Контроль геометрии ячейки с помощью инфракрасного лазерного микроструктурирования

Резюме

Протокол, представленный здесь, позволяет автоматизировать изготовление микроструктур, которые стандартизируют форму клеток для изучения цитоскелетных структур в клетках млекопитающих. Этот удобный для пользователя метод может быть установлен с коммерчески доступными системами визуализации и не требует специализированного оборудования, недоступного для стандартных лабораторий клеточной биологии.

Аннотация

Микроструктурирование является признанным методом в сообществе клеточной биологии, используемым для изучения связей между морфологией и функцией клеточных компартментов, обходя осложнения, возникающие из естественных вариаций между клетками. Чтобы стандартизировать форму ячеек, клетки либо заключены в 3D-формы, либо контролируются для адгезивной геометрии через адгезивные острова. Однако традиционные методы микроструктурирования, основанные на фотолитографии и глубоком УФ-травлении, сильно зависят от чистых помещений или специализированного оборудования. Здесь мы представляем инфракрасную лазерную технику микроструктурирования (микрофотопаттернинг), модифицированную от Doyle et al., которая может быть удобно настроена с помощью коммерчески доступных систем визуализации. В этом протоколе мы используем систему визуализации Nikon A1R MP+ для генерации микроструктур с микронными прецизиями с помощью инфракрасного (ИК) лазера, который аблационирует заданные области на покрытых поливиниловым спиртом покровах. Мы используем пользовательский скрипт для обеспечения автоматизированного изготовления шаблонов с высокой эффективностью и точностью в системах, не оснащенных аппаратным автофокусом. Мы показываем, что этот протокол микроструктурирования (микрофотопа) с помощью ИК-лазера приводит к определенным паттернам, к которым клетки прикрепляются исключительно и принимают желаемую форму. Кроме того, данные из большого количества ячеек могут быть усреднены из-за стандартизации формы клеток. Паттерны, генерируемые с помощью этого протокола, в сочетании с изображениями с высоким разрешением и количественным анализом, могут использоваться для экранов с относительно высокой пропускной способностью для идентификации молекулярных игроков, опосредованных связью между формой и функцией.

Введение

Форма клетки является ключевым фактором, определяющим фундаментальные биологические процессы, такие как морфогенез тканей^1,миграция клеток^2,пролиферация клеток³и экспрессия генов^4. Изменения формы клеток обусловлены сложным балансом между динамическими перестройками цитоскелета, который деформирует плазматическую мембрану, и внешними факторами, такими как внешние силы, возлагаемые на клетку, и геометрией клеточно-клеточных и клеточно-матричных спаек^5. Мигрирующие мезенхимальные клетки, например, полимеризуют плотную актиновую сеть на переднем крае, к....

протокол

1. Предварительная обработка Coverslip

1. Подготовьте скрипучие-чистые крышки, как описано в Waterman-Storer, 1998²⁵.
2. Готовят 1% (3-аминопропил)триметоксисилан (АПТМС) раствор и инкубируют покровы в растворе в течение 10 мин с мягким перемешиванием. Убедитесь, что чехлы свободно перемещаются в растворе.
3. Дважды стирайте крышки с dH₂O по 5 мин каждая.
4. Приготовьте 0,5% раствор глутаральдегида (GA) и инкубируют покровные листы в растворе в течение 30 мин на шейкере. Для 25 обшивки используйте 50 мл раствора глутарового альдегида. Убедитесь, что чехлы свободно перемещаются в растворе.
5. Трижды ....

Результаты

Качество экспериментальных данных, полученных с помощью микроструктурирования, во многом зависит от качества паттернов. Чтобы определить качество рисунков, полученных с помощью приведенного выше метода, мы сначала использовали отражательную микроскопию для оценки формы и размера фо.......

Обсуждение

Приведенные выше результаты демонстрируют, что описанный протокол микроструктурирования (микрофотопа) с помощью ИК-лазера обеспечивает воспроизводимые адгезивные паттерны различных форм, что позволяет манипулировать формой клеток и цитоскелетной архитектурой. Хотя многочисленные .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane	Aldrich	281778
10 cm Cell Culture Dish	VWR	10062-880	Polysterene, TC treated, vented
25X Apo LWD Water Dipping Objective	Nikon	MRD77225
3.5 cm Cell Culture Dish	VWR	10861-586	Polysterene, TC treated, vented
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	Thermo	62248	1mg/mL dihydrochloride solution
Bovine Serine Albumin	BioShop	ALB005
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Wisent	311-425-CL
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Fibronectin	Sigma-Aldrich	FC010	1mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin Antibody	BD	610077	Mouse
Fiji	ImageJ		Version 1.53c
Fluorescent Phalloidin	Invitrogen	A12380	568nm
Glass Coverslip	VWR	16004-302	22 × 22 mm
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16220	25% aqueous solution
Hydrochloric Acid	Caledon	6025-1-29	37% aqueous solution
IR Laser	Coherent	Chameleon Vision
Minimal Essential Medium α	Gibco	12561-056
Mounting Medium	Sigma	F4680
Mouse Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Goat, 488nm
Multi-Photon Microscope	Nikon	A1R MP+
Myosin Light Chain Antibody	Cell Signaling Technology	3672S	Rabbit
NIS Elements	Nikon		Version 5.21.03
Nitric Acid	Caledon	7525-1-29	70% aqueous solution
Photoshop	Adobe		Version 21.2.1
Pluronic F-127	Sigma	P2443	Powder
Poly(vinyl alchohol)	Aldrich	341584	MW 89000-98000, 98% hydrolyzed
Rabbit Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4412S	Goat, 488nm
Shaker	VWR	10127-876	Alsoknown as analog rocker
Sodium Borohydride	Aldrich	452882	Powder
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	Powder
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S5011	Powder
Spyder	Anaconda	4.1.4
Trypsin	Wisent	325-042-CL	0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA