変動性を制限するための網膜静脈閉塞マウスモデルの最適化

要約

ここでは、ローズベンガルとレーザー誘導網膜イメージング顕微鏡システムを使用した網膜静脈閉塞のための最適化されたプロトコルと、遺伝子組み換え株での再現性を最大化するための推奨事項について説明します。

要約

網膜静脈閉塞(RVO)のマウスモデルは、神経網膜の低酸素性虚血性損傷を研究するために眼科でよく使用されます。このレポートでは、重要なステップを指摘する詳細な方法と、さまざまな遺伝子組み換えマウス系統間で一貫して成功した閉塞率を達成するための最適化の推奨事項を提供します。RVOマウスモデルは、主に光増感色素の静脈内投与とそれに続く眼科誘導レーザーに取り付けられた網膜イメージング顕微鏡を使用したレーザー光凝固からなる。3つの変数が閉塞一貫性の決定要因として同定された。ローズベンガル投与後の待機時間を調整し、ベースラインと実験レーザー出力のバランスをとることにより、実験間のばらつきを制限し、より高い閉塞の成功率を達成することができます。この方法は、網膜浮腫および低酸素虚血性損傷を特徴とする網膜疾患の研究に使用することができる。さらに、このモデルは血管損傷を誘発するため、神経血管系、神経細胞死、および炎症の研究にも適用できます。

概要

網膜静脈閉塞症(RVO)は、2015年に世界中で約2,800万人が罹患した一般的な網膜血管疾患です¹。RVOは、働く高齢者と高齢者の視力低下と喪失につながり、近所の10年間で増加すると推定される進行中の視力を脅かす病気を表しています。RVOの明確な病状には、低酸素虚血性損傷、網膜浮腫、炎症、およびニューロン喪失が含まれます²。現在、この障害の治療の第一線は、血管内皮増殖因子(VEGF)阻害剤の投与によるものです。抗VEGF治療は網膜浮腫の改善に役立っていますが、多くの患者は依然として視力低下に直面しています³。この疾患の病態生理学をさらに理解し、潜在的な新しい治療ラインをテストするには、さまざまなマウス系統に対して機能的で詳細なRVOマウスモデルプロトコルを構成する必要があります。

マウスモデルは、ヒト患者に使用されるのと同じレーザー装置を実装し、マウスに適したサイズにスケーリングされたイメージングシステムと組み合わせて開発されました。RVOのこのマウスモデルは、2007年に最初に報告され^4、さらにEbneterらによって確立された^4,5。最終的に、モデルはFumaらによって最適化され、網膜浮腫⁶などのRVOの主要な臨床症状を再現しました。このモデルが最初に報告されて以来、多くの研究では、光増感剤色素を投与した後、レーザーで主要な網膜静脈を光凝固させることを使用してモデルが採用されてきました。ただし、投与される色素の量と種類、レーザー出力、および曝露時間は、この方法を使用した研究間で大きく異なります。これらの違いにより、モデルのばらつきが大きくなり、複製が困難になることがよくあります。現在まで、その最適化のための潜在的な道についての具体的な詳細を含む発表された研究はありません。

本報告では、C57BL/6J系統のRVOマウスモデルと、C57BL/6Jをバックグラウンドとし、遺伝子改変マウスの基準株としてRVO病理に関連するタモキシフェン誘導性内皮カスパーゼ-9ノックアウト(iEC Casp9KO)株の詳細な方法論を提示する。以前の研究では、内皮カスパーゼ-9の非アポトーシス活性化が網膜浮腫を引き起こし、神経細胞死を促進することが示されていました⁸。この株を使用した経験は、他の遺伝子組み換え株に適用できるRVOマウスモデルを調整するための潜在的な改変を決定し、洞察を提供するのに役立ちました。

プロトコル

このプロトコルは、眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚眼科研究協会(ARVO)の声明に従います。げっ歯類の実験は、コロンビア大学の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認および監視されました。

注:すべての実験では、体重約20gの生後2か月のオスのマウスを使用しました。

1. フロックス遺伝子の誘導遺伝子切除のためのタモキシフェンの調製と投与

注:網膜血管の直径は、動物の体重の影響を受ける可能性があります。実験に使用するすべての動物の体重が同じであることを確認してください。

1. コーン油中のタモキシフェンを20 mg / mLの濃度に希釈します。
   注:タモキシフェンは毒物であり、光に敏感です。アルミホイルなどで光から保護してください。
2. 溶液を数秒間ボルテックスします。
3. 55°Cのオーブンに15分間放置します。
   注意: タモキシフェンが完全に溶解していることを確認してください。追加のボルテックスが必要になる場合があります。
4. 溶液を4°Cで最大1週間保存します。
5. タモキシフェン注射には、26G針を装着した1mLシリンジを使用してください。.注射部位を70%エタノールで洗浄します。 2 mgのタモキシフェン(20 mg / mLの100 μL)を腹腔内(IP)に、特定の誘導性Creラインに従って確立された時間、1日1回投与します。.
6. 実験を開始する前に、動物に2日間の休息をとってください。

2. レーザー光凝固用試薬の調製

1. ローズベンガル
   注:ローズベンガルは光に敏感です。使用するまで暗所に保管し、最良の結果を得るために新鮮な準備をしてください。
   1. ローズベンガルを滅菌生理食塩水で5 mg / mLに希釈して調製し、0.2 μmシリンジフィルターでろ過します。
   2. ローズベンガルを含む26G針を取り付けた1mLシリンジを準備します。
2. ケタミン/キシラジン
   1. ケタミンとキシラジンを滅菌生理食塩水で次の濃度に希釈します:ケタミン(80-100 mg / kg)とキシラジン(5-10 mg / kg)。.
3. カルプロフェン
   1. カルプロフェンを滅菌生理食塩水で1 mg / mLに希釈します。.
   2. カルプロフェンを含む26 G針を取り付けた1 mLシリンジを準備します。
4. 滅菌生理食塩水
   1. 滅菌生理食塩水を入れた26 G針を取り付けた5 mLシリンジを準備します。

3.レーザーのセットアップ

1. 光ファイバーケーブルをそっと扱い、レーザーコントロールボックスと網膜イメージング顕微鏡のレーザーアダプターに接続します。
2. 網膜イメージング顕微鏡ランプボックスをオンにします。
3. コンピュータの電源を入れ、イメージングプログラムを開きます。
4. ホワイトバランスを調整するには、白い紙を使用してマウスの接眼レンズの前に置き、イメージングプログラムで [調整 ]をクリックします。
5. キーを回し、レーザーコントロールボックスの画面の指示に従って、レーザーコントロールボックスをオンにします。
   注:この実験で使用されるレーザーはクラス3Bであり、目の損傷を引き起こす可能性があります。レーザーを操作するときは保護ゴーグルを着用してください。
6. ベースラインのレーザー出力を確認します。
   1. レーザーパワーメーターを使用してください。
   2. レーザーコントロールボックスの画面を次のパラメータに調整します:50mWおよび2,000ms。
   3. レーザーをオンにして、パワーメーターを接眼レンズの前に置きます。
      注意: ベースラインレーザー出力をテストするときは、顕微鏡のライトがオフになっていることを確認してください。
   4. フットスイッチペダルを押してレーザーをアクティブにします。
   5. レーザー出力の読み取り値を13〜15mWにします。
      注意: レーザー出力の読み取りにより、網膜静脈閉塞の成功率が決まります。レーザー出力の読み取り値が低すぎる場合は、レーザー露光のパワーと時間を調整できます。推奨事項については 、表 1 を参照してください。
7. レーザーコントロールボックスの画面を次のパラメータに設定して、実験的なレーザー出力を調整します:100 mW、1,000 ms。
8. レーザーをオフにします。
   注意: 安全のため、および過熱を防ぐために、マウス間でレーザーをオフに保つことをお勧めします。

4.ローズベンガルのマウス尾静脈注射

1. 300mLのビーカーに500mLの水を注ぎます。
2. ビーカーを電子レンジで1分間温めます。
3. ビーカーの温水にガーゼを入れます。
4. マウスを拘束具に入れます。
5. ガーゼをマウスの尾にそっと押し込み、拡張した静脈を探します。温水拡張後にアルコールワイプを使用して注射部位を消毒します。
6. 注射部位に針を挿入し、注射器を引っ張って静脈にいることを確認します。次に、マウスの尾静脈を注射し、動物の体重に応じて正しい量(37.5 mg / kg)を投与します。血腫や出血を避けるために注射部位に圧力をかけます。サイトをワイプします。
7. マウスを拘束具から離し、ケージに戻します。
8. 麻酔薬を注射する前に、ローズベンガルが循環するまで8分待ちます。
   注意: これにより、ローズベンガル注射とレーザー照射の間に合計10分かかります。

5.主要静脈の閉塞

1. 加熱されたマウスプラットフォームの電源を入れます。
2. 各目にフェニレフリンとトロピカミドを1滴加えます。
3. 150 μLの麻酔薬、ケタミン(80-100 mg / kg)およびキシラジン(5-10 mg / kg)IPを注入します。
   注:この手順の間、マウスには2回のIPインジェクションが与えられました。したがって、側面は交互になりました。麻酔のためのIP注入は右下腹部象限に投与され、生理食塩水は左下腹部象限に注入されました。注射する前に注射器を引っ張って、針が腹部にあり、臓器ではないことを確認することをお勧めします。
4. 動物をつまんで麻酔の深さを決定し、反応しなくなるまで待ちます。
5. 眼あたり塩酸プロパラカインを1滴加える(鎮痛剤)。
6. 両目にゲル軟膏を追加します。
7. 150μLのカルプロフェンを耳の間に皮下注射します。
8. プラットフォームにマウスを合わせます。
9. 網膜眼底の視野が明確で焦点が合うまでプラットフォームを調整します。
10. 網膜静脈を数え、眼底の画像を撮ります。
    注:網膜静脈は動脈よりも暗くて広いです。静脈と動脈が交互になります。しかしながら、時には視神経の近くに分岐動脈があり得、したがって2つの隣接する動脈があり得る。
11. レーザーをオンにして、視神経乳頭から約375μmの網膜静脈に向けます。
12. フットスイッチを押し、レーザービームを100μmまでわずかに動かして血管に照射します。この手順を3回繰り返し、照射が1つのスポットに集中しないように、各パルスの後にレーザービームを移動します。
13. 他の主要な血管への照射を繰り返して、2〜3回の閉塞を達成します。

6.0日目に閉塞した静脈の数を確立する

1. 血管に照射した後、ランプを消し、10分間待ちます。
   注意: 光にさらされると、網膜の損傷や炎症を引き起こす可能性があります。ランプをオフにします^{amp 露出を最小限に抑える}ために、待機時間中は7。
2. ランプをオンに戻し、閉塞した静脈の数を数えます。
3. 眼底の画像を撮ります。

7.アフターケア

1. 1 mLの滅菌生理食塩水IPを注入します。
   注: IP インジェクションの詳細については、セクション 5、ステップ 3 を参照してください。
2. 両目に潤滑剤点眼薬を追加します。
3. 両目にゲル軟膏を追加します。
4. マウスが麻酔から回復するのを観察し、完全に回復するまで他の動物と一緒にケージに戻さないでください。カルプロフェン(5 mg / kg)は、手順後2日まで毎日投与できます。.人間に適用した場合、痛みはRVOの症状ではありません。
   注意: 麻酔から完全に回復するまで、動物を放置しないでください。

8.光干渉断層撮影(OCT)による網膜浮腫の評価

注:このステップは、調査員の関心のある時点で実行できます。C57BL/6Jマウスの網膜浮腫のピークは、RVO手術の1日後です。この時点は、マウスの背景によって異なる場合があります。

1. 網膜イメージング顕微鏡ライトボックス、OCTマシン、および加熱マウスプラットフォームの電源を入れます。
2. 閉塞の翌日、手順5.2〜5.7に従って動物を準備します。
3. イメージングおよびOCTソフトウェアプログラムを開きます。
4. OCT プログラムで、微調整を 5 に調整します。
5. 火傷から75μm離れた場所でOCTを服用するか、4クリックします。
6. 網膜の4象限でOCT画像を撮影します。
7. トレース ソフトウェアを使用して OCT 画像を解析します。
8. 照射前の測定値の網膜の厚さをRVOの1日後または関心のある時点で比較します。
   注:データを分析するときは、網膜浮腫の発症に影響を与える可能性があるため、照射された静脈の数を考慮してください。その後、動物は麻酔薬を投与し、続いて灌流非生存手術を行うことによって安楽死させる。

結果

RVOマウスモデルは、網膜静脈の閉塞を成功裏に達成し、低酸素虚血性損傷、血液網膜関門の破壊、神経細胞死、および網膜浮腫を引き起こすことを目指しています⁸。図1は、再現性を確保するためのステップのタイムライン、実験計画の概略 図 を示し、実験の質問に応じてさらに最適化できるステップの概要を示しています。変更できる3つの主要な?...

ディスカッション

マウスRVOモデルは、RVOの病理をさらに理解し、潜在的な治療法をテストするための手段を提供します。マウスRVOモデルは現場で広く使用されていますが、その変動性に対処し、モデルの最適化を記述するモデルの現在の詳細なプロトコルが必要です。ここでは、実験動物のコホート全体で最も一貫した結果を得るために何を変更できるかについての経験からの例をガイドし、信頼できるデー?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carprofen	Rimadyl	NADA #141-199	keep at 4 °C
Corn Oil	Sigma-Aldrich	C8267
Fiber Patch Cable	Thor Labs	M14L02
GenTeal	Alcon	00658 06401
Ketamine Hydrochloride	Henry Schein	NDC: 11695-0702-1
Lasercheck	Coherent	1098293
Phenylephrine	Akorn	NDCL174478-201-15
Phoneix Micron IV with Meridian,  StreamPix, and OCT modules	Phoenix Technology Group
Proparacaine Hydrochloride	Akorn	NDC: 17478-263-12	keep at 4 °C
Refresh	Allergan	94170
Rose Bengal	Sigma-Aldrich	330000-5G
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648-5G	light-sensitive
Tropicamide	Akorn	NDC: 174478-102-12
Xylazine	Akorn	NDCL 59399-110-20