Cattura di composti organici volatili microbici prodotti attivamente da campioni associati all'uomo con estrazione assorbente assistita da vuoto

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'estrazione di composti organici volatili da un campione biologico con il metodo di estrazione assorbente assistita da vuoto, la gascromatografia accoppiata con la spettrometria di massa utilizzando il binario di preparazione del campione Entech e l'analisi dei dati. Descrive anche la coltura di campioni biologici e il sondaggio isotopico stabile.

Abstract

I composti organici volatili (COV) provenienti da campioni biologici hanno origini sconosciute. I COV possono provenire dall'ospite o da organismi diversi all'interno della comunità microbica dell'ospite. Per districare l'origine dei COV microbici, sono state eseguite analisi dello spazio di testa volatile di mono- e co-colture batteriche di Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii e sondaggi isotopici stabili in campioni biologici di feci, saliva, acque reflue ed espettorato. Mono- e co-colture sono state utilizzate per identificare la produzione volatile da singole specie batteriche o in combinazione con il sondaggio isotopico stabile per identificare il metabolismo attivo dei microbi dai campioni biologici.

L'estrazione assorbente assistita da vuoto (VASE) è stata impiegata per estrarre i COV. VASE è un metodo di estrazione dello spazio di testa facile da usare, commercializzato e privo di solventi per composti semi-volatili e volatili. La mancanza di solventi e le condizioni di quasi vuoto utilizzate durante l'estrazione rendono lo sviluppo di un metodo relativamente facile e veloce rispetto ad altre opzioni di estrazione come la terz-butilazione e la microestrazione in fase solida. Il flusso di lavoro qui descritto è stato utilizzato per identificare specifiche firme volatili da mono- e co-culture. Inoltre, l'analisi del sondaggio isotopico stabile di campioni biologici associati all'uomo ha identificato COV che sono stati prodotti comunemente o in modo univoco. Questo documento presenta il flusso di lavoro generale e le considerazioni sperimentali di VASE in combinazione con il sondaggio isotopico stabile di colture microbiche vive.

Introduzione

I composti organici volatili (COV) sono molto promettenti per il rilevamento e l'identificazione batterica perché sono emessi da tutti gli organismi e diversi microbi hanno firme VOC uniche. Le molecole volatili sono state utilizzate come misura non invasiva per rilevare varie infezioni respiratorie tra cui la broncopneumopatia cronica ostruttiva¹, la tubercolosi² nelle urine³ e la polmonite associata al ventilatore⁴, oltre a distinguere i soggetti con fibrosi cistica (FC) dai soggetti di controllo sani ^5,6. Le firme volatili sono state persino utilizzate per distinguere specifiche infezioni patogene nella FC (Staphylococcus aureus⁷, Pseudomonas aeruginosa ^8,9 e S. aureus vs. P. aeruginosa¹⁰). Tuttavia, con la complessità di tali campioni biologici, è spesso difficile individuare la fonte di SPECIFICI COV.

Una strategia per districare i profili volatili da più microbi infettanti è quella di eseguire l'analisi dello spazio di testa dei microrganismi sia in mono- che in co-coltura¹¹. L'analisi dello spazio di testa esamina gli analiti emessi nello "spazio di testa" sopra un campione piuttosto che quelli incorporati nel campione stesso. I metaboliti microbici sono stati spesso caratterizzati in monocolture a causa della difficoltà nel determinare l'origine dei metaboliti microbici in campioni clinici complessi. Profilando i volatili da monocolture batteriche, i tipi di sostanze volatili che un microbo produce in vitro possono rappresentare una linea di base del suo repertorio volatile. La combinazione di colture batteriche, ad esempio la creazione di co-colture e la profilazione delle molecole volatili prodotte possono rivelare le interazioni o l'alimentazione incrociata tra i batteri¹².

Un'altra strategia per identificare l'origine microbica delle molecole volatili è quella di fornire una fonte di nutrienti etichettata con un isotopo stabile. Gli isotopi stabili sono forme naturali, non radioattive, di atomi con un diverso numero di neutroni. In una strategia che è stata utilizzata fin dai primi anni 1930 per tracciare il metabolismo attivo negli animali¹³, il microrganismo si nutre della fonte di nutrienti etichettata e incorpora l'isotopo stabile nelle sue vie metaboliche. Più recentemente, un isotopo stabile sotto forma di acqua pesante (D₂O) è stato utilizzato per identificare S. aureus metabolicamente attivo in un campione clinico di espettorato CF¹⁴. In un altro esempio, ¹³glucosio marcato con C sono stati utilizzati per dimostrare l'alimentazione incrociata di metaboliti tra isolati clinici CF di P. aeruginosa e Rothia mucilaginosa¹² .

Con l'avanzamento delle tecniche di spettrometria di massa, i metodi per rilevare segnali volatili si sono spostati da osservazioni qualitative a misurazioni più quantitative. Utilizzando la spettrometria di massa per gascromatografia (GC-MS), l'elaborazione di campioni biologici è diventata a portata di mano per la maggior parte dei laboratori o delle impostazioni cliniche. Molti metodi per esaminare le molecole volatili sono stati utilizzati per profilare campioni come cibo, colture batteriche e altri campioni biologici e aria e acqua per rilevare la contaminazione. Tuttavia, diversi metodi comuni di campionamento volatile ad alta produttività richiedono solvente e non vengono eseguiti con i vantaggi forniti dall'estrazione sotto vuoto. Inoltre, per l'analisi ^{15,16,17,18,19} sono spesso necessari volumi o quantità maggiori (superiori a 0,5 ml) di materiali campionati, sebbene ^ciò sia specifico del substrato e richieda un'ottimizzazione per ciascun tipo di campione e metodo.

Qui, l'estrazione assorbente assistita da vuoto (VASE) seguita dal desorbimento termico su un GC-MS è stata impiegata per esaminare i profili volatili delle mono- e co-colture batteriche e identificare i volatili prodotti attivamente con sonda isotopica stabile da feci umane, saliva, liquami e campioni di espettorato (Figura 1). Con quantità di campione limitate, i COV sono stati estratti da un minimo di 15 μL di espettorato. Gli esperimenti di indagine isotopica con campioni umani hanno richiesto l'aggiunta di una fonte isotopica stabile, come il glucosio ¹³C, e mezzi per coltivare la crescita della comunità microbica. La produzione attiva di sostanze volatili è stata identificata come una molecola più pesante da GC-MS. L'estrazione di molecole volatili sotto vuoto statico ha permesso la rilevazione di molecole volatili con maggiore sensibilità 20,21,22.

Protocollo

1. Headspace Sorbent Pen (HSP) e considerazioni sull'analisi del campione

NOTA: L'HSP contenente l'assorbente Tenax TA è stato selezionato per catturare un'ampia gamma di sostanze volatili. Tenax ha un'affinità inferiore per l'acqua rispetto ad altri assorbenti, che gli consente di intrappolare più COV da campioni di umidità più elevata. Tenax ha anche un basso livello di impurità e può essere condizionato per il riutilizzo. La selezione del sorbente è stata effettuata anche in considerazione con la colonna installata nel GC-MS (vedi la Tabella dei materiali).

1. Generare controlli negativi estraendo supporti e/o campioni grezzi con le stesse condizioni utilizzate per l'estrazione del campione.
2. Analizzare un HSP vuoto (precedentemente confermato pulito e privo di sfondi significativi) sul GC-MS prima di analizzare i campioni estratti. Eseguire spazi vuoti tra i tipi di campione (ad esempio, tre repliche di batteri monocoltura, vuoti, tre repliche di co-coltura batterica, vuoti, ecc.).
3. Limitare l'uso di articoli profumati per la cura personale o il consumo di cibi maleodoranti prima dell'estrazione e dell'analisi del campione. Idealmente, preparare i campioni in una cappa di biosicurezza che non sia stata pulita da alcol o altri detergenti volatili per almeno 30 minuti. Attivare il flusso d'aria nella cappa di biosicurezza per 30-60 minuti prima della preparazione del campione.
4. Conservare i campioni sul ghiaccio per limitare il rilascio volatile durante la preparazione del campione.

2. Preparazione mono- e co-coltura

1. Nella cappa di biosicurezza, inoculare colture di A. baumannii, S. aureus e P. aeruginosa nei mezzi di crescita di Todd Hewitt. Incubare durante la notte a 37 °C con agitazione a 200 giri/min.
2. Dopo l'incubazione notturna, eseguire la gestione della coltura nella cappa di biosicurezza. Diluire ogni coltura a densità ottica 0,05 a 500 nm.
3. Mescolare co-colture in parti uguali e pipettare 200 μL di mezzi di controllo, mono-, o co-colture in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e posizionare in un incubatore a 37 °C per 24 ore. Preparare una seconda piastra per un'incubazione di 48 ore.
4. Al termine del periodo di incubazione, preparare i campioni per l'estrazione nella sezione 4. Pipettare il liquido viene estratto in tubi di microcentrifuga e conservato a -80 °C.
   NOTA: A questo punto, i campioni possono essere conservati a -80 °C per essere estratti in un secondo momento, se necessario.

3. Sonda isotopica stabile nella preparazione di campioni biologici

NOTA: I campioni di feci e saliva sono stati donati da donatori anonimi con l'approvazione dell'Università della California Irvine Institutional Review Board (HS # 2017-3867). Le acque reflue provenivano da San Diego, CA. I campioni di espettorato sono stati raccolti da soggetti con fibrosi cistica come parte di uno studio più ampio approvato dall'Università del Michigan Medical School Institutional Review Board (HUM00037056).

1. Eseguire tutti i preparati biologici del campione nella cappa di biosicurezza.
   1. Per preparare campioni fecali, aggiungere 1 mL di acqua deionizzata a 100 mg di feci in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e vortice per 3 minuti. Mettere sul ghiaccio quando non in uso.
      1. A 15 μL di miscela fecale e acquosa, aggiungere 485 μL di mezzo per infusione cardiaca cerebrale (BHI) con 20 mM di glucosio ^{a 13}C o BHI con il 30% di deuterio (D₂O). Assicurarsi che il volume finale del campione sia di 500 μL. Preparare i campioni in tripliceti tecnici.
   2. Per preparare i campioni di acque reflue, aggiungere 500 μL di liquami a 500 μL di BHI con 20 mM ¹³C di glucosio o BHI con il 30% D₂O per un volume totale di 1 mL. Preparare i campioni in triplice copia. Mettere sul ghiaccio quando non in uso.
   3. Per preparare campioni di saliva, aggiungere 50 μL di saliva a 500 μL di BHI con 20 mM ¹³C di glucosio o BHI con il 30% di D₂O per un volume totale di 550 μL. Preparare i campioni in triplice copia. Mettere sul ghiaccio quando non in uso.
   4. Per preparare campioni di espettorato per confrontare i volatili presenti nel campione prima e dopo la coltura, eseguire una prima estrazione con 15 μL di espettorato. Preparare i campioni in triplice copia. Mettere sul ghiaccio quando non in uso. Procedere al punto 4 per l'estrazione del campione ed estrarre per 18 ore a 37 °C con agitazione a 200 giri/min.
   5. Dopo il completamento della prima estrazione dei campioni di espettorato non coltivati, salvare le fiale con espettorato. Aggiungere 500 μL di BHI con 20 mM ¹³C di glucosio ai flaconcini con espettorato da 3.5.1. Mettere sul ghiaccio quando non in uso.
2. Passare alla sezione 4 per l'estrazione del campione.

4. Estrazione del campione

1. Posizionare i flaconcini vuoti per analisi organica volatile (VOA) (20 ml) sulla piastra fredda e posizionare la piastra fredda sul ghiaccio nella cappa di biosicurezza.
2. Accendere l'unità di estrazione a penna assorbente 5600 (SPEU) e regolare la temperatura desiderata come richiesto per ciascun metodo.
   NOTA: per esperimenti di rilevamento di isotopi stabili a 37 °C, il raggiungimento del setpoint può richiedere fino a 15 minuti. Per esperimenti mono- e co-coltura a 70 °C, raggiungere il setpoint può richiedere fino a 60 minuti.
3. Raccogliere HSP puliti pari al numero di campioni preparati, inclusi gli HSP per i controlli dei supporti o dei campioni.
4. Etichettare 20 ml di flaconcini di VOA in base a campioni, repliche e ID HSP secondo necessità. Utilizzare un marcatore che resista all'acqua nel caso in cui si formi condensa all'esterno del flaconcino mentre si è sul ghiaccio.
5. All'interno del cappuccio di biosicurezza, svitare il cappuccio bianco sulla fiala, pipettare rapidamente il campione nella fiala e assemblare il cappuccio nero, il coperchio e l'HSP.
   NOTA: i campioni non devono entrare in contatto con l'HSP e il volume del campione dipenderà dal tipo di campione.
6. Riposizionare il flaconcino contenente il campione e l'HSP sulla piastra fredda.
7. Ripetere i passaggi 4.5 e 4.6 per ogni campione. Eseguire questi passaggi per campione invece di tutti in una volta per prevenire il riscaldamento del campione e, quindi, il rilascio volatile prematuro.
8. Una volta che tutti i campioni sono stati preparati nelle fiale di vetro, eseguire i seguenti passaggi all'esterno della cappa di biosicurezza sul banco. Accendere la pompa per vuoto, posizionare i flaconcini sotto vuoto a 30 mmHg e rimuovere la fonte di vuoto.
   NOTA: non è necessario che i flaconcini si trovino sul vassoio freddo dopo che l'applicazione sottovuoto è stata completata.
9. Ricontrollare la pressione dopo aver posto tutti i campioni sotto vuoto utilizzando il manometro. Se un flaconcino presenta una perdita, assicurarsi che il cappuccio sia avvitato saldamente e che gli O-ring bianchi dell'HSP e le fodere del coperchio siano posizionati correttamente.
   NOTA: una guarnizione compromessa può comportare una diminuzione del rilevamento volatile rispetto a un flaconcino sotto vuoto.
10. Posizionare i flaconcini nello SPEU per il tempo e la temperatura ottimizzati con agitazione a 200 giri/min. Estrarre colture per 1 ora a 70 °C. Estrarre esperimenti di indagine isotopica stabile con campioni di feci, acque reflue, saliva ed espettorato per 18 ore a 37 °C.
11. Posizionare la piastra fredda a -80 °C per l'uso dopo il periodo di estrazione.
12. Al termine dell'estrazione, posizionare i campioni sulla piastra fredda per 15 minuti per estrarre il vapore acqueo dall'HSP e dallo spazio di testa del flaconcino.
13. Trasferire gli HSP nelle loro maniche.
    NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa qui per un massimo di ~ 1 settimana a temperatura ambiente prima di perdere i composti più altamente volatili dagli HSP.

5. Analizzare campioni sulla gascromatografia - spettrometro di massa (GC-MS)

1. Utilizzare le seguenti impostazioni GC-MS (vedere la Tabella dei materiali): 35 °C con una tenuta di 5 minuti, una rampa di 10 °C/min a 170 °C e una rampa da 15 °C/min a 230 °C con un rapporto di divisione 20:1 e una durata totale di 38 min.
2. Impostare il metodo di desorbimento come segue: 2 min, 70 °C di preriscaldamento; 2 min 260 °C di desorbimento; 34 min, cottura a 260 °C; e 2 min, 70 °C dopo la cottura.
3. Impostare la sequenza di campioni e avviare la corsa in base alla strumentazione.
   1. Per impostare una sequenza sul software Entech, aprire il programma. Nelle opzioni a destra del menu a discesa dello strumento, selezionare 5800 | Sequenza.
   2. Osservare la tabella di sequenza nel software Entech simile a quella nel software GC-MS. Assegnare alla colonna ID esempio un nome in base al numero di date_vial corrente. Tenere presente che Nome è analogo a Nome nella tabella delle sequenze GC-MS e il Metodo 5800 determina la velocità della rampa di temperatura, i tempi di mantenimento, ecc. (apre un menu per selezionare il metodo generato nel passaggio 5.2).
   3. Tenere presente che le colonne Vassoio e Posizione determinano dove andrà la guida di preparazione del campione (SPR) per prelevare gli HSP.
      1. Osserva i due vassoi con 30 punti ciascuno all'immediata sinistra, disposti come sei colonne con cinque punti ciascuno. La posizione del vassoio più a sinistra e più vicina all'utente (anteriore) è la posizione 1, mentre la più a destra, più lontana è la posizione 30.
      2. Si noti che questi vassoi sono HSP A o B, dove HSP B è il vassoio più vicino all'SPR (vassoio più interno) e direttamente dietro HSP B è HSP Blank. Posizionare i campioni estratti nei vassoi e selezionare il punto sulla sequenza di conseguenza.
   4. Salvare la tabella delle sequenze, selezionare Esegui sul lato sinistro, quindi Inizia con vuoto nel desorbitore se l'HSP vuoto si trova nel desorbitore (indicato da un HSP contrassegnato da un'etichetta gialla).
4. Si noti che gli HSP verranno gestiti dall'SPR per ogni campione nella sequenza. Lascia che l'SPR si riscaldi, quindi verrà visualizzato un messaggio nella parte superiore dello schermo per confermare se lo spazio vuoto è nel desorbitore. Clicca su Salta per confermare che la penna è lì. Consenti all'SPR di eseguire automaticamente tutti i campioni e la sequenza sul lato GC-MS registrerà automaticamente i dati in file separati.

6. Analisi dei dati

1. Dati di filtro qualità sul software GC-MS (Table of Materials).
   1. Rivedi ogni picco sul cromatogramma e annota i picchi che corrispondono alla libreria del National Institute of Standards & Technology (NIST) (o con un'altra libreria disponibile).
   2. Aggiungere picchi cromatografici annotati al metodo di elaborazione. Impostare i criteri per la selezione dei picchi per includere composti con una probabilità superiore al 75% e assicurarsi che l'allineamento di ogni ione identificativo del composto si trovi all'interno del centro del picco.
      1. Per aggiungere un picco al metodo di elaborazione, selezionare Calibra | Modifica | composto Nome | inserire la mescola in Compound standard esterno. Aggiungere il nome del composto, il tempo di ritenzione, Quant Signal Target Ion. Aggiungi le tre vette più grandi. Per salvare, selezionare ok | Metodo | Salva.
   3. Una volta impostato il metodo di processo, procedere a Quantitate | Calcolare e visualizzare | QEdit Quant Risultato.
   4. Ispezionare ogni composto per assicurarsi che i picchi siano allineati con i tempi di ritenzione previsti e siano al di sopra del rumore di fondo.
   5. Una volta completato QEdit, selezionare Esci | Sì per salvare i QEdits e tornare al cromatogramma principale. Esporta le integrazioni di area aprendo il file sul lato sinistro. Seleziona Quantitate | Genera report.
   6. Per esportare i file da utilizzare in DExSI, selezionare File | Esporta dati in formato AIA | Creare una nuova directory e selezionare un percorso per il file o Usa directory esistente.
   7. Osservare l'apertura di una nuova finestra per selezionare i file da esportare. Sposta i file sul lato destro della finestra e fai clic su Elabora. Attendi da alcuni secondi a qualche minuto a seconda del numero di file convertiti.
2. Correggere l'abbondanza di isotopi in DExSI secondo le istruzioni per il software DExSI (https://github.com/DExSI/DExSI) ed eseguire analisi con un software o un programma preferito (ad esempio, R). Gli script utilizzati per generare le figure si trovano in https://github.com/joannlp/ VOC_SIP.

Risultati

Mono- e co-colture di S. aureus, P. aeruginosa e A. baumannii
Le mono- e co-colture consistevano nelle specie batteriche S. aureus, P. aeruginosa e A. baumannii. Questi sono patogeni opportunistici comuni trovati nelle ferite umane e nelle infezioni croniche. Per identificare le molecole volatili presenti nelle mono- e co-colture, è stata eseguita una breve estrazione di 1...

Discussione

Per identificare la produzione volatile in colture in vitro e campioni associati all'uomo, sono state eseguite analisi volatili di mono- e co-colture di P. aeruginosa, S. aureus e A. baumanii e sondaggi isotopici stabili di diversi campioni biologici. Nell'analisi per le mono- e co-colture, i volatili sono stati rilevati eseguendo una breve estrazione per 1 ora a 70 °C. L'analisi volatile di mono- e co-colture ha permesso l'indagine dei composti prodotti sia dalle singole specie che durante l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
13C glucose	Sigma-Aldrich	389374-1G
2-Stg Diaph Pump	Entech Instruments	01-10-20030
20 mL VOA vials	Fisher Scientific	5719110
24 mm Black Caps with hole, no septum	Entech Instruments	01-39-76044B	holds lid liner in place on vial
24 mm vial liner for sorbent pens	Entech Instruments	SP-L024S	allows pens to make a vacuum seal at top of vial
5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU)	Entech Instruments	5600-SPES	5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC
96-well assay plates	Genesee	25-224
Brain Heart Infusion (BHI) media	Sigma-Aldrich	53286-500G
ChemStation Stofware	Agilent
DB-624 column	Agilent	122-1364E	60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	151882-1L
Dexsi sofware	Dexsi (open source)
GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector)	Agilent		7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector
Headspace Bundle HS-B01, 120VA	Entech Instruments	SP-HS-B01	Items for running headspace extraction included in bundle
Headspace sorbent pen (HSP) - blank	Entech Instruments	SP-HS-0
Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh)	Entech Instruments	SP-HS-T3560
Microcentrifuge tubes (2 mL)	VWR	53550-792
O-rings	Entech Instruments	SP-OR-L024
Sample Preparation Rail	Entech Instruments
Sorbent pen thermal conditioner	Entech Instruments	3801-SPTC
Todd Hewitt (TH) media	Sigma	T1438-500G