Controle da Geometria Celular através de Micropatterning Assistido por Laser Infravermelho

Summary

O protocolo aqui apresentado permite a fabricação automatizada de micropatterns que padronizam a forma celular para estudar estruturas citoesquelletais dentro de células de mamíferos. Esta técnica fácil de usar pode ser configurada com sistemas de imagem disponíveis comercialmente e não requer equipamentos especializados inacessíveis aos laboratórios de biologia celular padrão.

Abstract

O micropatterning é uma técnica estabelecida na comunidade de biologia celular usada para estudar conexões entre a morfologia e a função dos compartimentos celulares, contornando complicações decorrentes de variações naturais célula-célula. Para padronizar a forma celular, as células são confinadas em moldes 3D ou controladas para geometria adesiva através de ilhas adesivas. No entanto, técnicas tradicionais de micropattering baseadas na fotolitografia e gravura UV profunda dependem fortemente de salas limpas ou equipamentos especializados. Aqui apresentamos uma técnica de micropatterning assistida por laser infravermelho (microfotopatterning) modificada a partir de Doyle et al. que pode ser convenientemente configurada com sistemas de imagem disponíveis comercialmente. Neste protocolo, usamos um sistema de imagem Nikon A1R MP+ para gerar micropatterns com precisão de mícula através de um laser infravermelho (IR) que abla regiões predefinidas em tampas revestidas de álcool poli-vinil. Empregamos um script personalizado para permitir a fabricação automatizada de padrões com alta eficiência e precisão em sistemas não equipados com um foco automático de hardware. Mostramos que este protocolo de micropatterning assistido a laser IR (microfotopatterning) resulta em padrões definidos aos quais as células se conectam exclusivamente e assumem a forma desejada. Além disso, dados de um grande número de células podem ser mediados devido à padronização da forma celular. Padrões gerados com este protocolo, combinados com imagens de alta resolução e análise quantitativa, podem ser usados para telas de rendimento relativamente altas para identificar jogadores moleculares mediando a ligação entre forma e função.

Introduction

A forma celular é um determinante fundamental de processos biológicos fundamentais, como morfogênese^{tecidual 1,}migração celular^2,proliferação celular³e expressão genética⁴. As mudanças na forma celular são impulsionadas por um intrincado equilíbrio entre rearranjos dinâmicos do citoesqueleto que deforma a membrana plasmática e fatores extrínsecos, como forças externas exercidas sobre a célula e a geometria das aderências celular-célula e matriz celular⁵. Migrando células mesenquimais, por exemplo, polimeriza uma densa rede de actina na borda principa....

Protocol

1. Pré-processamento de clipes de cobertura

1. Prepare tampas limpas como descrito em Waterman-Storer, 1998²⁵.
2. Prepare 1% (3-aminopropil)trimethoxysilane (APTMS) solução e incubar as tampas na solução por 10 minutos com agitação suave. Certifique-se de que as tampas se movam livremente na solução.
3. Lavar tampas duas vezes com dH₂O por 5 min cada.
4. Prepare a solução de glutaraldeído (GA) de 0,5% e incubar as tampas na solução por 30 min em.......

Discussion

Os resultados acima demonstram que o protocolo de micropatterse assistida por laser IR (microfotopatterning) fornece padrões aderentes reprodutíveis de várias formas que permitem a manipulação da forma celular e da arquitetura citoesquelletal. Embora inúmeros métodos de micropatterning tenham sido desenvolvidos antes e depois da estreia da microfotopatterning, este método possui várias vantagens. Em primeiro lugar, não requer equipamentos especializados e salas de limpeza que geralmente são encontradas apenas .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane	Aldrich	281778
10 cm Cell Culture Dish	VWR	10062-880	Polysterene, TC treated, vented
25X Apo LWD Water Dipping Objective	Nikon	MRD77225
3.5 cm Cell Culture Dish	VWR	10861-586	Polysterene, TC treated, vented
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	Thermo	62248	1mg/mL dihydrochloride solution
Bovine Serine Albumin	BioShop	ALB005
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Wisent	311-425-CL
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Fibronectin	Sigma-Aldrich	FC010	1mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin Antibody	BD	610077	Mouse
Fiji	ImageJ		Version 1.53c
Fluorescent Phalloidin	Invitrogen	A12380	568nm
Glass Coverslip	VWR	16004-302	22 × 22 mm
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16220	25% aqueous solution
Hydrochloric Acid	Caledon	6025-1-29	37% aqueous solution
IR Laser	Coherent	Chameleon Vision
Minimal Essential Medium α	Gibco	12561-056
Mounting Medium	Sigma	F4680
Mouse Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Goat, 488nm
Multi-Photon Microscope	Nikon	A1R MP+
Myosin Light Chain Antibody	Cell Signaling Technology	3672S	Rabbit
NIS Elements	Nikon		Version 5.21.03
Nitric Acid	Caledon	7525-1-29	70% aqueous solution
Photoshop	Adobe		Version 21.2.1
Pluronic F-127	Sigma	P2443	Powder
Poly(vinyl alchohol)	Aldrich	341584	MW 89000-98000, 98% hydrolyzed
Rabbit Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4412S	Goat, 488nm
Shaker	VWR	10127-876	Alsoknown as analog rocker
Sodium Borohydride	Aldrich	452882	Powder
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	Powder
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S5011	Powder
Spyder	Anaconda	4.1.4
Trypsin	Wisent	325-042-CL	0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA