È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Viene descritta una metodologia di imaging a dispersione Raman coerente per visualizzare e quantificare i composti farmaceutici all'interno della pelle. Questo documento descrive la preparazione del tessuto cutaneo (umano e murino) e l'applicazione della formulazione topica, l'acquisizione di immagini per quantificare i profili di concentrazione spaziotemporale e l'analisi farmacocinetica preliminare per valutare la somministrazione topica di farmaci.
La farmacocinetica cutanea (cPK) dopo l'applicazione di formulazioni topiche è stata un'area di ricerca di particolare interesse per gli scienziati regolatori e di sviluppo di farmaci per comprendere meccanicamente la biodisponibilità topica (BA). Le tecniche semi-invasive, come lo stripping del nastro, la microdialisi cutanea o la microperfusione cutanea a flusso aperto, quantificano tutte la cPK su macroscala. Mentre queste tecniche hanno fornito una vasta conoscenza di cPK, la comunità manca di una comprensione meccanicistica della penetrazione e della permeazione del principio attivo farmaceutico (API) a livello cellulare.
Un approccio non invasivo per affrontare la cPK su microscala è il Raman scattering imaging (CRI) coerente, che si rivolge selettivamente alle vibrazioni molecolari intrinseche senza la necessità di etichette estrinseche o modifiche chimiche. CRI ha due metodi principali - anti-Stokes Raman scattering (CARS) e scattering Raman stimolato (SRS) - che consentono la quantificazione sensibile e selettiva di API o ingredienti inattivi. CARS viene in genere utilizzato per ricavare informazioni strutturali sulla pelle o visualizzare il contrasto chimico. Al contrario, il segnale SRS, che è lineare con la concentrazione molecolare, viene utilizzato per quantificare le API o gli ingredienti inattivi all'interno delle stratificazioni cutanee.
Sebbene il tessuto di topo sia stato comunemente utilizzato per cPK con CRI, il BA topico e la bioequivalenza (BE) devono essere valutati nel tessuto umano prima dell'approvazione normativa. Questo documento presenta una metodologia per preparare e visualizzare la pelle ex vivo da utilizzare in studi CRI di farmacocinetica quantitativa nella valutazione di BA e BE topici. Questa metodologia consente una quantificazione API affidabile e riproducibile all'interno della pelle umana e del mouse nel tempo. Le concentrazioni all'interno dei compartimenti ricchi di lipidi e poveri di lipidi, così come la concentrazione totale di API nel tempo sono quantificate; questi sono utilizzati per stime di MICRO e macroscala BA e, potenzialmente, BE.
Le metodologie per valutare la cPK dopo l'applicazione di un farmaco topico si sono estese dagli studi classici di test di permeazione in vitro (IVPT) 1,2,3,4,5 e tape-stripping 6,7,8 a metodologie aggiuntive come la microperfusione a flusso aperto o la microdialisicutanea 9,10,11, 12,13,14. Esistono potenzialmente vari siti locali di azione terapeutica a seconda della malattia di interesse. Quindi, potrebbe esserci un numero corrispondente di metodologie per valutare la velocità e la misura in cui un'API arriva al sito di azione locale previsto. Mentre ciascuna delle metodologie di cui sopra ha i suoi vantaggi, il principale svantaggio è la mancanza di informazioni cPK su microscala (cioè l'incapacità di visualizzare dove va l'API e come permea).
Una metodologia non invasiva di interesse per stimare BA e BE topici è CRI, che può essere suddivisa in due modalità di imaging: CARS e microscopia SRS. Questi metodi Raman coerenti consentono l'imaging chimicamente specifico delle molecole tramite effetti Raman non lineari. In CRI, due treni di impulsi laser vengono focalizzati e scansionati all'interno di un campione; la differenza di energia tra le frequenze laser è impostata per indirizzare modalità vibrazionali specifiche per le strutture chimiche di interesse. Poiché i processi CRI non sono lineari, un segnale viene generato solo al fuoco del microscopio, consentendo l'imaging tomografico farmacocinetico tridimensionale del tessuto. Nel contesto della cPK, CARS è stato utilizzato per ottenere informazioni strutturali sui tessuti, come la posizione delle strutture cutanee ricche di lipidi15. Al contrario, SRS è stato utilizzato per quantificare la concentrazione molecolare in quanto il suo segnale è lineare con la concentrazione. Per i campioni di pelle ex vivo , è vantaggioso eseguire CARS nella direzione epi16 e SRS in modalità di trasmissione17. Pertanto, i campioni di tessuto sottili consentiranno il rilevamento e la quantificazione del segnale SRS.
Come tessuto modello, l'orecchio del topo nudo presenta diversi vantaggi con piccoli inconvenienti. Un vantaggio è che il tessuto ha già uno spessore di ~ 200-300 μm e non richiede un'ulteriore preparazione del campione. Inoltre, diverse stratificazioni cutanee sono osservate concentrandosi assialmente attraverso un campo visivo (ad esempio, strato corneo, ghiandole sebacee (SG), adipociti e grasso sottocutaneo)16,18. Ciò consente una stima preclinica preliminare delle vie di permeazione cutanea e stime topiche di BA prima di passare a campioni di pelle umana. Tuttavia, il modello di topo nudo presenta limitazioni come la difficoltà di estrapolazione a scenari in vivo a causa delle differenze nella struttura della pelle19. Mentre l'orecchio del topo nudo è un modello eccellente per ottenere risultati preliminari, il modello della pelle umana è il gold standard. Sebbene ci siano stati vari commenti sull'idoneità e l'applicabilità della pelle umana congelata per ricapitolare accuratamente la cinetica di permeazione in vivo 20,21,22, l'uso della pelle umana congelata è un metodo accettato per la valutazione della cinetica di permeazione API in vitro 23,24,25 . Questo protocollo visualizza vari strati di pelle nella pelle di topo e umana mentre quantifica le concentrazioni di API all'interno di strutture ricche di lipidi e povere di lipidi.
Mentre cri è stato utilizzato in numerosi campi per visualizzare specificamente i composti all'interno dei tessuti, ci sono stati sforzi limitati per studiare la cPK dei prodotti farmaceutici applicati localmente. Per valutare il BA/BE topico dei prodotti topici utilizzando CRI, è necessario prima disporre di un protocollo standardizzato per effettuare confronti accurati. Gli sforzi precedenti che utilizzano CRI per la somministrazione di farmaci alla pelle hanno dimostrato variabilità all'interno dei dati. Poiché si tratta di un'applicazione relativamente nuova del CRI, stabilire un protocollo è fondamentale per ottenere risultati affidabili 18,26,27. Questo approccio si rivolge solo a un numero d'onda specifico nella regione biologica silenziosa dello spettro Raman. Tuttavia, la maggior parte delle API e degli ingredienti inattivi hanno spostamenti Raman all'interno della regione delle impronte digitali. Ciò ha precedentemente posto sfide a causa del segnale intrinseco derivante dal tessuto nella regione delle impronte digitali. I recenti progressi laser e computazionali hanno rimosso questa barriera, che può anche essere utilizzata in combinazione con l'approccio presentato qui28. Questo approccio qui presentato consente la quantificazione di un'API, che ha uno spostamento Raman nella regione silenziosa (2.000-2.300 cm-1). Questo non è limitato alle proprietà fisiochimiche del farmaco, che potrebbe essere il caso di alcune metodologie di monitoraggio cPK precedentemente menzionate29.
Il protocollo deve ridurre la variabilità da campione a campione nello spessore della pelle per vari preparati, poiché i campioni di pelle umana spessa produrranno un segnale minimo dopo l'applicazione del prodotto farmaceutico a causa della diffusione della luce da parte del campione spesso. Uno degli obiettivi di questo manoscritto è quello di presentare una metodologia di preparazione dei tessuti che assicuri standard di imaging riproducibili. Inoltre, il sistema CRI è configurato come descritto per ridurre le potenziali fonti di errore e minimizzare il rapporto segnale-rumore. Tuttavia, questo documento non discuterà i principi guida e i meriti tecnici del microscopio CRI in quanto questo è stato precedentemente trattato30. Infine, viene esplorata l'ampia procedura di analisi dei dati per consentire l'interpretazione dei risultati per determinare il successo o il fallimento di un esperimento.
L'uso di tessuto auricolare di topo nudo è stato approvato dal Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), mentre l'uso di tessuto cutaneo umano è stato approvato dal Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (IRB). Secondo i protocolli IACUC, i topi appena eutanasizzati sono stati ottenuti da collaboratori con colonie di topi nudi. Il tessuto umano è stato prelevato da procedure elettive di addominoplastica presso il Massachusetts General Hospital tramite un protocollo approvato. Inoltre, specifici tipi di tessuto diversi dalla pelle addominale sono stati acquisiti tramite un'autorità di donazione del corpo, anche attraverso un protocollo approvato dall'IRB.
1. Preparazione del tessuto
Figura 1: Immagini di spessore ideale per l'imaging della pelle di topo e umana. (A) Pelle dell'orecchio del topo tenuta alla luce, che può visibilmente far passare la luce. (B) Pelle umana ideale tenuta alla luce dopo la preparazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
2. Configurazione laser e microscopio
Figura 2: Layout schematico per un percorso di imaging laser Raman coerente. I fasci sono condizionati in modo indipendente per le dimensioni dello spot e abbinati tramite lo stadio di ritardo temporale per generare uno scattering Raman coerente nei campioni per la frequenza di sintonizzazione desiderata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
3. Imaging lipidico
Figura 3: Esempi di profondità cutanee ottenute utilizzando SRS. La serie superiore di immagini proviene dalla pelle dell'orecchio di topo nudo che raffigura quanto segue: (A) strato corneo, (B) ghiandole sebacee, (C) adipociti, (D) grasso sottocutaneo. La serie inferiore di immagini è ottenuta dalla pelle umana che raffigura quanto segue: (E) strato corneo, (F) derma papillare e (G) una ghiandola sebacea. Barre di scala = 100 μm. Sia le immagini del mouse che quelle della pelle umana sono state acquisite utilizzando un obiettivo 20x a 1024 pixel x 1024 pixel; l'SG umano è stato preso a 512 x 512 pixel. Abbreviazioni: SRS = scattering Raman stimolato; SG = ghiandola sebacea. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
4. Applicazione della formulazione topica
5. Configurazione sperimentale per la quantificazione dei farmaci
Figura 4: Movimento tissutale nella pelle dell'orecchio del topo nudo dimostrato visualizzando le ghiandole sebacee. Esempio di movimento limitato dei tessuti è raffigurato in A e B, mentre il movimento sostanziale dei tessuti è raffigurato in C e D. (A) mostra le ghiandole sebacee al momento dell'applicazione della formulazione e (B) la stessa profondità a 120 minuti dopo l'applicazione. (C) ghiandole sebacee di topo al momento dell'applicazione della formulazione e (D) 120 minuti dopo l'applicazione della formulazione; le ghiandole sebacee sono appena visibili, il che è un'indicazione che questo esperimento non stava misurando l'assorbimento nelle ghiandole sebacee per l'intera durata sperimentale. Barre di scala = 100 μm. Le immagini sono 1024 pixel x 1024 pixel. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
6. Analisi dei dati
Figura 5: Intensità rispetto ai profili temporali. (A) Si vede un esempio di profili di flusso che hanno raggiunto la saturazione e quindi solo una diminuzione dell'intensità. Ogni ROI ha un profilo di flusso diverso per dimostrare l'eterogeneità dei dati che si potrebbero acquisire. (B) Un esempio di concentrazioni che aumentano dopo l'inizio dell'imaging. Ogni ROI è un diverso campo visivo (indicato dalle diverse tracce di colore) all'interno dello stesso tessuto dello stesso esperimento. Oltre alle concentrazioni globali, c'è la capacità di chiarire quale ambiente locale un API / formulazione preferisce come indicato dalle regioni ricche di lipidi e povere di lipidi. I profili presentati in A indicano che non vi è alcun assorbimento del farmaco nel tessuto poiché l'API ha già permeato e ha iniziato a lasciare il tessuto una volta iniziata l'imaging. Tuttavia, in B, il tessuto non ha raggiunto la saturazione e c'è ancora assorbimento dell'API seguito dall'eliminazione. La segmentazione delle immagini in ricche di lipidi e povere di lipidi aiuterà a chiarire la localizzazione dell'API (o inattivi) e delle vie di permeazione nella pelle (cioè lo strato corneo). Una concentrazione più elevata all'interno delle regioni ricche di lipidi indica che l'API si localizza all'interno della struttura lipidica dello strato in esame, il che aiuta nelle informazioni mirate sulla somministrazione di farmaci. Abbreviazioni: ROI = regione di interesse; API = principio attivo farmaceutico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'imaging è considerato di successo se il tessuto non si è mosso in modo significativo in direzione assiale (<10 μm) o laterale al completamento dell'esperimento (Figura 4). Questa è un'indicazione immediata se la misurazione SRS per l'API di interesse non è rappresentativa della profondità iniziale, per la quale la quantificazione è specifica del livello. Ciò è mitigato dall'imaging di z-stack per ogni posizione XY di interesse, con il compromesso che è la risoluzione temporale. S...
La valutazione del BA/BE topico è un'area di ricerca che richiede un approccio sfaccettato in quanto nessun singolo metodo può caratterizzare completamente la cPK in vivo . Questo protocollo presenta una metodologia per la valutazione del BA/BE di un prodotto farmaceutico topico basato sull'imaging Raman coerente. Uno dei primi punti che potrebbero essere trascurati è quanto devono essere sottili i campioni di pelle, specialmente per l'imaging SRS a trasmissione quantitativa. Se la pelle è troppo spessa (
CLE è un inventore di brevetti per la microscopia CARS che sono stati concessi in licenza a più produttori di microscopi. Tutti gli altri autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Fotis Iliopoulos e Daniel Greenfield del Gruppo Evans per la loro discussione e correzione di bozze di questo manoscritto. Inoltre, gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno di LEO Pharma. La Figura 2 è stata creata con BioRender.com.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue Preparation | |||
Autoclavable Biohazard Bags | FisherBrand | 22-044562 | As refered to in text: biohazard bags https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562 |
Cell Culture Buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Corning | MT21030CV | As refered to in text: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv |
Disposable Scalpels | Exel International | 14-840-00 | As refered to in text: scalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true |
High Precision 45° Angle Broad Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-132 | As refered to in text: forceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword= |
Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Kimberly-Clark Professional Kimtech Science | 06-666 | As refered to in text: task wiper https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666 |
Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Bemis | 13-374-12 | As refered to in text: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412 |
Petri Dish (35 mm x 10 mm) | Fisherbrand | FB0875711YZ | As refered to in text: small petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true |
Petri Dish (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB0875713A | As refered to in text: large petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true |
Surgical Scissors | Roboz | NC9411473 | As refered to in text: scissors https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC |
Laser/microscope | |||
650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | As refered to in text: CARS filter - CH2 vibrations (645nm/60nm filter) | |
Control box IX2-UCB | Olympus | As refered to in text: Control Box | |
D700/30m | Chroma | As refered to in text: CARS filter - deuterated band https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m | |
DeepSee Insight | Spectra-Physics | As refered to in text: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser | |
Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console | ThorLabs | PM100D | As refered to in text: power meter https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
Fluoview Software | Olympus | As refered to in text: Microscope Control software | |
Frosted Microscope Slides | FisherBrand | As refered to in text: microscope slides https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446 | |
FV1000 | Olympus | As refered to in text: Microscope | |
Incubation Chamber | Tokai Hit | GM-800 | As refered to in text: incubation chamber |
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S142C | As refered to in text: photodiode https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
Power supply FV31-PSU | Olympus | As refered to in text: Power Supply | |
Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator | BK Precision | As refered to in text: function generator | |
ProScan – Precision Microscope Automation | Prior Scientific Instruments | As refered to in text: stage controller https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation | |
SecureSeal Imaging Spacers | Grace Biolabs | 654004 | As refered to in text: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/ |
SRS Detection Kit | APE | As refered to in text: SRS detector | |
UPLSAPO 20X NA:0.75 | Olympus | As refered to in text: 20X Objective https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/ | |
Lipid/Drug Imaging | |||
35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter | MatTek Corporation | NC9711297 | As refered to in text: Glass bottom dish https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297 |
Cotton-tipped applicators | FisherBrand | As refered to in text: Cotton-tipped applicator | |
Distriman Postive Displacement Pipette | Gilson | As refered to in text: Postive Displacement Pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword= | |
Distriman Postive Displacement Pipette Tips | Gilson | As refered to in text: Tips for pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true | |
Data Analysis | |||
FIJI | Open-source | As refered to in text: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ | |
Jupyter-Lab | open-source | As refered to in text: JupyterLab https://jupyter.org/ | |
Rstudio | Open-source | As refered to in text: Rstudio https://www.rstudio.com/ |
Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE
Richiedi AutorizzazioneThis article has been published
Video Coming Soon