Controllo della geometria cellulare attraverso il micropatterning laser assistito a infrarossi

Riepilogo

Il protocollo qui presentato consente la fabbricazione automatizzata di micropattern che standardizzano la forma cellulare per studiare le strutture citoscheletriche all'interno delle cellule di mammifero. Questa tecnica di facile utilizzo può essere impostata con sistemi di imaging disponibili in commercio e non richiede apparecchiature specializzate inaccessibili ai laboratori standard di biologia cellulare.

Abstract

Il micropatterning è una tecnica consolidata nella comunità della biologia cellulare utilizzata per studiare le connessioni tra la morfologia e la funzione dei compartimenti cellulari, aggirando al contempo le complicazioni derivanti dalle variazioni naturali da cellula a cellula. Per standardizzare la forma delle celle, le celle sono confinate in stampi 3D o controllate per la geometria adesiva attraverso isole adesive. Tuttavia, le tradizionali tecniche di micropatterning basate sulla fotolitografia e sull'incisione UV profonda dipendono fortemente da camere pulite o attrezzature specializzate. Qui presentiamo una tecnica di micropatterning assistita da laser a infrarossi (microfotomodellazione) modificata da Doyle et al. In questo protocollo, utilizziamo un sistema di imaging Nikon A1R MP+ per generare micropattern con precisione micron attraverso un laser a infrarossi (IR) che abla regioni preimpostate su coverlip rivestite in poli vinile alcool. Utilizziamo uno script personalizzato per consentire la fabbricazione automatizzata di pattern con alta efficienza e precisione in sistemi non dotati di autofocus hardware. Mostriamo che questo protocollo di micropatterning assistito da laser IR (microfotomodellazione) si traduce in modelli definiti a cui le cellule si attaccano esclusivamente e prendono la forma desiderata. Inoltre, i dati provenienti da un gran numero di celle possono essere mediati a causa della standardizzazione della forma cellulare. I modelli generati con questo protocollo, combinati con l'imaging ad alta risoluzione e l'analisi quantitativa, possono essere utilizzati per schermi di velocità effettiva relativamente elevati per identificare i lettori molecolari che mediano il legame tra forma e funzione.

Introduzione

La forma cellulare è un fattore determinante dei processi biologici fondamentali come la morfogenesi tissutale^1,la migrazione^{cellulare 2,}la proliferazione^{cellulare 3}e l'espressione genica⁴. I cambiamenti nella forma cellulare sono guidati da un intricato equilibrio tra riarrangiamenti dinamici del citoscheletro che deforma la membrana plasmatica e fattori estrinseci come le forze esterne esercitate sulla cellula e la geometria delle aderenze cellulare-cella e matrice cellulare⁵. La migrazione delle cellule mesenchimali, ad esempio, polimerizza una fi....

Protocollo

1. Pre-elaborazione delle labbra

1. Preparare coverlips puliti come descritto in Waterman-Storer, 1998²⁵.
2. Preparare l'1% (3-amminopropil)soluzione di trimetossisilano (APTMS) e incubare i coprispavimenti nella soluzione per 10 minuti con agitazione delicata. Assicurarsi che le coverlips si muovano liberamente nella soluzione.
3. Lavare le copertine due volte con dH₂O per 5 minuti ciascuna.
4. Preparare la soluzione di glutaraldeide (GA) allo 0,5% e incubare i coprispacchi nella soluzione per 30 minuti su uno shaker. Per 25 coverlips, utilizzare 50 mL di soluzione di glutaraldeide. Assicurarsi che le cov....

Risultati

La qualità dei dati sperimentali ottenuti attraverso il micropatterning dipende in larga misura dalla qualità dei modelli. Per determinare la qualità dei modelli generati con il metodo precedente, abbiamo usato per la prima volta la microscopia a riflettanza per valutare la forma e le dimensioni delle aree foto ablate del coverslip. Abbiamo scoperto che ogni singolo modello sembrava molto simile alla maschera di ablazione e mostrava le bacheche chiare e una superficie che rifletteva la luce uniformemente (

Discussione

I risultati di cui sopra dimostrano che il protocollo di micropatterning assistito da laser a infrarossi (microfotopatterning) descritto fornisce modelli aderenti riproducibili di varie forme che consentono la manipolazione della forma cellulare e dell'architettura citoscheletricha. Sebbene siano stati sviluppati numerosi metodi di micropatterning sia prima che dopo il debutto del microfotomodello, questo metodo possiede diversi vantaggi. In primo luogo, non richiede attrezzature specializzate e camere pulite che di soli.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane	Aldrich	281778
10 cm Cell Culture Dish	VWR	10062-880	Polysterene, TC treated, vented
25X Apo LWD Water Dipping Objective	Nikon	MRD77225
3.5 cm Cell Culture Dish	VWR	10861-586	Polysterene, TC treated, vented
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	Thermo	62248	1mg/mL dihydrochloride solution
Bovine Serine Albumin	BioShop	ALB005
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Wisent	311-425-CL
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Fibronectin	Sigma-Aldrich	FC010	1mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin Antibody	BD	610077	Mouse
Fiji	ImageJ		Version 1.53c
Fluorescent Phalloidin	Invitrogen	A12380	568nm
Glass Coverslip	VWR	16004-302	22 × 22 mm
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16220	25% aqueous solution
Hydrochloric Acid	Caledon	6025-1-29	37% aqueous solution
IR Laser	Coherent	Chameleon Vision
Minimal Essential Medium α	Gibco	12561-056
Mounting Medium	Sigma	F4680
Mouse Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Goat, 488nm
Multi-Photon Microscope	Nikon	A1R MP+
Myosin Light Chain Antibody	Cell Signaling Technology	3672S	Rabbit
NIS Elements	Nikon		Version 5.21.03
Nitric Acid	Caledon	7525-1-29	70% aqueous solution
Photoshop	Adobe		Version 21.2.1
Pluronic F-127	Sigma	P2443	Powder
Poly(vinyl alchohol)	Aldrich	341584	MW 89000-98000, 98% hydrolyzed
Rabbit Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4412S	Goat, 488nm
Shaker	VWR	10127-876	Alsoknown as analog rocker
Sodium Borohydride	Aldrich	452882	Powder
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	Powder
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S5011	Powder
Spyder	Anaconda	4.1.4
Trypsin	Wisent	325-042-CL	0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA