Visualizzazione e quantificazione di composti farmaceutici all'interno della pelle utilizzando l'imaging a dispersione Raman coerente

Riepilogo

Viene descritta una metodologia di imaging a dispersione Raman coerente per visualizzare e quantificare i composti farmaceutici all'interno della pelle. Questo documento descrive la preparazione del tessuto cutaneo (umano e murino) e l'applicazione della formulazione topica, l'acquisizione di immagini per quantificare i profili di concentrazione spaziotemporale e l'analisi farmacocinetica preliminare per valutare la somministrazione topica di farmaci.

Abstract

La farmacocinetica cutanea (cPK) dopo l'applicazione di formulazioni topiche è stata un'area di ricerca di particolare interesse per gli scienziati regolatori e di sviluppo di farmaci per comprendere meccanicamente la biodisponibilità topica (BA). Le tecniche semi-invasive, come lo stripping del nastro, la microdialisi cutanea o la microperfusione cutanea a flusso aperto, quantificano tutte la cPK su macroscala. Mentre queste tecniche hanno fornito una vasta conoscenza di cPK, la comunità manca di una comprensione meccanicistica della penetrazione e della permeazione del principio attivo farmaceutico (API) a livello cellulare.

Un approccio non invasivo per affrontare la cPK su microscala è il Raman scattering imaging (CRI) coerente, che si rivolge selettivamente alle vibrazioni molecolari intrinseche senza la necessità di etichette estrinseche o modifiche chimiche. CRI ha due metodi principali - anti-Stokes Raman scattering (CARS) e scattering Raman stimolato (SRS) - che consentono la quantificazione sensibile e selettiva di API o ingredienti inattivi. CARS viene in genere utilizzato per ricavare informazioni strutturali sulla pelle o visualizzare il contrasto chimico. Al contrario, il segnale SRS, che è lineare con la concentrazione molecolare, viene utilizzato per quantificare le API o gli ingredienti inattivi all'interno delle stratificazioni cutanee.

Sebbene il tessuto di topo sia stato comunemente utilizzato per cPK con CRI, il BA topico e la bioequivalenza (BE) devono essere valutati nel tessuto umano prima dell'approvazione normativa. Questo documento presenta una metodologia per preparare e visualizzare la pelle ex vivo da utilizzare in studi CRI di farmacocinetica quantitativa nella valutazione di BA e BE topici. Questa metodologia consente una quantificazione API affidabile e riproducibile all'interno della pelle umana e del mouse nel tempo. Le concentrazioni all'interno dei compartimenti ricchi di lipidi e poveri di lipidi, così come la concentrazione totale di API nel tempo sono quantificate; questi sono utilizzati per stime di MICRO e macroscala BA e, potenzialmente, BE.

Introduzione

Le metodologie per valutare la cPK dopo l'applicazione di un farmaco topico si sono estese dagli studi classici di test di permeazione in vitro (IVPT) ^1,2,3,4,5 e tape-stripping ^6,7,8 a metodologie aggiuntive come la microperfusione a flusso aperto o la microdialisi^{cutanea 9,10,11},

Protocollo

L'uso di tessuto auricolare di topo nudo è stato approvato dal Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), mentre l'uso di tessuto cutaneo umano è stato approvato dal Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (IRB). Secondo i protocolli IACUC, i topi appena eutanasizzati sono stati ottenuti da collaboratori con colonie di topi nudi. Il tessuto umano è stato prelevato da procedure elettive di addominoplastica presso il Massachusetts General Hospital tramite un protocollo approvato. Inoltre, specifici tipi di tessuto diversi dalla pelle addominale sono stati acquisiti tramite un'autorità di donazione del corpo, anc....

Risultati

L'imaging è considerato di successo se il tessuto non si è mosso in modo significativo in direzione assiale (<10 μm) o laterale al completamento dell'esperimento (Figura 4). Questa è un'indicazione immediata se la misurazione SRS per l'API di interesse non è rappresentativa della profondità iniziale, per la quale la quantificazione è specifica del livello. Ciò è mitigato dall'imaging di z-stack per ogni posizione XY di interesse, con il compromesso che è la risoluzione temporale. S.......

Discussione

La valutazione del BA/BE topico è un'area di ricerca che richiede un approccio sfaccettato in quanto nessun singolo metodo può caratterizzare completamente la cPK in vivo . Questo protocollo presenta una metodologia per la valutazione del BA/BE di un prodotto farmaceutico topico basato sull'imaging Raman coerente. Uno dei primi punti che potrebbero essere trascurati è quanto devono essere sottili i campioni di pelle, specialmente per l'imaging SRS a trasmissione quantitativa. Se la pelle è troppo spessa (

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Preparation
Autoclavable Biohazard Bags	FisherBrand	22-044562	As refered to in text: biohazard bags https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562
Cell Culture Buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x	Corning	MT21030CV	As refered to in text: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv
Disposable Scalpels	Exel International	14-840-00	As refered to in text: scalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true
High Precision 45° Angle Broad Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	12-000-132	As refered to in text: forceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword=
Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Kimberly-Clark Professional Kimtech Science	06-666	As refered to in text: task wiper https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666
Parafilm M Laboratory Wrapping Film	Bemis	13-374-12	As refered to in text: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412
Petri Dish (35 mm x 10 mm)	Fisherbrand	FB0875711YZ	As refered to in text: small petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true
Petri Dish (60 mm x 15 mm)	Fisherbrand	FB0875713A	As refered to in text: large petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true
Surgical Scissors	Roboz	NC9411473	As refered to in text: scissors https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC
Laser/microscope
650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter	Semrock		As refered to in text: CARS filter - CH2 vibrations (645nm/60nm filter)
Control box IX2-UCB	Olympus		As refered to in text: Control Box
D700/30m	Chroma		As refered to in text: CARS filter - deuterated band https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m
DeepSee Insight	Spectra-Physics		As refered to in text: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser
Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console	ThorLabs	PM100D	As refered to in text: power meter https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Fluoview Software	Olympus		As refered to in text: Microscope Control software
Frosted Microscope Slides	FisherBrand		As refered to in text: microscope slides https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446
FV1000	Olympus		As refered to in text: Microscope
Incubation Chamber	Tokai Hit	GM-800	As refered to in text: incubation chamber
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor	ThorLabs	S142C	As refered to in text: photodiode https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Power supply FV31-PSU	Olympus		As refered to in text: Power Supply
Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator	BK Precision		As refered to in text: function generator
ProScan – Precision Microscope Automation	Prior Scientific Instruments		As refered to in text: stage controller https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation
SecureSeal Imaging Spacers	Grace Biolabs	654004	As refered to in text: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/
SRS Detection Kit	APE		As refered to in text: SRS detector
UPLSAPO 20X NA:0.75	Olympus		As refered to in text: 20X Objective https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/
Lipid/Drug Imaging
35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter	MatTek Corporation	NC9711297	As refered to in text: Glass bottom dish https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297
Cotton-tipped applicators	FisherBrand		As refered to in text: Cotton-tipped applicator
Distriman Postive Displacement Pipette	Gilson		As refered to in text: Postive Displacement Pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword=
Distriman Postive Displacement Pipette Tips	Gilson		As refered to in text: Tips for pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true
Data Analysis
FIJI	Open-source		As refered to in text: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/
Jupyter-Lab	open-source		As refered to in text: JupyterLab https://jupyter.org/
Rstudio	Open-source		As refered to in text: Rstudio https://www.rstudio.com/