マウス後肢壊疽モデルにおける足蹠血管系の高解像度3次元イメージング

要約

本プロトコールは、FVBマウスにおいて後肢壊疽を誘導するための一酸化窒素合成酵素阻害剤の投与と大腿動脈動脈および静脈電気凝固を組み合わせた末梢動脈疾患のユニークで臨床的に関連するモデルを記載する。心臓内DiI灌流は、その後、足蹠血管系の高解像度、3次元イメージングに使用されます。

要約

末梢動脈疾患(PAD)は、アテローム性動脈硬化性危険因子への慢性曝露に起因する罹患率の重要な原因である。その最も重篤な形態、慢性四肢を脅かす虚血(CLTI)に罹患している患者は、慢性疼痛、痛みのない限られた歩行距離、および治癒しない創傷を含む日常生活に対する実質的な障害に直面する。PADを研究するために様々な動物において前臨床モデルが開発されてきたが、マウス後肢虚血は依然として最も広く使用されている。これらのモデルにおける虚血性侮辱に対する応答には、使用されるマウス系統、ならびに動脈破壊の部位、数、および手段に応じて有意な変動があり得る。このプロトコルは、CLTIの組織喪失に似たフレンドウイルスB(FVB)マウスにおいて足蹠壊疽を確実に誘導するために、大腿動脈および静脈電気凝固を一酸化窒素合成酵素(NOS)阻害剤の投与と組み合わせるユニークな方法を記載している。レーザードップラー灌流イメージング(LDPI)などの再灌流を評価する従来の手段が依然として推奨されているが、親油性色素1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩(DiI)の心臓内灌流は、血管系を標識するために使用される。その後のホールマウント共焦点レーザー走査顕微鏡は、後肢虚血モデルにおける再灌流を評価する従来の手段を補完する足蹠血管網の高解像度、3次元(3D)再構成を可能にする。

概要

末梢動脈疾患(PAD)は、アテローム性動脈硬化症による四肢への血流の減少を特徴とし、米国では650万人、世界では2億人が罹患しています¹。PAD患者は四肢機能と生活の質の低下を経験し、最も重篤な形態のPADであるCLTI患者は切断および死亡のリスクが高く、5年間の死亡率は50%に近づいています²。臨床現場では、足首上腕指数(ABI)<0.9の患者はPADを有すると考えられ、ABI<0.4の患者は^CLTI3を有するとして安静痛または組織喪失のいずれかに関連する。症状は、毎日の活動、虚血に対する筋肉の耐性、解剖学的変異、および側副発達の違いに応じて、同様のABIを有する患者間で変化する⁴。数字および四肢壊疽は、CLTIをもたらすすべての血管閉塞性疾患の中で最も重篤な症状である。それは軟部組織をミイラ化する乾燥壊死の一形態である。アテローム性動脈硬化性PADに加えて、糖尿病、バージャー病やレイノー現象などの血管炎、または末期腎疾患の設定におけるカルシフィラキシーの患者でも観察することができます^5,6。

PAD/CLTIの病因を研究し、潜在的な治療法の有効性をテストするために、いくつかの前臨床モデルが開発されており、最も一般的なものはマウス後肢虚血のままである。マウスにおける後肢虚血の誘導は、典型的には、縫合結紮、電気凝固、または所望の血管を狭窄させる他の手段のいずれかによって、腸骨動脈または大腿動脈からの血流の閉塞によって達成される⁷。これらの技術は、後肢への灌流を劇的に減少させ、大腿部およびふくらはぎの筋肉における新生血管新生を刺激する。しかし、虚血性侮辱に対する感受性には、副次的分布の解剖学的差異に部分的に起因して、マウス系統依存的な本質的な違いがある^8,9。例えば、C57BL/6マウスは後肢虚血に対して比較的耐性があり、四肢機能の低下を実証するが、一般に足蹠に壊疽の証拠はない。一方、BALB/cマウスは虚血からの回復能力が本質的に乏しく、典型的には大腿動脈結紮のみの後に足または下肢の自己切断を発症する。虚血に対するこの重篤な反応は、治療窓を狭め、四肢の再灌流および機能の縦断的評価を妨げる可能性がある。興味深いことに、マウス第7染色体に位置する単一の量的形質遺伝子座における遺伝的差異は、C57BL/6およびBALB/cマウスの組織壊死および四肢再灌流に対するこれらの異なる感受性に関与している¹⁰。

C57BL/6およびBALB/c株と比較して、FVBマウスは、大腿動脈結紮のみに対して中間的ではあるが一貫性のない応答を示す。いくつかの動物は、黒い虚血性爪またはミイラ化した数字の形で足蹠壊疽を発症するが、虚血の明白な徴候がない動物もいる¹¹。一酸化窒素合成酵素(NOS)阻害剤である_Nω-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル塩酸塩(L-NAME)の同時投与¹²は、代償性血管拡張機構を予防し、後肢組織における酸化ストレスをさらに増加させる。大腿動脈結紮または凝固と組み合わせて、このアプローチは、CLTIの萎縮性変化に類似しているが、四肢の自己切断にはほとんど進行しないFVBマウスにおいて、一貫して足蹠組織喪失を生じる¹¹。酸化ストレスはPAD/CLTIの特徴の1つであり、内皮機能障害および一酸化窒素(NO)の生物学的利用能の低下によって伝播される^13,14。NOは多能性分子であり、通常、動脈および毛細血管血流、血小板接着および凝集、ならびに白血球の動員および活性化に有益な効果を発揮する¹³。NOSのレベルの低下はまた、酸化ストレスを誘発し、アテローム性動脈硬化症の進行を促進するアンジオテンシン変換酵素を活性化することが示されている¹⁵。

後肢虚血のモデルが確立されると、その後の四肢再灌流および潜在的な治療の治療効果のモニタリングも必要である。提案されたマウス壊疽モデルにおいて、組織喪失の程度は、まず、フェーバースコアを用いて定量化して、足の総外観を評価することができる(0:正常、1〜5:スコアが罹患した爪の数を表す爪の損失、6〜10:スコアが罹患した桁数を表す桁の萎縮、11〜12:部分的および完全な足の萎縮、 それぞれ)⁹.その後、後肢灌流の定量的測定は、典型的にはLDPIを用いて行われ、LDPIは、関心領域(ROI)におけるピクセルレベルの灌流を示すために、レーザー光と赤血球との間のドップラー相互作用に依存する¹⁶。この技術は定量的で非侵襲的であり、反復測定には理想的ですが、後肢血管系の粒状の解剖学的詳細を提供するものではありません¹⁶。マイクロコンピュータ断層撮影法(マイクロCT)、磁気共鳴血管造影法(MRA)、X線微小血管造影などの他のイメージングモダリティは、コストがかかるか、高度な機器を必要とするか、そうでなければ技術的に困難であることが証明されています¹⁶。2008年、Liらは、親油性カルボシアニン色素^DiI17で網膜内の血管を標識する技術を説明した。DiIは内皮細胞に組み込まれ、直接拡散によって、血管新生スプラウトや偽蹄形プロセスなどの血管膜構造を染色する^17,18。内皮細胞への直接送達および色素の蛍光性が高いため、この手順は血管の強烈で長期的な標識を提供する。2012年、BodenらはDiI灌流の手法を、大腿動脈結紮後に採取された大腿内転筋の全マウントイメージングを介してマウス後肢虚血モデルに適応させた¹⁹。

現在の方法は、後肢虚血および遺伝子または細胞ベースの治療に応答した新生血管形成を評価するための比較的安価で技術的に実現可能な方法を提供する。さらなる適応において、このプロトコルは、足蹠血管系を高解像度で画像化し、後肢壊疽のマウスモデルにおいて3Dで画像化するためのDiI灌流の適用を記載する。

プロトコル

プロトコールに記載されているすべての動物実験は、マイアミ大学施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。生後8〜12週の雄および雌の両方のFVBマウスを研究に使用した。

1. L-NAME溶液の調製

1. 層流フード内の滅菌条件下で、L-NAME粉末1g( 原料表参照)を20mLの滅菌水に溶解してL-NAME原液を調製し、50mg/mLの溶液を作る。ストック溶液を300~500μLのアリコートに入れ、-20°Cで最大3ヶ月間保存します。
2. 有効なL-NAME溶液を作るには、L-NAMEストック溶液のアリコートを解凍し、滅菌条件下でPBS(1:4)で希釈して、最終10mg/mL濃度を得る。
3. PBS(pH7.4)を調製するために、8gのNaCl、0.2gのKCl、1.44gのNa2HPO4、および0.23gの_NaH2PO4を800mLの蒸留水に溶解する。HClでpHを7.4に調整し、全量1,000mLに水を加え、0.22μmのボトルトップフィルターでろ過します。
   注:4 μL/gのL-NAME作動溶液の腹腔内(IP)注射は、L-NAMEの所望の40mg / kg用量と同等である。L-NAME作業溶液は、使用中に氷上に保持する必要があります, そして、新しい希釈は、ストック溶液の新しく解凍されたアリコートを使用して毎日行う必要があります.

2.後肢壊疽の化学的および外科的誘導

1. 8〜12週間齢のFVBマウスを、ブリーダーまたは施設内で飼育して入手する( 材料表を参照)。手術の2時間前に、L-NAMEの40mg / kg IP用量を投与する。
2. PBSで希釈した100mg / kgのケタミンおよび10mg / kgのキシラジン( 材料表を参照)のIP注射でマウスを麻酔する。つま先ピンチ反射がないことによって適切な鎮静を確認し、処置中に呼吸数を監視し続ける。
   1. はさみおよび/または脱毛クリームを使用して両側後肢および鼠径部から脱毛を除去する。動物を外科用顕微鏡仰臥位の下に置く。四肢を伸ばして所定の位置にテープで固定します。ポビドンヨード溶液を手術部位に円周状に塗布して手術野を滅菌する。
3. 10〜20倍の倍率で、はさみまたはメスを使用して、鼠径部のしわに沿って鼠径部の靭帯よりちょうど劣る1cmの切開を行う。細かい鉗子と滅菌綿チップアプリケーターを使用して、鼠径部靭帯から鼠径部脂肪パッドを横方向に鈍く解剖し、大腿動脈、静脈、神経が明確に識別されるように、その下にある大腿骨鞘を露出させます(図1)。
4. 細かい鉗子を使用して、大腿骨鞘を突き刺す。大腿神経を大腿動脈から慎重に磨いてください。大腿動脈(LCFA)の外側回旋枝の大腿神経の深い部分の離陸を特定する(図1)。
   1. 焼灼装置( 材料表を参照)を作動させ、左右の動きで血管を穏やかに接触させることによって、LCFAのすぐ近位の大腿動脈および静脈の電気凝固を進め、大腿神経が十分に隔離され、熱傷害から保護されたままであることを確認する。凝固した血管セグメントをはさみで分割する。
5. 鼠径部脂肪パッドを内側に動員することによって遠位大腿動脈および静脈の露出を進める。表在性上腹部動脈およびサフェノ膝窩接合部をより遠位的に同定する。
   1. これら2つの場所の間に大腿骨鞘を突き刺し、大腿神経を大腿骨血管から慎重に解剖する。ステップ2.4.1で説明したように、大腿動脈および静脈の凝固および切除を進める。
6. 滅菌PBSで満たされたシリンジを用いて手術野を灌漑する。出血の任意の領域に綿の先端アプリケーターで3〜5分間穏やかな圧力をかけることによって止血を得る。
   1. 吸収性5-0縫合糸を使用して切開部の閉鎖を簡単な連続的な方法で進める。術後の疼痛緩和のために、徐放性ブプレノルフィン( 材料表を参照)の皮下用量を1mg/kg投与する。
7. LDPIにより結紮後肢の足蹠灌流の喪失を確認する( 材料表参照)。麻酔をかけたまま、LDPIマシンの下の臆病な位置にある暗い泡パッドに動物を置き、電気テープのループを使用して足を所定の位置に固定します。
   1. 両足のLDPIで進めます。スキャンが完了したら、各フットパッドの周りにROIを描画し、平均フラックス値を取得します。
   2. 灌流指数を、連結された足蹠から非連結された足蹠までの平均流束値の比として計算する。灌流指数が0.1未満であることを確認してください。
8. 動物を加熱パッドまたはオーバーヘッドランプを備えた清潔なケージに戻し、深部体温を維持します。マウスを動物施設に戻す前に、麻酔から完全に回復することを確認してください。

3. L-NAMEの術後投与および後肢壊疽のモニタリング

1. 術後1〜3日目に、各動物にL-NAMEの追加の40mg / kg IP用量を投与する。同時に、虚血性四肢から足を慎重に評価する。
2. Faber 後肢虚血スコア⁹を用いて後肢虚血および壊疽の程度を定量化する。スコア1〜5:虚血性爪の数;スコア6〜10:1〜5虚血桁;スコア11および12:部分的および完全な足の萎縮。術後1-3日目にフェイバースコアを記録し、その後毎週記録します。

4. 動物灌流のためのDiIおよび作業溶液の調製

1. DiIストック溶液を調製するために、100mgのDiI結晶( 材料表を参照)を16.7mLの100%エタノールに溶解する。アルミホイルで覆い、室温で暗闇の中で一晩ロッキングプラットフォームに放置する。
2. 希釈液を調製するために、50gのグルコースを1,000mLの蒸留水に溶解し、5%グルコース溶液を得た。0.22 μmのボトルトップフィルターでろ過します。PBSおよび5%グルコース溶液を1:4の比率で混合し、作動希釈液を調製する。

5. 機器のセットアップとDiI灌流

1. 使用直前に10mLの作業希釈液(工程4.2で調製)に200μLのDiIストック溶液を加えてDiI作業溶液を作る。よく混ぜるために手で振る。
2. 2つまたは3つの3ウェイ活栓と25Gのバタフライニードルを直列に接続します。4 mL の PBS、10 mL の DiI 溶液、および 10 mL の 10% 中性緩衝ホルマリンを含む 10 mL のシリンジを準備します ( 材料表を参照)。
3. ホルマリンを含むシリンジを近位流入口に接続し、溶液を注入してラインから空気を流す。活栓を回してポートを閉じます。同じ手順を順番に繰り返し、DiI、次にPBSでシリンジをそれぞれ中央および遠位の流入ポートに接続し、活栓アセンブリを介してすべての気泡を洗い流すように注意します。
   メモ: 活栓アセンブリまたはチューブのどの部分にも気泡がないことを確認します。気泡は、灌流中に小さな動脈を閉塞し、血管内DiI分布が悪く、画像化結果を損なう可能性があります。
4. セットアップが完了したら、誘導チャンバーで_CO2 の過剰摂取によって動物を安楽死させます。
5. 灌流する動物を吸収パッドの上に仰臥位に置き、腋窩と下肢を針で固定します。
6. はさみを使用して、腹腔を開くために横切開を行う。左右の横隔膜を露出させて分割し、胸腔にアクセスします。
   1. 胸骨の両側の胸壁を下肋骨から第1または第2の肋骨に切断し、内側の胸部(乳房)動脈を避けます。胸骨の下端をつかみ、それを動物の頭に向かって反射させて胸腔を露出させるために、止血剤( 材料表を参照)を使用してください。
7. 右心室よりも色が明るく見える左心室を特定します。鈍い鉗子で心臓を優しくつかみ、蝶の針を左心室に挿入します。
   1. はさみまたは18G針を使用して右心房を穿刺し、血液と灌流溶液を心臓に戻して排出できるようにします。誤って右心室を穿刺し、全身循環ではなく肺を灌流しないように注意しながら、片手または両手で針を安定させる。
8. PBSでシリンジへのポートを開き、血管系から血液を洗い流すために、2〜4mLを1〜2mL/minの速度で1〜2分間手動で注入する。右心房からの出血を観察することによって、正常な灌流を確実にする。注射後、PBSシリンジのポートを閉じます。
9. DiIでシリンジへのポートを開き、5〜10mLを1〜2mL/minの速度で5分間注入する。DiI溶液の注射でわずかにピンク色に変わるはずの耳、鼻、および手のひらを監視します。注射後、DiIシリンジのポートを閉じ、固定液の注入前に染料の混入を可能にするために2分間待つ。
10. ホルマリンでシリンジへのポートを開き、5〜10mLを1〜2mL/minの速度で5分間注入する。注射後、左心室から針を外し、目的の組織を採取する。
11. 重いはさみを使用して、足首の脛骨を脱臼させ、左右の足を下肢から完全に分離します。採取した足を、10%ホルマリン溶液の1〜2mLを含む6ウェルまたは12ウェルプレートに入れる。プレートをホイルで包み、4°Cで一晩保存する。

6. 共焦点レーザー走査顕微鏡用の足蹠組織の作製

1. 翌日、6ウェルまたは12ウェルプレートの固定液を1ウェルあたり1〜2mLのPBSと交換する。
2. 足の皮をむくには、まず、足の足底と背の側面にメスで縦切開を行います。次に、歯付き鉗子と小さな止血剤を使用して、足と数字からすべての皮膚を慎重に取り除き、基礎となる軟部組織を傷つけないようにします。
3. 組織の装着および画像化に進み、好ましくは灌流および収穫の1〜2日以内に行う。あるいは、フットパッドを1〜2mLのPBSを含む6ウェルまたは12ウェルプレートに戻す。ホイルで覆い、4°Cで保存して蛍光を最大1ヶ月間維持します。
4. 組織を取り付けるには、2つのガラス顕微鏡スライドの間に足を個別に置き、発泡生検パッドを折りたたんで(組織の厚さに応じて1回または2回)、両端に折りたたみます( 材料表を参照)。2 つの小さなバインダー クリップを使用して、スライドガラスを両端で一緒に圧縮します (最終的な厚さは約 1 mm)。
   メモ:組織が厚いほど、スキャン時間が長くなります。スキン付きフットパッドは、イメージングの1日前にスライドガラス間で圧縮して、組織の厚さを減らすことができます。

7. 共焦点レーザー走査顕微鏡

1. イメージングセッションの準備:イメージングシステムの電源を入れ、集録ソフトウェアを起動します( 材料表を参照)。低倍率/低開口率対物レンズ(例:x5/0.15)を使用して画像をキャプチャし、低倍率レンズは通常、この実験に必要な作動距離が長くなります。
2. 「 はい 」をクリックして、「ステージのアクティブ化」ダイアログ・ボックスを表示します。[構成]タブで561 nmレーザーをアクティブにします。メイン画面で、[可視]ボタンをクリックして、 可視 ビームパスをアクティブにします。検出器を570~600nmの範囲に設定するには、対応する アクティブ チェックボックスをクリックします。
3. [>の取得]タブで[タイルスキャン]アイコンを選択し、目的の解像度(512 x 512または1024 x 1024)を設定します。
4. 乾燥マウント(水またはPBS添加なし)した組織サンプルを顕微鏡ステージ上のスライドガラス間で圧縮した位置に置き、組織に焦点を合わせます。
5. スキャン境界を設定するには、サンプルの左上隅または右上隅に移動します。[取得]タブの[タイルスキャン]メニューの下にある[ 位置のマーク] ボタンをクリックします。反対側のコーナー(それぞれ右下または左下)に移動し、[ 位置をマーク ]ボタンをもう一度クリックします。
6. Z スタックの深さを設定するには、画面の左下隅にある [ ライブ ] ボタンをクリックし、サンプルの中央に移動します。Z 軸ノブを使用して、サンプルの一番下までスクロールします。
7. [取得]タブの[Zスタック]メニューの下にある [開始] ボタンをクリックします。サンプルの一番上までスクロールし、[ 終了 ] ボタンをクリックします。 Zステップサイズ をクリックし、所望の値(例えば、50μm)に設定する。
8. 画面の右下隅にある[ 開始 ]をクリックして画像取得を開始します。

8. 足蹠血管の定量解析と3D再構築

1. フィジーの最新バージョン(ImageJ)と船舶分析プラグイン²⁰をダウンロードしてインストールします。フィジーで顕微鏡画像ファイルを開き、個々のZシリーズをZスタックに結合し、画像の下部にあるスライダーを使用してz軸で表示できるようにします。
2. 複合 Z スタックイメージを選択し、[イメージ] メニュー の [スタック] > [Z プロジェクト] を選択して 2 次元投影を作成します。次に、「 プロセス>バイナリ」で「バイナリを作成」で Z 投影>バイナリに変換します。
3. [血管密度のプラグイン ]で[血管密度>プラグイン]を実行します。プロンプトが表示されたら、カーソルを使用して、フットパッドと数字の周囲を ROI でトレースします。ROI(血管面積分率)の百分率として表される報告される血管密度に留意する。
4. フィジーで 3D 再構成を作成するには、[3D プロジェクト>スタック] を選択し、[イメージ] メニューで目的の回転軸、角度、速度を設定します。または、[プラグイン]メニューの[ボリュームビューア]を選択して、画像をスライスとして視覚化したり、目的の軸で再構築を操作したりできます。
5. より複雑な3Dレンダリングを行うには、別の画像解析および処理ソフトウェアを使用してください( 材料表を参照)。ファイルを目的のソフトウェアの形式に変換し、タイルステッチング機能を使用して個々のタイルスキャンをステッチします。
6. 個々のタイル スキャンをつなぎ合わせた後、コンポジット ファイルを開き、ボリューム サーフェスのレンダリングを続行します。[ 新しいサーフェスの追加] をクリックしてサーフェス作成ウィザードを開き、矢印を使用してメニューを切り替えます (特に ROI としきい値の強度を設定します)。サーフェスレンダリングに満足したら、アニメーション機能を利用して、処理された画像のビデオを作成します。

結果

このプロトコールは、感受性FVBマウスにおいて、一酸化窒素合成酵素阻害剤であるL−NAME投与による大腿動脈および静脈凝固の組み合わせを用いて、マウス足蹠における虚血および組織喪失を誘導する信頼できる手段を詳述する。 図1 は、マウス後肢血管系の解剖学的構造を詳述し、大腿動脈および静脈凝固の部位(黄色X)、側回旋大腿動脈(LCFA)のちょうど近位およびサ?...

ディスカッション

マウス後肢虚血は、PADおよびCLTIにおける新生血管新生を研究するために最も広く使用されている前臨床モデルであるが、虚血の重症度および回復には、使用される特定のマウス系統および動脈破壊の部位、数、および方法に応じて有意な変動がある。L-NAMEの大腿動脈結紮とIP投与の組み合わせは、FVBマウスにおいて後肢壊疽を確実に誘導することができる¹¹。同じ治療は、C5...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binder clips (small)	Office supply store
Buprenorphine (sustained-release)
Butterfly needle (25 G with Luer-Lok)	VWR	10148-584
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP5
DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)	Invitrogen	D282
Electrocautery device	Gemini Cautery System	5917
Ethanol (100%)	VWR	89370-084
Fiji (ImageJ) software	NIH		Used version 2.1.0. Free download, no license required.
Foam biopsy pads	Fisher Scientific	22-038-221
Formalin (neutral buffered, 10%)	VWR	89370-094
FVB mice	Jackson Laboratory	001800
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Used version 2.1.0.
HCl (1 M)	Sigma-Aldrich	13-1700
Imaris software	Oxford Instruments		Used version 9.6.0.
Isoflurane	Pivetal	NDC 46066-755-04
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Ketamine
L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride)	Sigma-Aldrich	N5751
Laser Doppler perfusion imager	MoorLDI	moorLDI2-HIR	Used moorLDI V5 software.
Microscope slides (25 x 75 x 1 mm)	VWR	48311-703
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282
NaOH	Sigma-Aldrich	S8263
Needles (27 G)	BD	305109
Povidone-iodine swabstick (10%)	Medline	MDS093901ZZ
Surgical instruments	Roboz Surgical		Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended.
Suture (5-0 absorbable)	DemeTECH	G275017B0P
Syringes (10 mL)	BD	305482
Three-way stopcocks	Cole-Parmer	19406-49
Vascular Analysis Plugin			Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015).
Xylazine