In Vitro E3 Ubiquitin Ligase fonksiyonunun analizi

Özet

Bu çalışma, E3 ubiquitin ligase katalitik aktivitesinin analizi için ayrıntılı in vitro ubiquitylation tahlil protokolleri sunmaktadır. Rekombinant proteinler Escherichia coli kültürü gibi prokaryotik sistemler kullanılarak ifade edildi.

Özet

Ubiquitin'in (Ub) substrat proteininin iç lizin kalıntılarına, her yerde bulunan bir işlem olarak adlandırılan bir işleme bağlanması, ökaryotik organizmalardaki en önemli çeviri sonrası değişikliklerden birini temsil eder. Her yerde bulunan, ubiquitin aktive edici enzimler (E1 enzimleri), ubiquitin-konjugating enzimleri (E2 enzimleri) ve ubiquitin ligazları (E3 enzimleri) ve bazen de ubiquitin zinciri uzama faktörleri (E4 enzimleri) dahil olmak üzere üç enzim sınıfından oluşan sıralı bir basamaklama ile aracılık edilir. Burada, E3 ubiquitin ligaz aktivitesinin değerlendirilmesine, E2-E3 çiftleri arasındaki işbirliğine ve substrat seçimine olanak sağlayan her yerde bulunan tahliller için in vitro protokoller sağlanmaktadır. İşbirliği yapan E2-E3 çiftleri, ücretsiz poli-ubiquitin zincirlerinin ve/veya E3 ligase'in otomatik olarak her yerde bulunmasına dikkat edilerek taranabilir. Substrat her yerde bulunan, E3 ligazın seçici bağlanması ile tanımlanır ve in vitro reaksiyonun batı lekesi ile tespit edilebilir. Ayrıca, fonksiyonel E2-E3 işbirliğinin doğrudan değerlendirilmesi için yararlı bir araç olan bir E2 ~ Ub deşarj tahlilleri açıklanmıştır. Burada, E3 bağımlı ubiquitin transferi, ilgili E2 enziminden serbest lizin amino asitlerine (her yerde bulunan substratı taklit eden) veya E3 ligazının iç lizinlerine (otomatik her yerde bulunan) takip edilir. Sonuç olarak, E3 ligaz katalitik işlevselliğini ele almak için hızlı ve gerçekleştirilmesi kolay üç farklı in vitro protokol sağlanmaktadır.

Giriş

Ubiquitylation, Ub'in bir substrat proteinine birlikte bağlandığı süreçtir¹. Ub modifikasyonu, üç farklı enzim sınıfının, yaniUb aktive edici enzimlerin (E1'ler), Ub-konjugating enzimlerinin (E2s), Ub ligases (E3s) ve muhtemelen Ub zincir uzama faktörlerinin (E4s)^2,3,4^,5'inetkisini içeren ardışık enzymatic reaksiyonlarla katalizöre edilir. Adenozin trifosfat (ATP)- ve magnezyumdan (Mg²⁺)- Ub'un E1 tarafından bağımlı aktivasyonundan sonra, E1'in aktif bölge sisteini Ub'un C terminali glisinine saldı

Protokol

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması

NOT: Laboratuvarda manuel olarak hazırlanan tamponlar ve reaktifler aşağıda listelenmiştir. Protokollerde kullanılan diğer tüm tamponlar ve reaktifler farklı kaynaklardan satın alınmış ve üreticilerin talimatlarına göre kullanılmıştır.

1. 10x fosfat tamponlu salin (10x PBS) hazırlayın. Bu amaçla, karışım 1.37 M sodyum klorür (NaCl), 27 mM potasyum klorür (KCl), 80 mM disodiyum-hidrojen-fosfat dihidrat (Na₂HPO_4.2H₂O) ve 20 mM potasyum-dihidrojen fosfat (KH₂PO_{4) 1}L çift damıtılmış H₂O (ddH₂O). 10x PBS'yi otomatik ola

Sonuçlar

Ubiquitin ligase CHIP ile işbirliği yapan E2 enzimlerini tanımlamak için, bir dizi E2 adayı bireysel in vitro her yerde ortaya çıkan reaksiyonlarda test edildi. İşbirliği yapan E2-E3 çiftleri, E3 bağımlı her yerde bulunan ürünlerin oluşumu, yaniE3 ligazının otomatik olarak her yerde bulunması ve serbest Ub polimerlerinin oluşumu ile izlendi. Her yerde bulunan ürünler batı şişkinliği ile analiz edildi. Veri yorumlama, elde edilen protein bantlarının moleküler ağırlık beli...

Tartışmalar

Bu makalede E3 ligaz fonksiyonunun analizi için temel in vitro her yerde bulunma yöntemleri açıklanmaktadır. In vitro her yerde tahlili tahlilleri yapılırken, bazı E2 enzimlerinin aktif sitsteinlerinin aktif bölgeye yakın bulunan kendi lizin kalıntılarına saldırması nedeniyle otomatik her yerde bulunma gerçekleştirebileceği düşünülmelidir³⁰. Bu sorunu atlatmak için, ilgili lizin kalıntısının arginin ile değiştirildiği bir E2 mutantının kullanılmas...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amershan Protran 0.1 µm NC	GE Healthcare	10600000	nitrocellulose membrane
Anti-CHIP	Cell Signaling	2080	Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6
Anti-MYC	Roche	OP10	Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10
Anti-ubiquitin	Upstate	05-944	Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11
Apyrase	Sigma	A6535-100UN
ATP (10x)	Enzo	12091903
BSA	Sigma	A6003-10G
EDTA	Roth	8043.2
KCl	Roth	6781.1
K2HPO4	Roth	P749.2
KH2PO4	Roth	3904.1
LDS sample buffer (4x)	novex	B0007
L-Lysine	Sigma	L5501-5G
MES	Roth	4256.4
MeOH	VWR Chemicals	2,08,47,307	100%
Milchpulver	Roth	T145.3
NaCl	Roth	P029.3
NuPAGE Antioxidant	invitrogen	NP0005
NuPAGE Transfer buffer (20x)	novex	NP0006-1
Page ruler plus	Thermo Fisher	26619	Protein ladder
RotiBlock	Roth	A151.1	Blocking reagent
SDS (20%)	Roth	1057.1
S1000 Thermal Cycler	Bio Rad	1852196
Trans-Blot Turbo	Bio Rad	1704150EDU	Transfer system
Tris base	Roth	4855.3
Tween 20	Roth	9127.2
UbcH Enzyme Set	BostonBiochem	K-980B	E2 enzymes
Ubiquitin	BostonBiochem	U-100H
Ubiquitin-activating enzyme E1	Enzo	BML-UW941U-0050
Ubiquitylation buffer (10x)	Enzo	BML-KW9885-001
Whatman blotting paper	Bio Rad	1703969	Extra thick filter paper