Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Протокол, представленный здесь, позволяет автоматизировать изготовление микроструктур, которые стандартизируют форму клеток для изучения цитоскелетных структур в клетках млекопитающих. Этот удобный для пользователя метод может быть установлен с коммерчески доступными системами визуализации и не требует специализированного оборудования, недоступного для стандартных лабораторий клеточной биологии.
Микроструктурирование является признанным методом в сообществе клеточной биологии, используемым для изучения связей между морфологией и функцией клеточных компартментов, обходя осложнения, возникающие из естественных вариаций между клетками. Чтобы стандартизировать форму ячеек, клетки либо заключены в 3D-формы, либо контролируются для адгезивной геометрии через адгезивные острова. Однако традиционные методы микроструктурирования, основанные на фотолитографии и глубоком УФ-травлении, сильно зависят от чистых помещений или специализированного оборудования. Здесь мы представляем инфракрасную лазерную технику микроструктурирования (микрофотопаттернинг), модифицированную от Doyle et al., которая может быть удобно настроена с помощью коммерчески доступных систем визуализации. В этом протоколе мы используем систему визуализации Nikon A1R MP+ для генерации микроструктур с микронными прецизиями с помощью инфракрасного (ИК) лазера, который аблационирует заданные области на покрытых поливиниловым спиртом покровах. Мы используем пользовательский скрипт для обеспечения автоматизированного изготовления шаблонов с высокой эффективностью и точностью в системах, не оснащенных аппаратным автофокусом. Мы показываем, что этот протокол микроструктурирования (микрофотопа) с помощью ИК-лазера приводит к определенным паттернам, к которым клетки прикрепляются исключительно и принимают желаемую форму. Кроме того, данные из большого количества ячеек могут быть усреднены из-за стандартизации формы клеток. Паттерны, генерируемые с помощью этого протокола, в сочетании с изображениями с высоким разрешением и количественным анализом, могут использоваться для экранов с относительно высокой пропускной способностью для идентификации молекулярных игроков, опосредованных связью между формой и функцией.
Форма клетки является ключевым фактором, определяющим фундаментальные биологические процессы, такие как морфогенез тканей1,миграция клеток2,пролиферация клеток3и экспрессия генов4. Изменения формы клеток обусловлены сложным балансом между динамическими перестройками цитоскелета, который деформирует плазматическую мембрану, и внешними факторами, такими как внешние силы, возлагаемые на клетку, и геометрией клеточно-клеточных и клеточно-матричных спаек5. Мигрирующие мезенхимальные клетки, например, полимеризуют плотную актиновую сеть на переднем крае, которая выталкивает плазматическую мембрану вперед и создает широкую ламеллиподию6,в то время как сократимость актиозина втягивает узкий задний край клетки, чтобы отсоединить клетку от ее текущего положения7,8. Нарушение сигнальных событий, которые порождают такие специализированные цитоскелетные структуры, нарушает форму и полярность и замедляет миграцию клеток9. Кроме того, изгиб эпителиального листа во время гаструляции требует апикального сужения на основе актомиозина, что приводит к тому, что клетки и их соседи становятся клиновидными10. Хотя эти исследования подчеркивают важность формы клеток, присущая им гетерогенность в форме клеток обременила усилия по выявлению механизмов, которые связывают морфологию с функцией.
С этой целью за последние три десятилетия были разработаны многочисленные подходы к манипулированию формой клеток. Эти подходы достигают своей цели, либо ограничивая клетку трехмерной плесенью, либо контролируя геометрию клеточной адгезии посредством узорчатого осаждения белков внеклеточного матрикса (ECM) на противообрастающую поверхность, метод, называемый микроструктурированием11. Здесь мы рассмотрим ряд методик, которые завоевали популярность на протяжении многих лет.
Первоначально впервые предложенная как подход к микроэлектронным приложениям, мягкая литография на основе микроконтактной печати однозначно стала культовым фаворитом12. Мастер-пластина сначала изготавливается путем выборочного воздействия на участки кремниевой подложки с фоторезистовым покрытием для фотоиррадиации, оставляя после себя узорчатую поверхность13. Эластомер, такой как PDMS, затем выливается на главную пластину для создания мягкого «штампа», который переносит белки ECM на желаемую подложку11,14. После изготовления мастер-пластина может быть использована для отливки многих штампов PDMS, которые дают начало высоковоспроизводимым микропаттернам12. Тем не менее, паттерны не могут быть легко скорректированы из-за длительного процесса фотолитографии. Этот процесс также требует высокоспециализированного оборудования и чистых помещений, которые обычно недоступны в биологических отделах.
Совсем недавно сообщалось, что прямая печать с использованием глубокого ультрафиолета обходит ограничения, связанные с традиционными подходами, основанными на литографии. Глубокий ультрафиолетовый свет направляется через фотомаску на селективные участки стеклянного покровного листа, покрытого поли-L-лизином-привитым полиэтиленгликолем. Химические группы, подвергающиеся воздействию глубокого УФ-излучения, фотоконвертируются без использования светочувствительных линкеров для обеспечения связывания белков ECM15. Отсутствие светочувствительных линкеров позволяет узорчатым покровам оставаться стабильными при комнатной температуре более семи месяцев15. Этот метод позволяет избежать использования чистых помещений и фотолитографического оборудования и требует менее специализированной подготовки. Тем не менее, потребность в фотомасках по-прежнему создает существенное препятствие для экспериментов, которые требуют легкодоступных изменений в шаблонах.
В дополнение к методам, которые манипулируют геометрией клеток посредством контролируемого осаждения белков ECM на 2D-поверхности, другие стремятся контролировать форму клеток, ограничивая клетки 3D-микроструктурами. Многие исследования адаптировали подход на основе мягкой литографии, описанный выше, для создания 3D, а не 2D, PDMS-камер для изучения зависящих от формы биологических процессов у эмбрионов, бактерий, дрожжей и растений16,17,18,19. Двухфотонная полимеризация (2PP) также взяла на себя инициативу в качестве метода микрофабрикации, который может создавать сложные 3D-гидрогелевые каркасы с нанометровым разрешением20. 2PP опирается на принципы двухфотонной адсорбции, где два фотона, доставленные фемтосекундными импульсами, поглощаются одновременно молекулой - в данном случае фотоинициатором - что обеспечивает локальную полимеризацию фотополимеров21. Этот метод широко использовался для печати 3D-каркасов, которые имитируют нативные структуры ECM тканей человека и, как было показано, вызывают низкое фотохимическое повреждение клеток22.
Дебют микрофотопирования 10 лет назад дал исследователям возможность изготавливать микроструктуры, избегая при этом недоступного и специализированного оборудования. Микрофотопирование создает узоры в микронном масштабе путем термического удаления селективных областей поливинилового спирта (ПВА), покрытых на поверхностях активированного стекла с помощью инфракрасного лазера23,24. Белки ECM, которые прикрепляют только подлежащую стеклянную поверхность, а не ПВА, затем служат биохимическими сигналами, чтобы обеспечить контролируемую динамику распространения и форму клеток. Этот метод также обеспечивает превосходную гибкость, поскольку шаблоны могут быть легко изменены в режиме реального времени. Здесь мы предоставляем пошаговый протокол микрофотопирования с использованием коммерческой многофотонной системы визуализации. Описанный протокол предназначен для быстрого и автоматизированного изготовления больших шаблонов. Мы продемонстрировали, что эти паттерны эффективно контролируют форму клеток, ограничивая геометрию клеточных АДГЕЗИЙ ECM. Наконец, мы демонстрируем, что описанная методика паттернирования модулирует организацию и динамику актинового цитоскелета.
1. Предварительная обработка Coverslip
2. ПВА покрытие
3. Настройка многофотонного микроскопа
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный протокол настроен на создание клеточных адгезивных микроструктур желаемой формы и размера на вертикальных или перевернутых многофотонных системах визуализации, особенно тех, которые не оснащены аппаратным автофокусом. Таким образом, для каждого поля зрения (FOV) сценарий паттерна аблажирует небольшую область для создания фидуциарного маркера на крышке, использует программный автофокус для фокусировки микроскопа на поверхности покрова и сбрасывает желаемый рисунок. Выполнение этого скрипта в цикле для соседних FOV надежно создает большой массив микроструктур (5 x 5 мм или больше), которые ограничивают форму клеток и модулируют активность внутриклеточных биологических процессов. Описанный протокол разработан для системы визуализации Nikon A1R MP+, управляемой программным обеспечением NIS-Elements. Если для создания шаблонов используется система обработки изображений другого поставщика, оптические конфигурации и сценарий шаблонирования должны быть скорректированы в соответствии с инструкциями производителя.
4. Генерация маски ROI и настройка макроса
5. Генерация микроструктур с помощью фотоабляции
6. Адсорбция фибронектина
7. Прикрепление клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол оптимизирован для первичных фибробластов ребров человека.
8. Сбор данных
9. Анализ изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол позволяет пользователям получать средний флуоресцентный сигнал интересуемого белка над большим количеством клеток из Z-стеков микроскопических изображений.
Качество экспериментальных данных, полученных с помощью микроструктурирования, во многом зависит от качества паттернов. Чтобы определить качество рисунков, полученных с помощью приведенного выше метода, мы сначала использовали отражательную микроскопию для оценки формы и размера фо...
Приведенные выше результаты демонстрируют, что описанный протокол микроструктурирования (микрофотопа) с помощью ИК-лазера обеспечивает воспроизводимые адгезивные паттерны различных форм, что позволяет манипулировать формой клеток и цитоскелетной архитектурой. Хотя многочисленные ...
Авторы не раскрывают конфликта интересов.
Эта работа была поддержана премией Connaught Fund New Investigator Award для S.P., Канадским фондом инноваций, Грантовой программой NSERC Discovery (гранты RGPIN-2015-05114 и RGPIN-2020-05881), Объединенным исследовательским фондом Манчестерского университета и Университета Торонто и Программой XSeed Университета Торонто. C.T. был поддержан стипендией NSERC USRA.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane | Aldrich | 281778 | |
10 cm Cell Culture Dish | VWR | 10062-880 | Polysterene, TC treated, vented |
25X Apo LWD Water Dipping Objective | Nikon | MRD77225 | |
3.5 cm Cell Culture Dish | VWR | 10861-586 | Polysterene, TC treated, vented |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | Thermo | 62248 | 1mg/mL dihydrochloride solution |
Bovine Serine Albumin | BioShop | ALB005 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Wisent | 311-425-CL | |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | FC010 | 1mg/mL in pH 7.5 buffer |
Fibronectin Antibody | BD | 610077 | Mouse |
Fiji | ImageJ | Version 1.53c | |
Fluorescent Phalloidin | Invitrogen | A12380 | 568nm |
Glass Coverslip | VWR | 16004-302 | 22 × 22 mm |
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16220 | 25% aqueous solution |
Hydrochloric Acid | Caledon | 6025-1-29 | 37% aqueous solution |
IR Laser | Coherent | Chameleon Vision | |
Minimal Essential Medium α | Gibco | 12561-056 | |
Mounting Medium | Sigma | F4680 | |
Mouse Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Goat, 488nm |
Multi-Photon Microscope | Nikon | A1R MP+ | |
Myosin Light Chain Antibody | Cell Signaling Technology | 3672S | Rabbit |
NIS Elements | Nikon | Version 5.21.03 | |
Nitric Acid | Caledon | 7525-1-29 | 70% aqueous solution |
Photoshop | Adobe | Version 21.2.1 | |
Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Powder |
Poly(vinyl alchohol) | Aldrich | 341584 | MW 89000-98000, 98% hydrolyzed |
Rabbit Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4412S | Goat, 488nm |
Shaker | VWR | 10127-876 | Alsoknown as analog rocker |
Sodium Borohydride | Aldrich | 452882 | Powder |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | Powder |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S5011 | Powder |
Spyder | Anaconda | 4.1.4 | |
Trypsin | Wisent | 325-042-CL | 0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены