Isolierung von menschlichen Neutrophilen aus Vollblut- und Buffycoats

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von Neutrophilen aus Vollblut, Buffy Coats oder Leukapheresemembranen, um eine gute Ausbeute, hohe Reinheit und minimale Zellaktivierung zu erreichen. Wir verwenden Gradientenreinigung, Sedimentation der roten Blutkörperchen (RBC) und RBC-Lyse, um ein hochwertiges / reines Neutrophilenpräparat zu erhalten.

Zusammenfassung

Neutrophile (PMNs) sind die am häufigsten vorkommenden Leukozyten im menschlichen Kreislauf und reichen von 40 bis 70% der gesamten Blutleukozyten. Sie sind die ersten Zellen, die am Ort der Entzündung durch schnelle Extravasation durch Gefäße rekrutiert werden. Dort führen Neutrophile eine Reihe von Funktionen aus, um eindringende Krankheitserreger abzutöten und Immunsignale zu vermitteln. Frisch gereinigte Neutrophile aus menschlichem Blut sind das Modell der Wahl für Studien, da keine Zelllinie die PMN-Funktionen und die Biologie vollständig repliziert. Neutrophile sind jedoch kurzlebige, endständig differenzierte Zellen und sehr anfällig für die Aktivierung als Reaktion auf physikalische (Temperatur, Zentrifugationsgeschwindigkeit) und biologische (Endotoxin, Chemo- und Zytokine) Reize. Daher ist es wichtig, einer standardisierten, zuverlässigen und schnellen Methode zu folgen, um reine und nicht aktivierte Zellen zu erhalten. Dieses Protokoll stellt ein aktualisiertes Protokoll dar, das Dichtegradientenzentrifugation, Sedimentation der roten Blutkörperchen (RBC) und RBC-Lyse kombiniert, um eine hohe PMN-Reinheit zu erreichen und die Zellaktivierung zu minimieren. Darüber hinaus werden auch Methoden zur Beurteilung der Qualität, Lebensfähigkeit und Reinheit der Neutrophilisolierung diskutiert.

Einleitung

Das angeborene Immunsystem besteht aus vielen Zelltypen, die die Immunhomöostase und pathogene Clearance zusammen mit vielen anderen physiologischen Funktionen aufrechterhalten. Neutrophile bilden den größten Pool weißer Blutkörperchen im menschlichen Kreislauf¹. Die meisten reifen Neutrophilen werden im Knochenmark gespeichert, dem Ort der Entstehung neuer Neutrophilen, auch Granulopoese genannt. Im Knochenmark verlassen Granulozytenvorläufer den Zellzyklus und differenzieren sich terminal, wobei sie ihre charakteristischen segmentierten Kerne und Granula erwerben². Unter entzündlichen Bedingungen werden Neutrophile als Reaktion auf Chemokine, Zytokine und schadensassoziierte und pathogenassoziierte molekulare Muster aus dem Blutkreislauf und aus dem Knochenmark mobilisiert, um eine Vielzahl von Funktionen auszuführen. Dazu gehören die Zytokinsekretion, die direkte Phagozytose des Erregers, die Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies, die Degranulation antimikrobieller Proteine und die Bildung neutrophiler extrazellulärer Fallen.

Die Moleküle, die von Neutrophilen zur Bekämpfung von Infektionen verwendet werden, sind für die Mikroben und den Wirt toxisch. So sind die Lebensdauer und die richtige Entfernung von alternden / sterbenden Neutrophilen stark reguliert, und sie haben eine begrenzte Lebensdauer im Kreislauf (<48 h)³. Aufgrund dieses kurzen Überlebens produziert der menschliche Körper jeden Tag durchschnittlich 100 Milliarden neue Neutrophile, um die Homöostase der Bevölkerung aufrechtzuerhalten⁴. Notfall-Granulopoese kann die Freisetzung von Neutrophilen, sowohl reifen als auch unreifen, im Blut während Entzündungen und Infektionen weiter erhöhen⁵. Die Bedeutung von Neutrophilen in der angeborenen Immunantwort wird von Patienten mit erworbener oder angeborener Neutropenie hervorgehoben, die anfällig für bakterielle und Pilzinfektionen sind⁶.

Viele Herausforderungen ergeben sich beim Studium der Neutrophilenbiologie und ihrer Rolle in der Immunantwort aufgrund ihrer Natur, einschließlich ihres kurzen Überlebens und ihres zytotoxischen Gehalts. Neutrophilenähnliche Zelllinien wurden üblicherweise von humanen promyelozytären Leukämie-HL-60-Zellen und PLB-985-Zellen^{unterschieden 7,8}. Obwohl sie eine neutrophilenartige Morphologie aufweisen und chemotaxis durchführen können, können diese Zelllinien die Biologie der Neutrophilen nicht vollständig rekapitulieren. In-vitro-Assays, die diese Zelllinien verwenden, sind auch nicht in der Lage, In-vivo-Experimente zu rekapitulieren. Darüber hinaus muss die Differenzierung dieser Zellen induziert werden und könnte durch Genmanipulation vor der Differenzierung beeinträchtigt werden.

In jüngster Zeit wurden Methoden entwickelt, um diese Probleme zu umgehen, indem induzierbare Promotoren verwendet werden, um die Genexpression nach der Differenzierung in HL-60-Zellen zu modulieren⁹. Selbst mit solchen Werkzeugen sind primäre menschliche PMNs erforderlich, um Ziele mit pharmakologischen Ansätzen zu validieren. Daher ist es unerlässlich, reine und inaktivierte Neutrophile zu erhalten, die aus Blut isoliert wurden, um die Ergebnisse von Zelllinien- und Tiermodellen zu validieren. Dieser Beitrag stellt ein überarbeitetes PMN-Isolationsprotokoll vor, in dem die Vor- und Nachteile aktueller Methoden bewertet wurden¹⁰. Es wurde eine Kombination entwickelt, die aus Gradientenzentrifugation zur Trennung von PMNs von anderen Immunzellen, kurzer Dextran-basierter Sedimentation zur Entfernung des Großteils der Erythrozyten, schneller Rest-Erythrozyten-Lyse über osmotischen Druck und Low-Speed-Zentrifugation zur Entfernung von Thrombozytenkontamination besteht.

Protokoll

HINWEIS: Menschliche Neutrophile wurden aus venösem Blut aus weggeworfenen Filtern weißer Blutkörperchen isoliert, die aus dem Blood Bank Lab des Boston Children's Hospital gewonnen wurden. Blutspender waren nicht identifizierbar, und es gab keine Interaktion mit lebenden Personen oder Kenntnis von identifizierbaren persönlichen Informationen. Daher wird diese Arbeit nicht als Forschung an menschlichen Probanden gemäß den HHS-Vorschriften für menschliche Probanden (45 CFR Part 46) klassifiziert. Das Boston Children's Hospital Institutional Review Board (IRB) genehmigte das Protokoll.

1. Überlagern des Farbverlaufs

1. Nach dem Sterilisieren des Buffy Coat oder der Vollblutverpackung und der Laminarhaube teilen Sie das Blut in 50 ml Röhrchen mit 10 ml Blut in jedem Röhrchen.
2. Bringen Sie das Volumen mit 5% fetalem Rinderserum (FBS) / Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) auf bis zu 35 ml, um das Blut für einen saubereren Gradienten zu verdünnen.
   HINWEIS: Bei Verwendung einer Leukapheresemembran können zellen mit einer 60 ml Spritze und 30 ml 5% FBS/HBSS pro Filter ausgespült werden. Verdünnung ist unnötig, wenn mit frisch entnommenem Vollblut gearbeitet wird.
3. Schließen Sie den 50-ml-Röhrchendeckel, mischen Sie ihn mehrmals durch Inversion und halten Sie ihn auf den Kopf gestellt, um den Boden frei von Erythrozyten zu haben.
4. Fügen Sie 10 ml Dichtegradientenmedium (siehe Materialtabelle)direkt unter das Blut hinzu. Stellen Sie sicher, dass sich das Medium und das Blut nicht vermischen und dass die Grenzfläche scharf ist (Abbildung 1A).
   HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend. Stellen Sie sicher, dass die Dichtegradientenlösung bei Raumtemperatur (RT) und vor jedem Gradienten gut gemischt ist. Der erste Milliliter des Dichtegradientenmediums muss so langsam wie möglich schonend und gleichmäßig geschichtet werden. Es wird empfohlen, die elektronische Pipettengeschwindigkeit auf niedrig einzustellen.
5. Legen Sie das Rohr vorsichtig in eine Zentrifuge, ohne das Gefälle zu stören, und drehen Sie es bei RT 30 minuten lang mit 400 × g, wobei die Bremse deaktiviert ist. Beobachten Sie, wie sich der gesponnene Gradient in eine obere Serum- / Plasmaschicht, einen mittleren weißen Ring aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs), eine trübe Dichtegradientenmittelschicht und ein unteres Pellet aufteilt, das aus einem weißen, dünnen Neutrophilenband auf der Oberseite der Erythrozyten besteht (Abbildung 1B).
   HINWEIS: Eine trübe oder undurchsichtige Seite der Röhre nach der Zentrifugation kann darauf hindeuten, dass die Zellen (Neutrophile) aktiviert sind und möglicherweise nicht für die Verwendung geeignet sind.
6. Entfernen Sie zuerst die PBMCs, indem Sie die Saugpipette direkt in die PBMC-Schicht einschleusen. Achten Sie darauf, es vollständig abzusaugen, während die Serum- / Plasmaschicht abnimmt, wenn der Ring entfernt wird. Schaben Sie die Seite des Rohres, an der die Zellen mit der Saugpipette pelletiert wurden, um die Entfernung des PMBC zu maximieren. Entfernen Sie vorsichtig die trübe mittlere Schicht des Dichtegradienten zwischen dem PBMC-Ring und dem Neutrophilen/RBC-Pellet.
   HINWEIS: Das Abkratzen der pelletierten Zellen an der Seite des Röhrchens erhöht die Reinheit der Isolierung erheblich. Achten Sie darauf, das Pellet nicht abzusaugen, da die meisten Neutrophilen direkt auf den Erythrozyten sitzen.

2. Sedimentation von Erythrozyten (RBCs)

1. Mit einer 10 ml Pipette das Neutrophilen-/RBC-Pellet in ein sauberes Röhrchen geben. Nicht auf und ab pipettieren. Fügen Sie 5% FBS/HBSS zu einem Endvolumen von 25 ml hinzu. Vorsichtig durch Inversion mischen.
   HINWEIS: Die Durchführung der RBC-Sedimentation nach der PBMC-Entfernung verbessert die Ausbeute und verringert die Aktivierung¹⁰.
2. 25 ml vorgewärmtes (37 °C) 3% Dextran/0,9% NaCl/H2O werden direkt in das Röhrchen_gegeben,das das verdünnte Neutrophil/RBC-Pellet enthält, und durch Inversion vorsichtig mischen. Legen Sie das Rohr 15 Minuten lang auf eine ebene, nicht vibrierende Oberfläche (Abbildung 1C).
   HINWEIS: Eine längere Sedimentation reduziert die Erythrozytenkontamination, verringert aber auch die Ausbeute. Darüber hinaus kann eine längere Dextran-Exposition zu einer Neutrophilenaktivierung oder zum Zelltod führen¹¹.
3. Bringen Sie den Schlauch vorsichtig zurück in die Haube (zur sterilen Isolierung). Indem Sie die Pipette nur leicht in die Flüssigkeit eintauchen, sammeln Sie die oberste Schicht (~ 30 ml) und folgen der Flüssigkeitsoberfläche nach unten.
   HINWEIS: Wenn die Sedimentation eine scharfe Grenzfläche zwischen dem Medium und den Erythrozyten erzeugt, ist das RBC-Pellet kleiner, oder wenn eine höhere Ausbeute gewünscht wird, sammeln Sie bis zu 35 ml.
4. Drehen Sie das Rohr (400 × g,10 min, RT, mit niedriger Bremse (3)), was zu einem roten Pellet führt, bei dem keine Partikel im Medium schwimmen.

3. Analyse der verbleibenden Erythrozyten

1. Den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
2. 25 ml steriles Reinstwasser direkt in das Röhrchen geben und vorsichtig mischen, indem Sie es für 28 s umkehren, um die Erythrozyten zu lysieren. Verwenden Sie kein Pipett, um das Pellet wieder zu versenken.
   HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 30 s, da längere hypotonische Zustände aktiviert werden und zum Tod von Neutrophilen führen können¹².
3. Sofort 25 ml steriles 1,8%_NaCl/H2Oin das Röhrchen geben und vorsichtig durch Invertieren mischen, um die Lösung wieder in isotonische Bedingungen zu bringen.
   HINWEIS: Die Lösung sollte rot, aber ohne Trübung sein.
4. Drehen Sie sich bei 200 × g für 3-5 min mit niedriger Bremse (Stufe 3), um Erythrozyten und Plättchensedimentierung zusammen mit den Neutrophilen zu minimieren (Abbildung 1D und Abbildung 2)^13,14.
   HINWEIS: Das Pellet sollte weiß mit einer minimalen RBC-Schicht auf der Oberseite sein, die vorsichtig entfernt werden kann, während der Überstand abgesaugt wird.
5. Resuspendieren Sie Neutrophile, indem Sie das Kulturmedium (10% FBS/RPMI1640) direkt auf das Pellet pipettieren, aber nicht auf und ab pipettieren. Rocken Sie das Rohr horizontal von einer Seite zur anderen, um die Zellaktivierung zu minimieren.
   HINWEIS: Zellen sollten in einer Konzentration von ~ 2 × 10⁶ Zellen / ml gehalten werden, da eine höhere Dichte zu einer erhöhten Zellaktivierung / -tod führt¹⁵. Aus dem gleichen Grund sollte das Zellpellet so schnell wie möglich resuspendiert werden.
6. Wenn eine Zellaggregation oder -verklumpung beobachtet wird, filtern Sie die Zellsuspension mit einem 70-μm-Netz, um verklumpte Neutrophile zu verwerfen.

4. Bestimmung der Qualität der Neutrophilenisolierung

1. Färben Sie die Zellen mit Markern, die für Neutrophile (CD66b, CD11b), Eosinophile (CD193)(Abbildung 3)und einen Aktivierungsmarker wie CD62L spezifisch sind (Abbildung 4). Erwerben Sie 20.000 Zellen durch Durchflusszytometrie. Analysieren Sie die Zellreinheit und -aktivierung mit den in Abbildung 3 und Abbildung 4 vorgeschlagenen Gating-Strategien.
   HINWEIS: Die Qualität der Neutrophilenzubereitung kann unter Verwendung einer 3% igen Essigsäure-Methylenblau-Lösung beurteilt werden, um den einzigartigen gelappten Kern von Neutrophilen zu visualisieren.
2. Bestimmung der Zelllebensfähigkeit mit Annexin V/Propidiumiodid (PI) (Abbildung 5).
   HINWEIS: Die Trypan-Blaufärbung kann verwendet werden, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewerten.

Ergebnisse

Bei der Verwendung des Dichtegradienten zur Reinigung von Neutrophilen ist es entscheidend, dass die Grenzfläche zwischen dem Blut und dem Dichtegradientenmedium so scharf wie möglich ist und dass nach der Zentrifugation eine deutliche Schichttrennung verbleibt (Schritt 1.4). Nach der RBC-Lyse sollte der Puffer deutlich rot und nicht trüb sein (Schritt 3.3). Wenn das Präparat trüb ist, kann eine zweite Lyserunde (Schritt 3) erforderlich sein, obwohl dies das Überleben der Neutrophilen beeinträchtigen kann (Abbildung 1). Nach der Lyse wird eine Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit (200 × g)empfohlen, wenn die Reinheit priorisiert wird, da sie die Thrombozytenkontamination erheblich reduziert. Die Hochgeschwindigkeitszentrifugation (400 × g)erhöht jedoch die Ausbeute auf Kosten der Reinheit (Schritt 3.4, Abbildung 2). Nach der Neutrophilenisolierung kann die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung zur Beurteilung der Isolationsreinheit verwendet werden (Schritt 4.1) und sollte der Mikroskopie vorgezogen werden. Obwohl die FSC/SSC-Verteilung der Zellen allein eine Schätzung der Zellisolationsqualität liefert (Abbildung 3A), sollte die Verwendung spezifischer Zellmarker bevorzugt werden. In diesem Fall werden die häufigsten kontaminierenden Zellpopulationen mit spezifischen Antikörpern zusammen mit CD66b gefärbt, die spezifisch auf Granulozyten exprimiert werden. Die CD45-Färbung wird verwendet, um Leukozyten (CD45+) und rote Blutkörperchen und Blutplättchen (CD45-) zu unterscheiden.

Andere Kontaminanten sind Lymphozyten (CD3+ oder CD19+, Abbildung 3F),Monozyten (CD14+, Abbildung 3D) und Eosinophile (CD193+, Abbildung 3G). CD11b ist ein Integrin, das auf der myeloischen Linie exprimiert wird; Neutrophile und Monozyten sind CD11b+, während Lymphozyten CD11b- sind (Abbildung 3C). Da die Neutrophilenaktivierung nachgeschaltete Experimente beeinflussen kann, sollte die Expression von CD62L bewertet werden; Neutrophile werden cd62L- sobald sie aktiviert sind (Schritt 4.1). Das Peptid fMLP kann als Positivkontrolle für die CD62L-Ausscheidung verwendet werden (Abbildung 4). Es ist auch wichtig, den Zustand von Neutrophilen vor der Durchführung von Assays zu bewerten; Neutrophile haben eine relativ kurze Halbwertszeit, und die Aktivierung kann sie weiter verkürzen (Schritt 4.2). Eine Standard-Annexin-V- und PI-Färbung kann Aufschluss über den Lebend-/Totstatus der Neutrophilenkultur zu bestimmten Zeitpunkten geben (Abbildung 5).

Abbildung 1: Dichtegradienten mittelbasierte Trennung von Granulozyten. (A) Vor und (B) nach der Zentrifugation. Beachten Sie die scharfe Grenzfläche zwischen den mittleren Schichten des Blutes und des Dichtegradienten. (C) Sedimentation des Pellets in B resuspendiert (1:1) in 5% FBS/HBSS und 3% Dextran-0,9% NaCl. ( D) PMN-Pellet nach Lyse der verbleibenden Erythrozyten im Überstand von (C) mit_H2O. Abkürzungen: PBMC = periphere mononukleäre Blutzelle; PMN = Neutrophil; RBC = rote Blutkörperchen; FBS = fötales Rinderserum; HBSS = Hanks ausgewogene Salzlösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2:Das Drehen mit niedrigeren Geschwindigkeiten nach rbzerzogener Lyse verringerte die Thrombozytenkontamination. Nach der Lyse von Erythrozyten mit_H2Owurden die Zellen bei 200 × g (A) oder 400 × g (B) heruntergeschüttelt. Neutrophile wurden gefärbt, und es wurde eine Durchflusszytometrie-Analyse durchgeführt, wie in Abbildung 3beschrieben, mit dem Zusatz von Anti-CD41 zur Markierung der Blutplättchen. Abkürzungen: RBC = rote Blutkörperchen; CD41 = Differenzierungscluster 41; SSC-A = seitliche Streufläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Beurteilung von Neutrophilen, die aus buffy coat isoliert wurden. Isolierte Neutrophile wurden nach einem Standardprotokoll mit Anti-CD66b, Anti-CD11b, Anti-CD14 und Anti-CD193 gefärbt. Einzelne Zellen (B) wurden von Gesamtzellen ( A )abgegrenzt. (C) CD11b⁺ Zellen wurden aus einzelnen Zellen gated. (D) Punktdiagramm mit Neutrophilen (CD66b⁺, CD14 niedrig/-) und einer sehr geringen Monozytenkontamination (CD66b^-, CD14⁺, Q1). (E) CD66b^- und CD66b⁺ Zellen wurden gated. (F) CD66b^- Zellen waren positiv für Lymphozytenmarker (CD3, CD19). (G) Expression von CD11b und CD193 in CD66b⁺ Zellen, die unterschiedliche neutrophile (CD66b⁺, CD11b⁺, CD193^-) und eosinophile (CD66b⁺, CD11b^-, CD193⁺) Populationen zeigen. In dem hier gezeigten repräsentativen Ergebnis beträgt die Neutrophilenreinheit ~ 93% mit ~ 3,7% Lymphozyten und ~ 3,7% eosinophiler Kontamination. (H) Quantifizierung der Neutrophilenreinheit nach der Reinigung. Die Daten werden aus 5 Einzelstudien zusammengestellt und als Mittelwert ± SD dargestellt. Abkürzungen: CD = Cluster of Differentiation; SSC-A = SSC-A = seitliche Streufläche; FSC-A = Vorwärtsstreufläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Die Gradientenreinigung verursachte keine CD62L-Ausscheidung. (A-B) Kontrolle (A) oder fMLP-stimulierte Neutrophile (B) (1 mM fMLP für 15 min bei 37 °C) wurden mit Neutrophilenmarkern und CD62L gefärbt. (C) Die mittlere Fluoreszenzintensität für CD62L ist in fMLP-behandelten Zellen erniedrigt, was auf CD62L-Ausscheidung und Neutrophilenaktivierung hinweist. Abkürzungen: CD26L = L-selectin; fMLP = N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanin; SSC-A = SSC-A = seitliche Streufläche; FSC-A = Vorwärtsstreufläche; PE = Phycoerythrin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Spontaner Tod von Neutrophilen, die durch Dichtegradienten oder Neutrophilenisolationskit gereinigt wurden. Neutrophile wurden mit Dichtegradienten (A und B) oder handelsüblichen Mikrokügelchen (C und D) gereinigt und für 0 h (A und C) oder 24 h (B und D) in RPMI-10% FCS kultiviert. Die Zellen wurden mit Annexin V und PI zu jeweiligen Zeitpunkten nach einem Standardprotokoll gefärbt. (E) Quantifizierung des gereinigten spontanen Todes von Neutrophilen. n=5, Mittelwert ± SD. Abkürzungen: SSC-A = SSC-A = seitliche Streufläche; FSC-A = Vorwärtsstreufläche; PI = Propidiumiodid; FCS = fötales Kalbserum; FITC = Fluoresceinisothiocyanat; AV5 = Anhang V. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Aufgrund der kurzen Lebensdauer, des terminalen Differenzierungsstatus und des lytischen Gehalts von Neutrophilen war die Untersuchung dieser Zellen schon immer eine Herausforderung. Neben der Verwendung von Mausmodellen oder Zellen aus Patientenkohorten sind Zelllinien nützliche Werkzeuge, um die Neutrophilenbiologie zu^{untersuchen 16}. Neutrophilenähnliche Zelllinien können jedoch nicht alle Aspekte der Neutrophilenbiologie vollständig wiederholen, was eine zusätzliche Schwierigkeitsschicht bei der Untersuchung dieser Zellen hinzufügt. Das am häufigsten verwendete In-vitro-Modell ist die HL-60-Zelllinie, die durch Behandlung mit Dimethylsulfoxid oder Retinsäure in neutrophile Zellen differenziert werden kann^17,18. Obwohl diese Zellen bei der Untersuchung von Migration und Atemausbrüchen nützlich sind, sind sie nicht geeignet, um die mikrobiozide Aktivität von Neutrophilen zu untersuchen. Es gibt andere Zelllinien (PLB-98, NB4), und sie sind auch mit ihren Einschränkungen verbunden¹⁹.

Es ist von entscheidender Bedeutung, Beobachtungen mit primären humanen Neutrophilen zu validieren, die mit Mauskrankheitsmodellen und Zelllinien gemacht wurden. Neutrophile können nicht effizient kryokonserviert werden und werden daher oft frisch aus Vollblut- oder Buffy-Mänteln isoliert, die von Spendern gewonnen und sofort verarbeitet werden. Einmal isoliert, beginnen die Zellen eine komplexe Form des spontanen Todes zu durchlaufen, reguliert durch Oxidation, zytoplasmatische Caspasen und Proteasen, die in neutrophilen Granula gefunden werden^20,21. Unsachgemäße Isolationsmethoden oder -techniken können zur Aktivierung von Neutrophilen führen und nur den Zelltod beschleunigen. Es ist unerlässlich, eine zuverlässige und konsistente Methode zu haben, um reine und qualitativ hochwertige Neutrophile von Spendern zu erhalten.

Es wurden viele Methoden zur Isolierung menschlicher Neutrophilen veröffentlicht^10,22. Sie fallen hauptsächlich in zwei Kategorien, mit einigen gemeinsamen Strategien. Die erste Kategorie ist Antikörper-basiert, entweder durch positive oder negative Selektion. Eine positive Selektion würde Neutrophile direkt markieren und somit eine hochreine Zellpopulation liefern, obwohl sie auch zu einer schnellen Zellaktivierung, zum Zelltod sowie zur unerwünschten Markierung von Neutrophilen führt²³. Negative Selektion, obwohl die Zellen nicht markiert und eine sehr reine Population ergebend, beschleunigte den Tod von Neutrophilen, obwohl der genaue Mechanismus unbekannt ist (Abbildung 5). Ob die Gen- oder Proteinexpression auch nach positiver oder negativer Selektion verändert ist, muss weiter untersucht werden. Darüber hinaus können diese Methoden aufgrund der Menge an Antikörpern, die benötigt werden, um die anderen Zelltypen zu erschöpfen, keine großen Mengen an Neutrophilen ausgeben. Antikörper-basierte Assays können jedoch immer noch für Kurzzeitkulturen und Experimente in kleinerem Maßstab verwendet werden und sind Methoden der Wahl für Experimente, die eine sehr hohe Zellreinheit erfordern, wie z. B. Gen- und Proteinexpressionsstudien.

Die zweite Art der Isolationsmethode ist gradienten- und dichtebasiert. Es beinhaltet normalerweise Percoll, Ficoll-Paque oder andere Polysaccharid / Polyvinylpyrrolidon-Komponenten und nutzt die Zentrifugationskraft, um verschiedene Arten von Blutzellen basierend auf der Zelldichte zu trennen. Diese Methoden werden oft durch die Sedimentation der roten Blutkörperchen durch Dextran ergänzt. Diese Methoden können größere Skalen von Ausgangsmaterial verarbeiten und können auch eine hohe Reinheit erreichen. Ein Vorbehalt der dichtebasierten Isolierung ist die ineffiziente Trennung anderer weit weniger häufiger Granulozyten (meist Eosinophile) von Neutrophilen, und es ist daher die Haupteinschränkung des vorgestellten Protokolls, da selbst das Vorhandensein einer kleinzelligen Kontamination die Reaktion der Neutrophilen beeinflussen kann²⁴.

Hier wird eine zusammengefasste Methode vorgestellt, die auf Gradientenisolation basiert und frühere Methoden^{10,22 verfeinert.} Wir nutzen die derzeitige Unterbewertung der Neutrophilenspezifitäten, um rein menschliche Neutrophile mit begrenzten Restplättchen und Erythrozyten zuverlässig zu isolieren und so die Aktivierung von Neutrophilen und einen beschleunigten Tod zu verhindern. Der wichtigste Schritt ist die Schichtung des Gradienten, die viel effektiver erreicht wird, indem das Dichtegradientenmedium unter dem Blut hinzugefügt wird, um eine scharfe Grenzfläche zu erhalten. Eine schnelle Untersuchung des PBMC-Rings und des Gradienten nach der Zentrifugation kann mögliche Kontaminationen, Aktivierungen und geringe Ausbeuten aufdecken. Bei der Arbeit mit einer Leukapheresemembran oder einem Buffy-Mantel ist die Verdünnung des Blutes wichtig, da eine übermäßige Zelldichte zu Zellaggregation führen würde, was zu Verunreinigungen und Zellaktivierung führen würde.

Dieses Protokoll sollte innerhalb von 2 h abgeschlossen werden, um die Zellfrische zu gewährleisten, und Schritte mit dem Dichtegradientenmedium, Dextran und der Lyse sollten sofort durchgeführt werden, da die Exposition gegenüber diesen Lösungen Neutrophile verändern kann. Mit diesem Protokoll beträgt die erwartete Ausbeute an Neutrophilen mindestens ~ 10 Millionen / 10 ml Vollblut und mindestens ~ 60 Millionen / 10 ml Buffy Coat. Die Bewertung der Isolationsqualität sollte wie folgt erfolgen: aktivierte Neutrophile sollten weniger als 10%, Lymphozytenkontamination weniger als 5%, minimal eosinophil (gleiche Seitenstreuung, aber niedrigere Vorwärtsstreupopulation) und Zelllebensfähigkeit sollte über 90% liegen. Eine geringere Reinheit kann durch unsachgemäße Schichtung oder Lagerung des Dichtegradientenmediums oder durch die Qualität und Frische des Ausgangsblutprodukts entstehen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% Acetic Acid with Methylene Blue	Stemcell technologies	#07060
Attune NxT	invitrogen	A24858	FACS analyzer
Cd11b-PE	biolegend	301305
CD14-BV421	biolegend	367144
CD193-BV605	biolegend	310716
CD19-PerCP	biolegend	302228
CD3-PerCP	biolegend	300326
CD41-APC	biolegend	303710
Cd45-APC	biolegend	103111
CD62L-PE	biolegend	304802
CD66b-FITC	biolegend	305103
Centrifuge 5810R	Eppendorf	22625101	Centrifuge
Dextran	Fisher	BP1580
Fetal Bovine Serum (FBS)	R&D systems	S11150H	complement inactivation of FBS is recommended
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD	556547
Hanks balanced salt solution (-CaCl2), (-MgCl2) (-MgSO4)	Gibco	14175-095	HBSS without Ca2+/Mg2+ is advised  as they have been shown to lead to neutrohpil activation
Lymphoprep	Stemcell technologies	#07801	density gradient medium
MACSxpress Whole Blood Neutrophil Isolation Kit, human	Miltenyi	130-104-434
RPMI-1640	Gibco	11875093
Sodium chloride	sigma	71376
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermofisher	15250061
ultrapure water	KD medical	RGF-3410