен с использованием взрослых мышей с генетическим фоном C57BL/6 в возрасте от 8 до 12 недель. Все мыши содержались в строгих специфических условиях, свободных от патогенов, с доступом ad libitum к нормальному чау и воде. Результаты были получены с использованием C57BL/6, Jam-a - нулевых мышей (Jam-a-/-) или мышей с селективной потерей JAM-A на IIC (Villin-cre; Jam-afl/fl) и помет jam-afl/fl controls, как описаноранее 30.

  1. Подготовка площадки
    1. Выполните операцию в чистой области. Модель кишечной петли, однако, является операцией без выживания, которая не требует асептической / стерильной техники. Соблюдайте ветеринарную санитарную практику и используйте очищенные хирургические инструменты (т.е. промывные с мылом, промываемые водой с последующим 70% этанолом).
    2. Включите хирургическую доску с контролируемой температурой (или грелки) и адаптированный источник света, чтобы удерживать животное от переохлаждения во время анестезии и операции.
    3. Подготовьте лигатуры, разрезав 6 см сегменты нерассасывающихся 4-0 шелковых хирургических швов.
    4. Приготовьте хлопчатобумажную марлю (5 см х 5 см), которая разрезается в центре по эллипсоидной форме. Они будут использоваться для покрытия лапаротомии средней линии и предотвращения прямого контакта между экстериоризованным iLoop и мехом животных. Замочите нарезанную марлю в теплом сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS) в контейнере для чашки Петри.
    5. Приготовьте влажные ватные тампоны, пропитанные теплым HBSS, которые будут использоваться для обработки органов и экстериоризированного iLoop.
    6. Подготовьте шприц 10 мл, наполненный теплым HBSS, и прикрепите к желтой питательной трубке. Этот шприц будет использоваться для увлажнения открытых тканей во время операции и для мягкого промывания iLoop от содержания фекалий.
  2. Подготовка животных
    1. Обезболить животное в соответствии с утвержденным протоколом для животных. В этом протоколе смесь изофлурана и кислорода вводится через испаритель анестезии. В соответствии с инструкциями производителя, отрегулируйте расход кислорода до 1 л/мин. Установите испаритель на 5% и предварительно зарядим индукционную камеру. Через 5 мин уменьшают испаритель изофлурана до 2% - 2,5%.
    2. Поместите животное в индукционную камеру на 3 мин - 5 мин, затем переложите животное на подогреваемую хирургическую доску и подключите анестезируйную носовую пробку. Удерживайте животное в положении лежа на спине четырьмя конечностями с помощью клейкой ленты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы анестезии смесь кетамина (80 мг/кг - 100 мг/кг) и ксилазина (5 мг/кг - 10 мг/кг), разведенная в физиологичном растворе (0,9% NaCl), может быть введена внутрибрюшинной инъекцией. Анестезия должна поддерживаться на протяжении всей операции путем внутримышечного введения кетамина/ксилазина (в 0,1 - 0,25 раза начальных доз) для обеспечения глубины анестезии. При наличии, настоятельно рекомендуется испаритель изофлурановой анестезии для обеспечения лучшей воспроизводимости, живучести и предотвращения боли животных.
    3. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
    4. Выполните физический осмотр, который включает в себя частоту сердечных сокращений (около 500 ударов / мин) и ритм, цвет слизистой оболочки (розовый), время пополнения капилляров (< 2 с), частоту дыхания (не ниже 40 - 60 вдохов / мин) и температуру (36,5 ° C)32.
    5. Прежде чем перейти к следующим шагам, оцените глубину анестезии по рефлексу снятия педали. Используйте болезненный стимул (защемление) кожи между щапями и / или подушечками для щипок. Мышь будет реагировать, сжимая и удаляя ногу. Этот педальный рефлекс исчезает, когда животное глубоко обезболивается.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мониторинг жизненно важных веществ и педального рефлекса рекомендуется на протяжении всей анестезии не менее чем каждые 15 минут. Руководящие принципы Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) для оценки глубины анестезии рекомендуют мониторинг следующего: (а) цвет хвоста, стопы и слизистой оболочки (например, языка). Цвет розовый как нормальный и бледно-синий, как признак снижения перфузии крови или респираторного дистресса; b) оценка характера дыхания как регулярного по сравнению с нерегулярным дыханием. Ректальный температурный зонд, оксиметр грызунов и мониторы сердечного ритма могут использоваться для оценки температуры тела, частоты сердечных сокращений и дыхания соответственно.

2. Генерация подвздошной петли

  1. Подготовка кожи: Скрабировать мех брюшной средней линии спиртовыми тампонами или марлевой губкой, пропитанной 70% этанолом. Не смачивайте широкий участок меха спиртом для предотвращения переохлаждения.
  2. С помощью ножниц выполните лапаротомию средней линии. Сделайте вертикальный разрез посередине живота (около 2 см в длину) и обнажите брюшину. Будьте осторожны, чтобы не травмировать внутрибрюшные органы.
  3. Поместите предварительно нарезанную влажную ватную марлю на открытую внутрибрюшную полость.
  4. Используйте влажные ватные тампоны для мобилизации и экстериоризации цапли. Аккуратно поместите цалевую кишки на мокрую ватную марлю.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цая киша локализуется в левом каудальном квадранте брюшной полости у большинства мышей независимо от пола животного.
  5. Используйте влажные ватные тампоны для мобилизации и мягкой экстериоризации подвздошной кишки, концевая часть которой (дистальный конец) прикреплена к голени(рисунок 1B).
  6. Разверните не менее 6 см терминальной подвздошной кишки на влажной ватной марле без нарушения работы брыжеечных сосудов и кровоснабжения. Кровоснабжение сохраняется, если нет кровотечения и ткань сохраняет свой розовый цвет(рисунок 1В).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пересыхания открытых тканей, поддерживая ткани влажными в любое время с помощью теплого HBSS (каждые 2 - 3 мин) с помощью шприца 10 мл, прикрепленного к желтой питательной трубке (шаг 1.1.6).
  7. Близко к голени определите основную артерию, снабжающую подвздошную кишечку в области жентерии. Затем найдите два участка перевязки в мезентерии, которые свободны от критических кровеносных сосудов.
  8. Используя тупые тканевые щипцы, крепко захватите терминальную подвздошную кищу (ближайшую к цапле, и с помощью тонких щипцов, фенестрируют мезентерию, избегая кровеносных сосудов. Наложите шелковый шов на перфорацию и завяжите хирургический узел, чтобы создать первую перевязку (дистальный конец петли).
  9. Используйте линейку для измерения 4 см от первой лигатуры и создания второй лигатуры (проксимального конца петли), как указано в шаге 2.8(рисунок 1C).
  10. Тонкими ножницами аккуратно разрезают рядом с каждой перевязкой, чтобы изолировать петлю подвздошной подвздошности 4 см, сохраняя неповрежденным кровоснабжение и брыжеечную оболочку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрежьте оба конца экстериорализованного сегмента iLoop, затем осторожно промыть в качестве необходимого шага, который предотвращает вмешательство в просветное содержимое (фекалии), тем самым облегчая равномерное рассеивание FITC-декстрана или хемотаксических стимулов по всей длине изолированного сегмента, а также позволяя более точно количественно определять лейкоциты с помощью проточной цитометрии. Эта процедура также позволяет равномерно растянуть слизистую оболочку после инъекции указанных объемов реагента и улучшить воспроизводимость между животными.
  11. Осторожно промыть содержимое сегмента петли подвздошной кисти теплым HBSS с помощью гибкой желтой питательной трубки, прикрепленной к шприцу 10 мл (см. шаг 1.1.6).
  12. Обрежьте два обрезанных конца промытой подвздошной петли шелковым швом.
  13. Используйте шприц 1 мл с иглой 30 г для медленного введения 250 мкл реагента, такого как FITC-декстран (шаг 4.2) или хемоцин (шаг 5.3) в просвет кишечника. Петля подвздошной кисти будет надуваться, вызывая умеренное растяжение слизистой оболочки(рисунок 1D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ввести реагент в просвет петли на противоположной стороне брыжеечной артерии. Будьте осторожны, чтобы не вытащить петлю подвздошной кишки из животного во время инъекции, чтобы избежать разрыва кровеносных сосудов и кровотечения.
  14. С помощью влажных ватных тампонов аккуратно отложите петлю подвздошной кишки, проксимальную подвздошную кишечку и цаплю.
  15. Используйте держатель иглы, анатомические щипцы и 3,0 нерассасывающиеся шелковые швы с обратной режущей иглой, чтобы закрыть брюшную стенку.
  16. Поместите животное в анестезионную камеру с регулируемой температурой на инкубационный период.

3. Генерация проксимальной петли толстой кишки (pcLoop)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о мышах, которые использовались для генерации pcLoop, см. информацию, представленную в начале раздела протокола.

  1. Выполните шаги 2.1. - 2.4. как описано выше для подвздошной петли.
  2. Используя влажные ватные тампоны, экстериоризируйте всю подвздошную кишечник и поместите ее поверх влажной ватной марли. Выявляют проксимальный комплекс толстой кишки и кровоснабжение, расположенное в мезоколоне. Мобилизовать проксимальную обику и с помощью тонких щипцов создать первую лигатуру в области, свободной от сосудов в мезоколоне на глубине около 0,5 см от цапли(рисунок 2B).
  3. Измерьте 2 см от первой лигатуры и создайте вторую лигатуру в области, свободной от кровоснабжения вмезоколоне (рисунок 2C).
  4. С помощью мелких ножниц аккуратно разрезайте рядом с каждой перевязкой, чтобы выделить 2 см длиной pcLoop.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как упоминалось в примечании к шагу 2.10, важно отрезать оба конца, чтобы изолировать pcLoop, который мягко очищается от просветного содержимого. Тщательно разрезайте ткани толстой кишки и мезоколон, чтобы предотвратить кровотечение мелких сосудов в просвет кишечника. При необходимости используют термоужайство для ограничения кровотечения в месте разреза.
  5. Осторожно промыть pcLoop теплым HBSS для удаления фекалий с помощью гибкой желтой питательной трубки, прикрепленной к шприцу 10 мл (см. шаг 1.1.6).
  6. Обрежьте два разрезанных конца промытого pcLoop с помощью шелкового шва.
  7. Используйте шприц 1 мл с иглой 30G для медленного введения 200 мкл реагента, такого как FITC-декстран (шаг 4.2) или хемоцин (шаг 5.3) в просвет кишечника. PcLoop будет раздуваться, вызывая умеренное растяжение слизистой оболочки(рисунок 2D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ввести реагент в просвет pcLoop на противоположной стороне брыжеечного сустава. Обеспечьте согласованность между животными и создайте pcLoop длиной 2 см, чтобы обеспечить равное растяжение слизистой оболочки.
  8. Используйте влажные ватные тампоны, чтобы аккуратно поместить обратно лигированный pcLoop, подвздошную кисть и цаплицу в брюшную полость.
  9. Используйте держатель иглы, анатомические щипцы и 3,0 нерассасывающиеся шелковые швы с обратной режущей иглой, чтобы закрыть брюшную стенку.
  10. Поместите животное в анестезионную камеру с регулируемой температурой на инкубационный период.

4. Количественная оценка кишечной проницаемости: 4 кДа FITC-декстрана

  1. Выполните подвздошную петлю или pcLoop (как описано выше).
  2. Используя шприц 1 мл с иглой 30 Г, вводят в просвет кишечника либо 250 мкл (подвздошная кишка - шаг 2,13), либо 200 мкл (толстая кишка - этап 3,7) 4 кДа раствора FITC-декстрана (1 мг/ мл в HBSS). Держите неиспользованный раствор FITC-декстрана защищенным от света, чтобы подготовить стандартную кривую после сбора сыворотки.
  3. Для петли подвздошной ки подвздошной подвздоши выполните шаги 2.14-2.16, для pcLoop шаги 3.8-3.10. Вкратце поместите органы и iLoop обратно на место в брюшную полость, закройте брюшную стенку.
  4. Поместите животное на 120 мин в нагретую анестезионную камеру.
  5. После инкубационного периода вскройте брюшную стенку, получите доступ к сердцу и выполните сердечную пункцию с помощью шприца 1 мл с иглой 25G для сбора крови. Перенесите кровь в 1,3 мл сывороточного активатора, аккуратно перемешайте и держите на льду защищенным от света. Соберите не менее 500 мкл крови на мышь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животные подвергаются эвтаназии при нахождении под наркозом с использованием физического метода, такого как обезглавливание или вывих шейки матки, и в соответствии с утвержденным протоколом для животных.
  6. Трубка активатора сгустка сыворотки центрифуги в течение 5 мин при 10 000 х г при комнатной температуре в соответствии с рекомендациями производителя. Соберите сыворотку (супернатант) и переложите в центрифужную трубку 1,7 мл. Держите трубку на льду и защищаемую от света.
  7. Количественная оценка флуоресценции в сыворотке крови
    1. Подготовьте стандартную кривую FITC-декстрана 4 кДа в сыворотке контрольных мышей (физиологического раствора или HBSS является допустимой альтернативой). Создают двукратное последовательное разведение с начальной концентрацией 1 мг/мл FITC-декстрана. Концентрации FITC-декстрана 4 кДа, которые измеряются, варьируются от 0,25 мг/мл до 2 мкг/мл.
    2. Перенесите равный объем образца и эталоны на черную 96-скважинную пластину (с плоским дном) и измерите FITC в считывателе флуоресцентных пластин (возбуждение 490 нм, излучение 520 нм), согласно инструкциям производителя и опубликованным протоколам33. Рассчитать концентрацию FITC на основе стандартной кривой или существующих значений проницаемости в виде изменения складки, нормализованного для экспериментальной контрольной группы.

5. Количественная оценка мигрировавого ПМН в просвет кишечника после внутрипросветной стимуляции хемокинами

ПРИМЕЧАНИЕ: Очень немногие ПМН находятся в слизистой оболочке кишечника на исходном уровне. Предварительная обработка животных провоспалительными цитокинами приводит к воспалительной среде, которая облегчает рекрутинг ПМН из кровотока в слизистую оболочку кишечника.

  1. Используя шприц объемом 1 мл с иглой 30 г, выполните внутрибрюшинную (т.п.) инъекцию стерильного раствора 100 нг фактора некроза опухоли α (TNFα) и 100 нг интерферона-γ (INFγ) в 200 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
  2. Через 4 - 24 ч предварительной обработки провоспалительными цитокинами выполняют подвздошную петлю или pcLoop (как описано выше).
  3. Используя шприц 1 мл с иглой 30 Г, вводят в просвет кишечника либо 250 мкл (подвздошная кишка - шаг 2,13), либо 200 мкл (толстая кишка - шаг 3,7) раствора химиоаттрактанта Лейкотриена B4 (LTB4)1 нМ в HBSS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лейкотриен B4 (LTB4)используется в этом протоколе в качестве мощного химиоатрактанта для PMN. Другие хемоаттрактанты, такие как N-формилметионил-лейцил-фенилаланин (fMLF) или хемокина (мотив C-X-C) лиганд 1 (CXCL1 / KC), также могут быть использованы для индуцирования значительного набора PMN в просвет толстой кишки30.
  4. Для подвздошного цикла выполните шаги с 2.14 по 2.16. Для pcLoop выполните шаги с 3.8 по 3.10. Вкратце поместите органы и iLoop обратно на место в брюшную полость, закройте брюшную стенку.
  5. Поместите животное на 60 мин в нагретую анестезионную камеру.
  6. Сбор содержимого кишечной петли
    1. Готовьте растворы и храните на льду: Для подвздошной петли и pcLoop подготовьте промывной буфер, содержащий 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 5 мМ дитиотрейтола (DTT) и 2% FBS в стерильном PBS без кальция и магния.
    2. После инкубационного периода и под наркозом вскрывает брюшную стенку и вытаскивает iLoop (подвздошная петля или pcLoop). Усыпляет животных, находясь под наркозом, используя физический метод, такой как обезглавливание или вывих шейки матки, и в соответствии с утвержденным протоколом для животных.
    3. Промойте петлю холодным PBS, чтобы удалить любые остаточные загрязнители крови и поглотить избыток PBS с помощью салфеток для тканей. Тщательно соберите содержимое петли в центрифужную трубку 1,7 мл (около 250 мкл для подвздошной петли и 200 мкл для pcLoop). Промыть петлю буфером холодной промывки 500 мкл и сразу после сбора поместить трубку на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: DTT помогает растворять слизь. Если содержание люмина iLoop очень вязкое (в зависимости от генетического фона мыши), разбавьте его 1:2 или 1:3 моющим буфером, содержащим DTT.
    4. Пропустите раствор с содержанием просвета через фильтр нейлоновой сетки 35 мкм с помощью трубки круглого дна емкостью 5 мл с крышкой клеточного сетчатого фильтра. Этот шаг помогает удалить фрагменты тканей и клеточные агрегаты. Промыть клеточный ситечко 1 мл промывочного буфера.
    5. Центрифужная трубка при 400 х г в течение 5 мин при 4 °C. Откажитесь от супернатанта, промывайте гранулы 500 мкл - 1 мл промывочным буфером, затем центрифугой при 400 х г в течение 5 мин, 4 °С.
    6. Повторное суспендирование гранулы просветных клеток iLoop в 200 мкл проточная цитометрическая буферная (FCB), содержащая 2% FBS в стерильном PBS без кальция и магния. Клетки могут храниться в трубке или переноситься на 96-скважинную круглодонную пластину для окрашивания и анализа проточной цитометрии.
  7. Окрашивание и анализ проточной цитометрии
    1. Контроль компенсации: лейкоциты
      1. Приготовьте шприц 1 мл с иглой 25 г, предварительно заполненной стерильным 0,5 М ЭДТА (рН 8,0). 10% ЭДТА на ожидаемый объем крови (100 мкл ЭДТА на 1 мл крови).
      2. Собирать кровь под наркозом путем пункции сердца. Переложить кровь в пробирку 1,7 мл, затем центрифугу при 400 х г в течение 10 мин, 4 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Пока мышь находится под наркозом, используйте физический метод для подтверждения смерти в соответствии с утвержденным протоколом животных (например, вывих шейки матки).
      3. Аспирировать супернатанта. Повторно суспендируют гранулы в 1 мл буфера лизиса аммония-хлорида-калия (ACK) для лизиса эритроцитов. Инкубировать 3 мин - 5 мин на льду. Центрифуга 400 х г в течение 5 мин, 4 °C. Если гранула все еще красная, повторяйте этот этап буфера лизиса ACK до тех пор, пока гранула не станет белой.
      4. Повторно суспендируют гранулу в 1 мл FCB и пластину 0,5 x 106- 1 x 106 ячеек на скважину. Подготовьте пять скважин из 96-скважинной круглодонной плиты. Поместите тарелку на лед.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ту же 96-скважинную пластину, которая содержит просветное содержимое петли (см. шаг 5.6.6).
    2. Окрашивание проточной цитометрией
      1. Центрифугировать 96-скважинную пластину в течение 5 мин при 400 х г,4 °C. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулы с 50 мкл очищенного крысиного антимышеского CD16/CD32 в виде Fc-блока (1 мкг на 100 мкл FCB). Инкубировать 5 мин - 10 мин на льду.
      2. Иммуноокрашивание содержания люминалов iLoop: Приготовьте смесь, содержащую все фторхром-конъюгированные антитела (разведение 1:50 в FCB): анти-CD45-PerCP, анти-CD11b-PE и анти-Ly-6G-Alexa Fluor 647. Добавьте 50 мкл комбинации на скважину для конечного объема 100 мкл.
      3. Иммуноокрашивание белых кровяных клеток для компенсации (разведение 1:50 в FCB): Используйте 50 мкл только FCB (незапятнанный образец, хорошо 1), 50 мкл каждого отдельного фторхром-конъюгированного антитела (скважины 2 - 4), 50 мкл комбинации всех фторхром-конъюгированных антител (хорошо 5). Конечный объем 100 мкл.
      4. Инкубировать плиту в течение 30 мин на льду, защищенном от света.
      5. Центрифугировать пластину в течение 5 мин при 400 х г,4 °C. Откажитесь от супернатанта и промыть 200 мкл FCB. Повторите этот шаг стирки дважды.
      6. Добавьте FCB 150 мкл/хорошо к образцам крови.
      7. Добавьте 100 мкл/скважину FCB к образцу просветного содержания iLoop. Затем 50 мкл/скважина флуоресцентных счетных шариков.
    3. Анализ проточной цитометрии
      1. Затвор для положительных событий CD45 и для выражения Ly-6G-/Gr-1 и CD11b30.
      2. Используйте 100 мкл объема образца в качестве условия остановки.
      3. Рассчитайте абсолютное число PMN, которое мигрировало в просвет iLoop, следуя информации, предоставленной производителем флуоресцентных счетных шариков.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть представлены в виде (1) общего числа ПМН в просвете30,34,35,(2) числа ПМН на грамм ткани, а также (3) числа ПМН намм3 с использованием формулы для объема цилиндра: V= π(pi) r 2 ч (V для объема, r для радиуса и h для высоты).

Результаты

Схематическое представление моделей петли подвздошной кисти и pcLoop изображено на рисунке 1 и рисунке 2соответственно. Анатомические снимки отображают критические этапы процедуры, включая экстериоризацию кишечного сегмента(Фиг.1В и <...

Обсуждение

Механизмы, ответственные за дисрегуляцию кишечной барьерной функции и рекрутирование иммунных клеток в патологических условиях, таких как ВЗК, изучены не полностью. Здесь мы подробно описываем надежную модель мышениц in vivo, которая использует хорошо васкуляризованный экстериоризован...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят доктора Свена Флемминга из Университета Вюрцбурга за его вклад в создание модели проксимальной петли толстой кишки, Шона Уотсона за управление колониями мышей и Читру К. Муралидхаран за помощь в приобретении изображений модели iLoop. Эта работа была поддержана Немецким исследовательским фондом/DFG (BO 5776/2-1) в KB, R01DK079392, R01DK072564 и R01DK061379 в C.A.P.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment and Material
BD Alcohol SwabsBD326895
BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8"BD305122
BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2"BD305106
BD 1ml Tuberculin Syringe Without NeedleBD309659
15ml Centrifuge TubeCorning14-959-53A
Corning 96-Well Solid Black Polystyrene MicroplateFisherScientific07-200-592
Corning Non-treated Culture Dish, 10cmMilliporeSigmaCLS430588
Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterileFisherScientific25806 2WC
Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2"Medex3249-1
EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units)E-Z SystemsEZ-7000
Falcon Centrifuge Tube 50ml VWR21008-940
Fisherbrand Colored Labeling TapeFisherScientific15-901-10R
Halsey Needle Holder (needle holder) FST12001-13
Kimwipes, small (tissue wipe)FisherScientific06-666
1.7ml Microcentrifuge Tubes Thomas Scientific c2170
Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube)Sarstedt 41.1501.105
Moria Fine ScissorsFST14370-22
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh)Falcon352235
Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular LubricantDechra12920060
Ring Forceps (blunt tissue forceps)FST11103-09
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YDFisherScientificNC9452680
Semken Forceps (anatomical forceps)FST1108-13
Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting HenryScheinSS694
Student Fine Forceps, AngledFST91110-10
10ml Syringe PP/PE without needleMillipore Sigma Z248029
96 Well Cell Culture PlateCorning3799
Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mmInstechFTP-20-30
Solutions and Buffers
Accugene 0.5M EDTALonza51201
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing BufferBioWhittaker10-548E
Hanks' Balanced Salt SolutionCorning21-023-CV
Phosphate-Buffered Saline without Calcium and MagnesiumCorning21-040-CV
Reagents
Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8)BioLegend127610
CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70)ThermoFisher12-0112-81
CountBright Absolute Counting BeadsInvitrogenC36950
DithiotreitolFisherScientificBP172-5
Fetal Bovine Serum, heat inactivatedR&D Systems511550
Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000Sigma60842-46-8
IsofluraneHalocarbon12164-002-25
Leukotriene B4Millipore Sigma71160-24-2
PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11)BD Pharmingen557235
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block)BD Bioscience553142
Recombinant Murine IFN-γPeprotech315-05
Recombinant Murine TNF-αPeprotech315-01A

Ссылки

  1. Olson, T. S., et al. The primary defect in experimental ileitis originates from a nonhematopoietic source. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 541-552 (2006).
  2. Jump, R. L., Levine, A. D. Mechanisms of natural tolerance in the intestine: implications for inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 10 (4), 462-478 (2004).
  3. Peeters, M., et al. Clustering of increased small intestinal permeability in families with Crohn's disease. Gastroenterology. 113 (3), 802-807 (1997).
  4. Michielan, A., D'Inca, R. Intestinal permeability in inflammatory bowel disease: Pathogenesis, clinical evaluation, and therapy of leaky gut. Mediators of Inflammation. 2015, 628157 (2015).
  5. Chin, A. C., Parkos, C. A. Neutrophil transepithelial migration and epithelial barrier function in IBD: potential targets for inhibiting neutrophil trafficking. Annals of the New York Academy of Sciences. 1072, 276-287 (2006).
  6. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
  7. Ordás, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
  8. Muthas, D., et al. Neutrophils in ulcerative colitis: A review of selected biomarkers and their potential therapeutic implications. Scandanavian Journal of Gastroenterology. 52 (2), 125-135 (2017).
  9. Pai, R. K., et al. The emerging role of histologic disease activity assessment in ulcerative colitis. Gastrointestinal Endoscopy. 88 (6), 887-898 (2018).
  10. Parkos, C. A., Delp, C., Arnaout, M. A., Madara, J. L. Neutrophil migration across a cultured intestinal epithelium. Dependence on a CD11b/CD18-mediated event and enhanced efficiency in physiological direction. The Journal of Clinical Investigation. 88 (5), 1605-1612 (1991).
  11. Brazil, J. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil-epithelial interactions. Immunological Reviews. 273 (1), 94-111 (2016).
  12. Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterology. 19 (1), 98 (2019).
  13. Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
  14. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  15. Fan, S., et al. Role of JAM-A tyrosine phosphorylation in epithelial barrier dysfunction during intestinal inflammation. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 566-578 (2019).
  16. Parkos, C. A. Neutrophil-epithelial interactions: A double-edged sword. American Journal of Pathology. 186 (6), 1404-1416 (2016).
  17. Volynets, V., et al. Assessment of the intestinal barrier with five different permeability tests in healthy C57BL/6J and BALB/cJ mice. Digital Diseases and Sciences. 61 (3), 737-746 (2016).
  18. Wick, M. J., Harral, J. W., Loomis, Z. L., Dempsey, E. C. An optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (139), e57037 (2018).
  19. Tateishi, H., Mitsuyama, K., Toyonaga, A., Tomoyose, M., Tanikawa, K. Role of cytokines in experimental colitis: relation to intestinal permeability. Digestion. 58 (3), 271-281 (1997).
  20. Mei, Q., Diao, L., Xu, J. M., Liu, X. C., Jin, J. A protective effect of melatonin on intestinal permeability is induced by diclofenac via regulation of mitochondrial function in mice. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (4), 495-502 (2011).
  21. Vargas Robles, H., et al. Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55095 (2017).
  22. Arques, J. L., et al. Salmonella induces flagellin- and MyD88-dependent migration of bacteria-capturing dendritic cells into the gut lumen. Gastroenterology. 137 (2), 579-587 (2009).
  23. Coombes, B. K., et al. Analysis of the contribution of Salmonella pathogenicity islands 1 and 2 to enteric disease progression using a novel bovine ileal loop model and a murine model of infectious enterocolitis. Infection and Immunity. 73 (11), 7161-7169 (2005).
  24. Everest, P., et al. Evaluation of Salmonella typhimurium mutants in a model of experimental gastroenteritis. Infection and Immunity. 67 (6), 2815-2821 (1999).
  25. Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infection and Immunity. 66 (2), 747-755 (1998).
  26. Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2702-2715 (2005).
  27. Palmblad, J., et al. Leukotriene B4 is a potent and stereospecific stimulator of neutrophil chemotaxis and adherence. Blood. 58 (3), 658-661 (1981).
  28. Mandell, K. J., Babbin, B. A., Nusrat, A., Parkos, C. A. Junctional adhesion molecule 1 regulates epithelial cell morphology through effects on beta1 integrins and Rap1 activity. The Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 11665-11674 (2005).
  29. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
  30. Flemming, S., Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. Analysis of leukocyte transepithelial migration using an in vivo murine colonic loop model. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (20), (2018).
  31. Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. JAM-related proteins in mucosal homeostasis and inflammation. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 211-226 (2014).
  32. Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Lab Animal. 44 (4), 329-336 (2010).
  33. JoVE Science Education Database. Introduction to the Microplate Reader. Journal of Visualized Experiments. , e5024 (2020).
  34. Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
  35. Azcutia, V., et al. Neutrophil expressed CD47 regulates CD11b/CD18-dependent neutrophil transepithelial migration in the intestine in vivo. Mucosal Immunology. , (2020).
  36. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PloS One. 11 (3), 0150606 (2016).
  37. Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
  38. Ebnet, K. Junctional Adhesion Molecules (JAMs): Cell adhesion receptors with pleiotropic functions in cell physiology and development. Physiological Reviews. 97 (4), 1529-1554 (2017).
  39. Sorribas, M., et al. FXR modulates the gut-vascular barrier by regulating the entry sites for bacterial translocation in experimental cirrhosis. Journal of Hepatology. 71 (6), 1126-1140 (2019).
  40. Mazzucco, M. R., Vartanian, T., Linden, J. R. In vivo Blood-brain Barrier Permeability Assays Using Clostridium perfringens Epsilon Toxin. Bio-Protocol. 10 (15), 3709 (2020).
  41. Kelly, J. R., et al. Breaking down the barriers: the gut microbiome, intestinal permeability and stress-related psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 392 (2015).
  42. Fiorentino, M., et al. Blood-brain barrier and intestinal epithelial barrier alterations in autism spectrum disorders. Molecular Autism. 7 (1), 49 (2016).
  43. Kelm, M., et al. Regulation of neutrophil function by selective targeting of glycan epitopes expressed on the integrin CD11b/CD18. FASEB Journal : An Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (2), 2326-2343 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

168FITC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены