Purification des canaux potentiels des récepteurs transitoires endogènes de la drosophile

Résumé

Sur la base du mécanisme d’assemblage du complexe protéique INAD, dans ce protocole, une stratégie modifiée de purification d’affinité et de compétition a été développée pour purifier le canal endogène TRP de la drosophile .

Résumé

La phototransduction de la drosophile est l’une des voies de signalisation couplées à la protéine G les plus rapides connues. Pour assurer la spécificité et l’efficacité de cette cascade, le canal cationique perméable au calcium (Ca²⁺), le potentiel récepteur transitoire (TRP), se lie étroitement à la protéine de l’échafaudage, l’inactivation sans potentiel Après potentiel D (INAD), et forme un grand complexe protéique de signalisation avec la protéine kinase C (ePKC) spécifique à l’œil et le potentiel de récepteur Cβ/No de la phospholipase A (PLCβ/NORPA). Cependant, les propriétés biochimiques du canal TRP de la drosophile restent floues. Sur la base du mécanisme d’assemblage du complexe protéique INAD, une purification d’affinité modifiée et une stratégie de compétition ont été développées pour purifier le canal endogène TRP. Tout d’abord, le fragment NORPA 863-1095 purifié marqué à l’histidine (His) a été lié à des perles de Ni et utilisé comme appât pour extraire le complexe protéique endogène de l’INAD des homogénats de tête de drosophile. Ensuite, un fragment TRP 1261-1275 purifié excessif marqué par la glutathion S-transférase (GST) a été ajouté aux perles de Ni pour concurrencer le canal TRP. Enfin, le canal TRP dans le surnageant a été séparé du peptide TRP 1261-1275 excessif par chromatographie d’exclusion de taille. Cette méthode permet d’étudier le mécanisme de contrôle du canal TRP de la drosophile sous des angles biochimiques et structurels. Les propriétés électrophysiologiques des canaux TRP purifiés de la drosophile peuvent également être mesurées à l’avenir.

Introduction

La phototransduction est un processus où les photons absorbés sont convertis en codes électriques des neurones. Il relaie exclusivement les opsines et la cascade de signalisation couplée à la protéine G suivante chez les vertébrés et les invertébrés. Chez la drosophile, en utilisant ses cinq domaines PDZ, l’inactivation de la protéine d’échafaudage sans potentiel postérieur D (INAD) organise un complexe de signalisation supramoléculaire, qui se compose d’un canal de potentiel de récepteur transitoire (TRP), de potentiel de récepteur Cβ/No de la phospholipase A (PLCβ/NORPA) et d’une protéine kinase C (ePKC)¹ spécifique à l’œil. La formation de ce complexe de signalisation supramoléculaire garantit la localisation subcellulaire correcte, une efficacité élevée et la spécificité de la machinerie de phototransduction de la drosophile. Dans ce complexe, les canaux TRP sensibles à la lumière agissent comme des effecteurs en aval de NORPA et médient l’afflux de calcium et la dépolarisation des photorécepteurs. Des études antérieures ont montré que l’ouverture du canal TRP de la drosophile est médiée par les protons, la perturbation de l’environnement lipidique local ou la force mécanique ^2,3,4. Le canal TRP de la drosophile interagit également avec la calmoduline⁵ et est modulé par le calcium par rétroaction positive et négative ^6,7,8.

Jusqu’à présent, les études d’électrophysiologie sur le mécanisme de contrôle des canaux TRP et TRP-like (TRPL) de la drosophile étaient basées sur des patchs membranaires excisés, des enregistrements de cellules entières de photorécepteurs dissociés de type sauvage de la drosophile et des canaux hétéro-exprimés dans les cellules^S2, SF9 ou HEK 2,9,10,11,12,13, mais pas sur les canaux purifiés. Les informations structurelles du canal TRP complet de la drosophile restent également floues. Afin d’étudier les propriétés électrophysiologiques des protéines purifiées dans un environnement membranaire reconstitué et d’obtenir des informations structurelles sur le canal TRP de drosophile sur toute la longueur, l’obtention de canaux TRP purifiés sur toute la longueur est la première étape nécessaire, similaire aux méthodologies utilisées dans les études des canaux TRP des mammifères 14,15,16,17.

Récemment, sur la base du mécanisme d’assemblage du complexe protéique INAD 18,19,20, une stratégie de purification d’affinité et de compétition a d’abord été développée pour purifier le canal TRP des homogénats de tête de drosophile par des billes de streptavidine 5. Compte tenu de la faible capacité et du coût élevé des perles de streptavidine, un protocole de purification amélioré est introduit ici qui utilise la protéine d’appât marquée His et les perles Ni correspondantes à faible coût avec une capacité beaucoup plus élevée. La méthode proposée aidera à étudier le mécanisme de contrôle du canal TRP sous des angles structurels et à mesurer les propriétés électrophysiologiques du canal TRP avec des protéines purifiées.

Protocole

1. Purification du TRP étiqueté GST et des fragments NORPA étiquetés His

1. Purifier le fragment TRP 1261-1275 étiqueté TPS
   1. Transformez le plasmide¹⁰ pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 en cellules Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) à l’aide de la méthode de transformation par choc thermique CaCl₂ ²¹. Inoculer une seule colonie dans 10 mL de milieu Luria Bertani (LB) et croître pendant la nuit à 37 °C. Ensuite, amplifier les 10 mL de culture d’ensemencement dans 1 L de milieu LB à 37 °C.
   2. Une fois que la densité optique (OD₆₀₀) des cellules atteint 0,5, refroidir les cellules à 16 °C et ajouter 0,1 mM d’isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; concentration finale) pour induire la surexpression de la protéine cible et incuber à 16 °C pendant 18 h.
   3. Après surexpression, pastille 1 L de cellules cultivées par centrifugation à 3 993 × g pendant 20 min et remettre en suspension dans 40 mL de tampon salin tamponné au phosphate (PBS).
   4. Chargez les cellules remises en suspension dans un homogénéisateur haute pression pré-refroidi à 4 °C. Augmentez lentement la pression de l’homogénéisateur à 800 bars. Ouvrez le robinet d’entrée et laissez les cellules remises en suspension passer circulairement à travers une vanne à fentes très étroites.
      REMARQUE: Les cellules sont homogénéisées par les forces de cisaillement élevées causées par une chute de pression et une cavitation importantes.
   5. Chargez 5 mL de billes de glutathion dans une colonne d’écoulement par gravité et lavez les billes avec 50 mL de tampon PBS pour un total de trois fois.
   6. Centrifuger le lysat de cellule de l’homogénéisateur haute pression à 48 384 x g. Ajouter le surnageant du lysat de cellule centrifugée (40 mL) aux billes de glutathion équilibrées dans la colonne d’écoulement gravitaire et incuber pendant 30 min à 4 °C. Remettez en suspension les perles de glutathion toutes les 10 minutes.
   7. Après 30 min d’incubation, ouvrez le robinet de sortie de colonne pour séparer les perles et la fraction d’écoulement. Jetez la fraction d’écoulement. Rincez deux fois les billes de glutathion restantes avec 50 mL de tampon PBS.
   8. Ajouter 15 mL de tampon d’élution aux billes de glutathion et incuber pendant 30 min. Resuspendez les perles toutes les 10 minutes.
   9. Après 30 min d’incubation, éluez le fragment TRP 1261-1275 marqué GST dans un tube conique de 50 mL et chargez-le dans une colonne d’exclusion de taille (grade de préparation), qui est équilibré à l’aide d’un tampon Tris de 50 mM (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
   10. Maintenir le débit d’élution de la colonne d’exclusion de taille à 3 mL/min. Recueillir les protéines éluées à raison de 5 mL/tube.
   11. Identifier le pic de la protéine cible dans la colonne d’exclusion de taille en analysant les signaux d’absorption UV à 280 nm et vérifier par analyse de gel SDS-PAGE (paramètres d’électrophorèse : 150 V pour le gel empilable ; 200 V pour le gel résolvant). Tachez le gel avec coomassie bleu R250.
   12. Concentrer le fragment purifié TRP 1261-1275 marqué GST de la colonne d’exclusion de taille à 1 mL à l’aide d’une colonne de spin d’ultrafiltration de 15 mL centrifugée à 3 000 x g à 4 °C dans une centrifugeuse réfrigérée de bureau.
   13. Déterminer la concentration de protéines concentrées à l’aide de la loi de Beer-Lambert. Mesurez l’absorption UV du fragment TRP 1261-1275 marqué GST à 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
   14. Obtenir le coefficient d’extinction à 280 nm en important les séquences protéiques dans le programme Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). En règle générale, la culture de 1 L de TRP 1261-1275 marqué GST donne 1 mL de 600 μM de protéines (6 x ^10-7 mol). Voir le tableau 1 pour les matériaux nécessaires.
2. Purification du fragment NORPA 863-1095 étiqueté His
   1. Transformer le plasmide²⁰ pETM.3C NORPA 863-1095 en cellules E. coli BL21 (DE3) à l’aide de la méthode de transformation par choc thermique CaCl₂ ²¹. Inoculer une seule colonie dans 10 mL de milieu LB et croître pendant la nuit à 37 °C. Ensuite, amplifier la culture d’ensemencement de 10 mL dans 1 L de milieu LB à 37 °C.
   2. Une fois que la DO₆₀₀ des cellules atteint 0,5, refroidir les cellules à 16 °C et ajouter 0,1 mM d’IPTG (concentration finale) pour induire la surexpression de la protéine cible et incuber à 16 °C pendant 18 h.
   3. Après surexpression, pastille 1 L de cellules cultivées par centrifugation à 3 993 x g pendant 20 min et remise en suspension dans 40 mL de tampon de liaison. Ensuite, lyser les cellules remises en suspension dans un homogénéisateur à haute pression à 4 °C comme décrit à l’étape 1.1.4.
   4. Chargez 5 mL de billes de Ni dans une colonne d’écoulement par gravité et lavez trois fois avec 50 mL de tampon de liaison.
   5. Centrifuger le lysat de cellule de l’homogénéisateur haute pression à 48 384 x g. Ajouter le surnageant du lysat de cellule centrifugée aux billes de Ni équilibrées dans la colonne d’écoulement par gravité et incuber pendant 30 min à 4 °C. Resuspendez les perles de Ni toutes les 10 minutes.
   6. Après 30 min d’incubation, ouvrez le robinet de sortie de colonne pour séparer les perles et la fraction d’écoulement. Jetez la fraction d’écoulement et lavez les billes de Ni restantes deux fois avec 50 mL de tampon de lavage.
   7. Ajouter 15 mL de tampon d’élution aux ni-billes et incuber pendant 30 min. Resuspendez les perles de Ni toutes les 10 minutes.
   8. Après 30 min d’incubation, recueillir le fragment NORPA 863-1095 marqué His élué dans un tube conique de 50 mL et charger dans une colonne d’exclusion de taille (grade de préparation), qui est équilibrée à l’aide de Tris de 50 mM (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
   9. Maintenir le débit d’élution de la colonne d’exclusion de taille à 3 mL/min. Recueillir la protéine éluée à raison de 5 mL/tube.
   10. Identifier le pic de la protéine cible dans la colonne d’exclusion de taille en analysant les signaux d’absorption UV à 280 nm et vérifier par analyse de gel SDS-PAGE (paramètres d’électrophorèse : 150 V pour le gel empilable ; 200 V pour le gel résolvant). Tassez le gel à l’aide de Coomassie bleu R250.
   11. Concentrer le fragment NORPA 863-1095 purifié de la colonne d’exclusion de taille à 1 mL à l’aide d’une colonne de spin d’ultrafiltration de 15 mL centrifugée à 3 000 x g à 4 °C dans une centrifugeuse réfrigérée de bureau.
   12. Déterminer la concentration de protéines concentrées à l’aide de la loi de Beer-Lambert. Mesurez l’absorption UV du fragment NORPA 863-1095 marqué his à 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
   13. Obtenir le coefficient d’extinction à 280 nm en important les séquences protéiques dans le programme Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Typiquement, la culture de 1 L du fragment NORPA 863-1095 marqué par His donne 1 mL de 600 μM de protéine (6 x ^10-7 mol). Voir le tableau 2 pour les matériaux nécessaires.

2. Préparation des têtes de drosophiles

1. Recueillir les mouches adultes dans des tubes de centrifugation conique de 50 mL à l’aide de la méthode d’anesthésie au CO^{2 22,23}; congeler immédiatement dans de l’azote liquide pendant 10 min et conserver dans un congélateur à -80°C.
2. Après avoir recueilli un nombre suffisant de mouches, secouez vigoureusement les tubes coniques congelés de 50 mL à la main pour séparer les pattes, la tête, les ailes et le corps des mouches. Transférer le mélange dans trois tamis en acier inoxydable pré-refroidis séquentiellement (maillage 20/30/40, respectivement) et agiter les tamis.
3. Ensuite, comme les têtes ne peuvent pas passer à travers le tamis à 40 mailles, utilisez une brosse pour balayer les têtes de mouche du tamis à 40 mailles, transférez-les dans des tubes coniques de 50 mL et stockez-les à −80 °C.
4. Recueillir en permanence les mouches et leurs têtes et les stocker dans un congélateur à -80 °C jusqu’à ce qu’elles atteignent la quantité requise pour l’expérimentation (0,5 g). En règle générale, pour recueillir 0,5 g de têtes, 35 mL de mouches dans un tube conique de 50 mL sont nécessaires. Voir le tableau 3 pour les matériaux nécessaires.

3. Purification du canal TRP de la drosophile

1. Peser un total de 0,5 g de têtes et homogénéiser complètement dans l’azote liquide à l’aide d’un pilon de mortier pré-refroidi. Dissoudre les têtes homogénéisées dans un tampon de lyse de 10x v/w (5 mL), incuber dans un agitateur à 4 °C pendant 20 min, puis centrifuger à 20 817 x g pendant 20 min à 4 °C.
2. Recueillir le surnageant de spin-down (« 20817 g S », Figure 4) et le centrifuger à 100 000 x g pendant 60 min à 4 °C. Utilisez le surnageant de rotation (« 100 000 g S », figure 4) pour le test de traction suivant.
3. Ajouter 1 mL de billes de Ni dans la colonne d’écoulement par gravité et laver les billes avec 10 mL de_H2O(ddH₂O) double distillé à 4 °C pour un total de trois fois. Équilibrer les billes avec 10 volumes de colonne de tampon de lyse trois fois à 4 °C.
4. Ajouter 500 μL de 600 μM de protéine NORPA 863-1095 purifiée marquée His-1095 (3 x ^10-7 mol) dans la colonne Ni et incuber pendant 30 min à 4 °C. Resuspendez les perles toutes les 10 minutes.
5. Ouvrez le robinet de sortie de la colonne pour séparer les perles et la fraction de flux. Prenons la fraction de flux pour l’analyse SDS-PAGE (NORPA F, Figure 4). Dans cette section, les protéines d’appât sont immobilisées sur les perles de Ni.
6. Lavez les billes de Ni avec 10 volumes de colonne de tampon de lyse (10 mL) à 4 °C et conservez la fraction de lavage pour l’analyse SDS-PAGE (Lavage 1, Figure 4A). Répétez les étapes ci-dessus et conservez l’échantillon pour l’analyse SDS-PAGE (Lavage 2, Figure 4A). Dans cette section, les protéines d’appât excessives sur les perles de Ni sont éliminées.
7. Ajouter le surnageant de l’homogénat de tête de drosophile après centrifugation de 100 000 x g dans la colonne Ni à 4 °C, où le fragment NORPA 863-1095 marqué par His a été immobilisé.
8. Incuber le surnageant avec les perles de Ni à 4 °C pendant 30 min. Resuspendez les perles toutes les 10 minutes. Ensuite, ouvrez le robinet de sortie de colonne pour séparer les perles et la fraction d’écoulement.
9. Recueillir le surnageant pour l’analyse SDS-PAGE (lyse de tête Dro F, Figure 4A). Dans cette section, les complexes protéiques INAD (INAD/TRP/ePKC) dans les homogénats de tête sont capturés par les fragments NORPA 863-1095 immobilisés sur les ni-billes.
10. Laver les billes de Ni avec 10 volumes de colonne de tampon de lyse (10 mL) à 4 °C et garder le surnageant des précipitations par gravité pour l’analyse SDS-PAGE (Wash 3, Figure 4A). Répétez les étapes ci-dessus et collectez le surnageant pour l’analyse SDS-PAGE (Lavage 4, Figure 4A). Dans cette section, les protéines non liées sur les perles de Ni sont éliminées.
11. Ajouter 500 μL de 600 μM de protéine TRP 1261-1275 marquée GST (3 x ^10-7 mol) dans les billes de Ni et incuber pendant 20 min à 4 °C. Resuspendez les perles toutes les 10 minutes.
12. Recueillir la fraction éluée de la colonne de gravité (TRP E1, Figure 4B), qui contient le canal endogène Drosophila TRP. Répétez les étapes ci-dessus et collectez la fraction d’élution (TRP E2, Figure 4B). Dans cette étape, en utilisant les fragments TRP 1261-1275 marqués GST comme concurrent, les canaux TRP sont élués à partir des complexes protéiques INAD capturés (INAD / TRP / ePKC) sur les perles Ni.
13. Laver les billes de Ni avec 10 volumes de colonne de tampon de liaison (10 mL; Tableau 1) à 4 °C et recueillir la fraction de lavage pour l’analyse SDS-PAGE (Lavage 5, Figure 4B).
14. Ajouter 500 μL de tampon d’élution (tableau 1) dans les billes de Ni et incuber pendant 20 min à 4 °C. Recueillir la fraction d’élution de la colonne d’écoulement gravitaire (NORPA E1, figure 4B). Répétez les étapes ci-dessus et collectez la fraction d’élution (NORPA E2, Figure 4B).
15. À l’aide du tampon d’élution, éluez le fragment NORPA 863-1095 marqué His accompagné des complexes protéiques INAD/ePKC. Ensuite, remettez en suspension les billes de Ni dans 500 μL de tampon de liaison.
16. Prenez les billes de Ni remises en suspension pour exécuter la SDS-PAGE (colorée par Coomassie bleu R250) afin d’analyser l’efficacité de l’élution et d’évaluer si le tampon d’élute fonctionne (perles, Figure 4B). Voir le tableau 4 pour les matériaux nécessaires.

4. Purification de la colonne d’exclusion de taille du canal TRP de la drosophile

1. Installez une colonne d’exclusion de taille (grade analytique) sur le système de purification des protéines. Équilibrez la colonne avec le tampon de colonne (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,75 mM DDM), qui est filtré par un filtre de 0,45 μm.
2. Concentrer la fraction TRP E1 et E2 de l’étape 3.14 à l’aide d’une colonne de spin d’ultrafiltration de 4 mL, centrifugée à 3 000 x g à 4 °C dans une centrifugeuse réfrigérée.
3. Rincez la boucle d’échantillon avec le tampon de colonne et chargez l’échantillon dans la boucle d’échantillonnage. Injecter l’échantillon dans la colonne d’exclusion de taille et éluer les protéines avec un débit approprié (0,5 mL/min).
4. Identifier le pic de la protéine cible par absorption à 280 nm et exécuter un gel SDS-PAGE pour détecter le canal endogène purifié de la Drosophile TRP (Figure 5). Voir le tableau 5 pour les matériaux nécessaires.

Résultats

Dans cet article, il est démontré qu’une méthode de purification des protéines purifie le canal endogène TRP de la drosophile (Figure 1).

Tout d’abord, l’expression et la purification des protéines recombinantes sont appliquées pour obtenir les protéines d’appât et concurrentes. Ensuite, un fragment TRP 1261-1275 marqué GST est exprimé dans des cellules E. coli BL21 (DE3) en milieu LB et purifié à l’aide de billes de glutat...

Discussion

INAD, qui contient cinq domaines PDZ, est le principal organisateur des machines de phototransduction de la drosophile. Des études antérieures ont montré que INAD PDZ3 se lie à la queue C-terminale du canal TRP avec une spécificité exquise (K_D = 0,3 μM)¹⁸. Le tandem INAD PDZ45 interagit avec le fragment NORPA 863-1095 avec une affinité de liaison extrêmement élevée (K_D = 30 nM). Ces résultats fournissent une base biochimique solide pour concevoir la strat...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacterial strains
BL21(DE3) Competent Cells	Novagen	69450	Protein overexpression
Experiment models
D.melanogaster: W1118 strain	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC:3605	Drosophila head preparation
Material
20/30/40 mesh stainless steel sieves	Jiufeng metal mesh company	GB/T6003.1	Drosophila head preparation
30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1)	Lablead	A3291	SDS-PAGE gel preparation
Ammonium Persulfate	Invitrogen	HC2005	SDS-PAGE gel preparation
Cocktail protease inhibitor	Roche	05892953001	Protease inhibitor
Coomassie brilliant blue R-250	Sangon Biotech	A100472-0025	SDS-PAGE gel staining
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sangon Biotech	A620058-0100	Size-exclusion column buffer preparation
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)	Sangon Biotech	A500838-0500	Size-exclusion column buffer preparation
Glycine	Sangon Biotech	A610235-0005	SDS-PAGE buffer preparation
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads	Cytiva	17513202	Affinity chromatography
Imidazole	Sangon Biotech	A500529-0001	Elution buffer preparation for Ni-column
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sangon Biotech	A600168-0025	Induction of protein overexpression
LB Broth Powder	Sangon Biotech	A507002-0250	E.coli. cell culture
L-Glutathione reduced (GSH)	Sigma-aldrich	G4251-100G	Elution buffer preparation for Glutathione beads
Ni-Sepharose excel beads	Cytiva	17371202	Affinity chromatography
N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM)	Sangon Biotech	A610424-001	Detergent for protein purification
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-aldrich	T9281-100ML	SDS-PAGE gel preparation
PBS	Sangon Biotech	E607008-0500	Homogenization buffer for E.coli. cell
PMSF	Lablead	P0754-25G	Protease inhibitor
Prestained protein marker	Thermo Scientific	26619/26616	Prestained protein ladder
Size exclusion column (preparation grade)	Cytiva	28989336	HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column
Size exclusion column (analytical grade)	Cytiva	29091596	Superose 6 Increase 10/300 GL column
Sodium chloride	Sangon Biotech	A501218-0001	Protein purification buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sangon Biotech	A500228-0001	SDS-PAGE gel/buffer preparation
Tris base	Sigma-aldrich	T1503-10KG	Protein purification buffer preparation
Ultrafiltration spin column	Millipore	UFC901096/801096	Protein concentration
Equipment
Analytical Balance	DENVER	APX-60	Metage of Drosophila head
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes	Eppendorf	5810R	Protein concentration
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes	Eppendorf	5417R	Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization
Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm)	Bio-Rad	738-0015	TRP protein purification
Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm)	Bio-Rad	738-0017	Bait and competitor protein purification from E.coli.
Gel Documentation System	Bio-Rad	Universal Hood II Gel Doc XR System	SDS-PAGE imaging
High-speed refrigerated centrifuge	Beckman coulter	Avanti J-26 XP	Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate
High pressure homogenizer	UNION-BIOTECH	UH-05	Homogenization of E.coli. cells
Liquid nitrogen tank	Taylor-Wharton	CX-100	Drosophila head preparation
Protein purification system	Cytiva	AKTA purifier	Protein purification
Refrigerator (-80°C)	Thermo	900GP	Drosophila head preparation
Spectrophotometer	MAPADA	UV-1200	OD600 measurement of E.coli. cells
Spectrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop 2000c	Determination of protein concentration
Ultracentrifuge	Beckman coulter	Optima XPN-100 Ultracentrifuge	Ultracentrifugation