Un modelo de cultivo de órganos corneales humanos de la extracción de Descemet solo con curación acelerada estimulada por el factor de crecimiento de fibroblastos diseñado 1

Resumen

Stripping Only de Descemet es un procedimiento experimental en el que a los pacientes con guttas corneales centrales resultantes de la distrofia corneal endotelial de Fuchs se les extirpa la membrana de Descemet para que las células periféricas regeneren la capa endotelial. Presentamos una novedosa metodología simulando DSO en córneas humanas distróficas ex vivo con curación acelerada estimulada por eFGF1 (NM141).

Resumen

La distrofia corneal endotelial de Fuchs (FECD) es el resultado de células endoteliales corneales disfuncionales (CEC) y actualmente se trata mediante trasplante de toda la córnea o membrana de Descemet. Los desarrollos recientes en cirugía ocular han establecido el Stripping Only (DSO) de Descemet, una técnica quirúrgica en la que se elimina un círculo central de la membrana de Descemet densa en guttas para permitir la migración de CEC al estroma liso, restaurando la función y la visión de la córnea. Si bien esta opción de tratamiento potencial es de gran interés en el campo de la investigación oftálmica, no se han establecido modelos ex vivo exitosos de DSO y los datos clínicos son limitados. Este trabajo presenta un nuevo modelo de cicatrización de heridas que simula DSO en córneas de donantes humanos. Utilizando este enfoque para evaluar la eficacia del FGF1 diseñado en humanos (NM141), encontramos que el tratamiento aceleró la curación a través de la estimulación de la migración y la proliferación de CEC. Este hallazgo se confirmó en 11 pares de córneas humanas con signos de distrofia reportados por los bancos de ojos con el fin de verificar que estos resultados puedan ser replicados en pacientes con Distrofia de Fuchs, como población objetivo del procedimiento DSO.

Introducción

La distrofia corneal endotelial de Fuchs (FECD) es una enfermedad caracterizada por la pérdida de la función de bombeo en las células endoteliales corneales (CEC) y la acumulación excesiva de colágeno y otras proteínas de la matriz extracelular en la superficie de la membrana de Descemet, formando guttas corneales¹. El único tratamiento conocido para la FECD es la queratoplastia endotelial en formas variables, todas las cuales conllevan riesgo de rechazo y pérdida de células endoteliales². Si bien los avances en la cirugía oftálmica han permitido que estos procedimientos se vuelvan menos invasivos con el tiempo, cualquier forma de trasplante conlleva el riesgo de rechazo y la posibilidad de uso de esteroides de por vida, un tratamiento con sus propios eventos adversos concomitantes. Además, la escasez mundial de tejido de donantes es tal que solo hay una córnea donante disponible por cada 70 pacientes necesitados³. Dados estos desafíos, los investigadores y los médicos están explorando métodos quirúrgicos que evitan la necesidad de tejido de donante por completo. Una de estas técnicas experimentales es stripping only (DSO) o Descemetorhexis sin queratoplastia endotelial (DWEK), en la que los pacientes con FECD con guttas localizadas en el centro de la córnea tienen un círculo central de 4 mm de la membrana de Descemet sin colocación de injerto. La eliminación de las guttas estimula a las células periféricas sanas a migrar hacia adentro y reformar la monocapa endotelial, eventualmente revirtiendo el edema estromal y mejorando la visión. El concepto se describió originalmente en una serie de estudios de caso en los que los pacientes se sometieron a una cirugía que se complicó por el desprendimiento de la membrana de Descemet, pero la repoblación de ceC aún ocurrió 4,5,6,7. Aunque hay muchas ventajas en este método, el proceso de curación es largo e inconsistente, ya que algunos pacientes requieren un trasplante de rescate si no se observa curación en los meses posteriores a la cirugía⁸. Por estas razones, un fármaco que estimula una migración más rápida y la proliferación de CEC puede ser beneficioso en el proceso de recuperación de los pacientes con FECD que se han sometido a DSO.

Varios estudios recientes han evaluado los inhibidores de ROCK como un tratamiento suplementario para los pacientes sometidos a DSO, y encontraron que los pacientes tratados se recuperaron más rápido y tenían densidades de células endoteliales centrales (ECD) más altas que aquellos en el grupo de DSO solo ^9,10,11. Sin embargo, debido a los pequeños tamaños de la muestra y las diferencias entre los regímenes de dosificación, se necesitan más datos para comprender mejor la eficacia de los inhibidores de ROCK en este contexto.

También se ha demostrado que los factores de crecimiento de fibroblastos estimulan la regeneración del endotelio corneal tanto in vitro con CEC bovinos como in vivo en córneas^{felinas 12,13}. eFGF1 (NM141) es una versión modificada de FGF-1 que contiene varias sustituciones de aminoácidos para estabilizar la molécula, a diferencia del FGF-1 nativo, que tiene una vida media mucho más corta^14,15. Anteriormente hemos demostrado la capacidad de eFGF1 (NM141) para estimular la proliferación de CECs ex vivo en córneas humanas descuartizadas¹⁶. Este estudio buscó mejorar ese trabajo mediante el establecimiento del primer modelo ex vivo exitoso de DSO en córneas normales y distróficas para determinar si los tratamientos complementarios como eFGF1 (NM141) aceleran la curación en esta aplicación.

Protocolo

Este trabajo utilizó especímenes existentes sin identificación de sujetos y está exento de la aprobación del IRB bajo 45 CFR 46.101 (b) (4).

Las córneas de donantes humanos se obtuvieron de varios bancos de ojos en los Estados Unidos (ver Tabla de Materiales). Las córneas fueron juzgadas individualmente distróficas por los bancos de ojos en función de hallazgos como guttas, pleomorfismo, polimegatismo y / o ECD bajo en la evaluación especular. La Figura 1 presenta la tinción de Trypan Blue en la córnea durante la creación de la herida, inmediatamente después de la extracción y después de 2 semanas en cultivo.

Figura 1: Diagrama que representa la córnea durante la creación de la herida, inmediatamente después de la extracción y después de 14 días en cultivo según lo visualizado por Trypan Blue. La reducción en el área teñida entre estos puntos de tiempo se midió para determinar el nivel de curación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Creación de heridas

1. Usando fórceps estériles, retire la córnea de los medios y enjuague en 1x PBS para eliminar los medios residuales y los desechos celulares. Después de enjuagar, coloque el lado endotelial de la córnea hacia arriba en la tapa de una placa de Petri.
2. Pipete 30 μL de Trypan Blue en un plato de moy. Sumerja una nueva punción de biopsia de 4 mm en Trypan Blue y elimine cualquier exceso.
3. Con ambas manos, coloque el punzón sobre el centro de la córnea y bájelo directamente sobre la superficie endotelial, aplicando una presión mínima.
4. Sin cambiar la posición o la presión sobre la córnea, cambie el punzón a una mano y alcance las pinzas con la mano recién liberada. Use los fórceps para mantener la córnea en su lugar mientras gira suavemente el punzón de biopsia aproximadamente 90 ° hacia adelante y hacia atrás varias veces.
5. Levante el punzón directamente desde la córnea y déjelo a un lado.
6. Enjuague una vez más en 1x PBS para eliminar el exceso de Trypan Blue.

2. El despojamiento de Descemet

1. Transfiera la córnea de una tapa de placa de Petri a un endoscopio de disección.
   NOTA: No deje la córnea seca por más de 5 min. Si se necesita más tiempo para completar el proceso, enjuague nuevamente en 1x PBS para rehidratar el endotelio.
2. Sosteniendo la córnea en su lugar con fórceps curvas, puntúe la membrana de Descemet arrastrando ligeramente la punta de una aguja afilada de 30 G a lo largo del anillo de Trypan Blue dejado por el punzón de biopsia. Use una presión mínima para evitar interrumpir el estroma subyacente.
3. Con un gancho Sinskey, use movimientos suaves de recolección para levantar y pelar la membrana de Descemet alrededor del borde de la herida, trabajando hacia el centro de la lesión.
   NOTA: La membrana de Descemet debe presentar muy poca resistencia. Si se experimenta dificultad, es probable que uno esté levantando el estroma. Si esto sucede, comience de nuevo, levantando desde un nuevo punto a lo largo del borde de la herida.
4. Una vez que la mayoría de la membrana de Descemet se haya separado del estroma, use pinzas Gorovoy para eliminar la membrana y reservarla.
5. Examine el área despojada en busca de piezas restantes de membrana y retírelas con fórceps Gorovoy.

3. Tinción de trypan blue

NOTA: Después de la extracción de Descemet, manche la córnea con Trypan Blue para visualizar el área de la herida.

1. Devuelva la córnea en una tapa de placa de Petri al gabinete de bioseguridad y enjuague en 1x PBS que contenga 0.01% (p/ v) CaCl₂ y MgCl₂ para eliminar los desechos celulares y facilitar la adherencia estricta de los CEC restantes a la membrana intacta de Descemet.
2. Coloque la córnea en un plato de pocillo y pipetee 30 μL de Trypan Blue sobre la capa endotelial durante 30 s.
   1. Use fórceps para mecer suavemente la córnea para asegurarse de que toda la superficie endotelial esté cubierta.
3. Enjuague el exceso de Trypan Blue en 1x PBS con 0.01% (p/v) CaCl₂ y MgCl₂ e imagine la córnea teñida bajo un microscopio de disección para el punto de tiempo del Día 0.
   1. Asegúrese de que la córnea esté equilibrada de tal manera que la luz se transmita uniformemente a través de todo y que el posicionamiento sea replicable a través de los puntos de tiempo.
      NOTA: Las pinzas se pueden usar para mantener la córnea en su lugar mientras se toman imágenes si es necesario.

4. Periodo cultural

1. Cultivar córneas en una placa de seis pocillos que contiene medios de bajo sero que consisten en OptiMEM; 1x insulina, transferrina y selenio; 1x antibiótico/antimicótico; 0,02 mg/ml de CaCl₂; 0,2 mg/ml de ácido ascórbico; y suero fetal bovino inactivado al 0,8% por calor. Cultive la córnea izquierda en 8 ml de medios séricos bajos solos, y la córnea derecha en 8 ml de medios séricos bajos suplementados con 100 ng/ ml de eFGF1 (NM141).
   1. Incubar a 37 °C con 6% de CO₂ durante 14 días con cambios diarios en los medios.
2. Repita el procedimiento de tinción de Trypan Blue en los días 3, 6, 9, 12 y 14, y tome una imagen de cada córnea inmediatamente después de la tinción. Asegúrese de mantener la configuración de la cámara consistente en todos los puntos de tiempo.
3. En el día 12, agregue 10 μM de EdU a los medios de control y suplementados con eFGF1 (NM141) e incube durante 48 h para etiquetar las células en proliferación. Renovar los medios con EdU agregado nuevamente el día 13.
4. El día 14, 48 h después de la adición de EdU, Trypan tiñe e imagen de córneas como de costumbre, excepto en lugar de 1x PBS con CaCl₂ y MgCl₂, use 1x PBS simple para enjuagues para evitar que el calcio interactúe con la mancha de Alizarin Red.

5. Manchas de Alizarin Red

1. El día 14, preparar Alizarin Red al 5% en solución salina al 0,9%.
   NOTA: Alizarin Red no se disuelve completamente en solución salina. Al combinar, solución de vórtice y roca durante al menos 1 h. Vórtice una vez más y filtre antes de usarlo para eliminar las partículas no disueltas.
2. Una vez que se hayan completado la tinción y las imágenes de Trypan, transfiera las córneas a un plato de pocillos y agregue 200 μL de Alizarin Red a la superficie endotelial de cada córnea.
   1. Manche durante 2 min, luego enjuague cada córnea en una placa de Petri de 1x PBS para eliminar el exceso de Alizarin Red antes de colocar en una placa de seis pocillos prellenada con 8 mL de 1x PBS durante dos lavados de 5 min.
3. Después del segundo lavado, tome imágenes del área despojada de cada córnea bajo un microscopio de disección.
   NOTA: A diferencia de las imágenes de Tripano, las córneas se pueden dejar en 1x PBS para obtener imágenes de la tinción de Alizarin para evitar que se sequen durante el proceso.

6. Fijación y permeabilización

1. Una vez que se hayan capturado las imágenes de Alizarin, transfiera las córneas a una placa de 12 pocillos y lave en 4 ml de 1x PBS que contenga 0.05% Tween-20 (PBS-T) durante 30 minutos para eliminar cualquier partícula del tejido antes de la fijación.
2. Fijar córneas en 4 mL de PFA al 4% durante 30 min a temperatura ambiente.
3. Permeabilizar las células durante 5 min en 4 mL de 1x PBS que contiene 1% Triton X-100, luego lavar tres veces en 4 mL de 1x PBS simple durante 30 min cada una.

7. Inmunohistoquímica

1. Bloquee las córneas durante 1 h a 37 °C en 4 ml de 1x PBS que contenga albúmina sérica bovina al 2% y suero caprino al 2%.
2. Incubar en 1 ml de solución bloqueadora que contenga 2,5 μg/ml de anticuerpo primario de ratón anti-ZO-1 durante 1 h a 37 °C, luego lavar tres veces en 4 ml de 1x PBS durante 30 min cada uno.
   NOTA: La placa se puede inclinar durante la tinción de anticuerpos para minimizar el volumen de reactivos necesarios. Solo asegúrese de que toda la córnea esté completamente sumergida en una solución de anticuerpos.
3. Realice la reacción EdU Click-iT utilizando un cóctel que contiene 0,88 mg/ml de ácido ascórbico, 0,26 mg/ml de CuSO₄ y 2,5 μM de azida Alexa Fluor 488.
   1. Preparar componentes de reacción
      1. Agregue 500 μL de 1x PBS a 88 mg de ácido ascórbico y vórtice hasta que se disuelva.
      2. Añadir 840 μL de agua desionizada a 44 mg de CuSO₄ y vórtice hasta que se disuelva.
   2. Prepare el cóctel agregando los siguientes reactivos a 6 ml de 1x PBS en este orden, invirtiendo el tubo para mezclar después de cada adición: 30 μL de solución de ácido ascórbico, 30 μL de solución de CuSO₄ y luego 15 μL de Alexa Fluor 488
      NOTA: Una vez preparada, esta solución es sensible a la luz. Durante el resto del protocolo, las córneas deben protegerse de la luz siempre que sea posible.
   3. Agregue 1 ml de cóctel de reacción EdU a cada córnea y reaccione durante 1 h a temperatura ambiente.
4. Agregue 4 ml de 10 μg/ ml de Hoechst 33342 a cada córnea y reaccione durante 2 minutos a temperatura ambiente, luego lave tres veces en 1x PBS-T durante 30 min cada uno.
5. Incubar en 1 mL de solución de bloqueo que contenga 2 μg/mL alexa Fluor 555 de cabra igG anti-ratón durante 1 h a 37°C, luego lavar tres veces en 1x PBS-T durante 30 min cada uno.
6. Almacene las córneas a 4 °C en 4 ml de 1x PBS con 1% anti/anti, 0.1% de ciprofloxacina y 0.1% de anfotericina B para prevenir el crecimiento microbiano.
7. Al realizar imágenes confocales, monte córneas enteras en 200 μL de medio de montaje en portaobjetos de vidrio con cubierta pegada con cinta adhesiva para aplanar.

8. Análisis de imágenes de Trypan

1. Realice todos los análisis de imágenes utilizando el software de código abierto ImageJ de los NIH. Abra una imagen con archivo > Abrir y haga clic en > Ajustar imagen > umbral de color.
2. Use los controles deslizantes "Tono" para abarcar solo el rango azul y ajuste el control deslizante superior "Brillo" hacia la izquierda para incluir más del área manchada.
   NOTA: Si esta acción hace que se incluyan partes de la imagen que no están manchadas con Trypan, el control deslizante "Brillo" se puede devolver a su nivel original.
3. Ajuste lentamente el control deslizante superior "Saturación" hasta que el umbral delinee con precisión el área teñida.
   NOTA: Es útil tener una copia de la imagen original abierta para consultarla durante este proceso.
4. Haga clic en el botón Seleccionar dentro del menú umbral de color y, a continuación, utilice la herramienta pincel de selección para anular la selección de áreas fuera de la herida que se recogieron.
5. Haga clic en Analizar > Medir para informar del área teñida en píxeles.
6. Anule la selección de todo mediante Editar > Selección > Seleccione Ninguno y utilice la herramienta de selección ovalada para ajustarse lo más posible al limbo y, a continuación, haga clic en Analizar > medir para informar del área de la córnea en píxeles.
   NOTA: El brillo se puede activar temporalmente para ayudar en la visualización del limbo si esta parte de la imagen es demasiado oscura.
7. Registre los valores del área y divida el área teñida por el área de toda la córnea, luego multiplique por 100 para calcular el porcentaje teñido.
8. Repita este proceso dos veces más para cada imagen, luego tome el promedio de las tres mediciones.

9. Análisis estadístico

1. Una vez que se hayan analizado todas las imágenes, divida el porcentaje promedio de manchas en el Día 14 por el porcentaje manchado en el Día 0 para determinar el área residual no curada. Reste esta cantidad del 100% para calcular el porcentaje del área despojada curada durante 14 días.
2. Use una prueba t emparejada para comparar los valores porcentuales de curación entre los grupos de control y tratamiento.

Resultados

Este experimento se realizó inicialmente en 10 pares de córneas de investigación normales, ya que son las más fácilmente disponibles. Una vez que el método demostró ser exitoso, el estudio se replicó en 11 pares de córneas distróficas-marcadas como tales por bancos de ojos basados en la evaluación especular- para estudiar los efectos de eFGF1 (NM141) en córneas representativas de la población de pacientes con FECD. Para una mayor relevancia clínica, las cifras incluidas en el presente trabajo representan datos recopilados de córneas distróficas a menos que se indique lo contrario.

Después de simular el resultado quirúrgico de DSO, se realizó la tinción de Trypan Blue y se repitió durante el período de cultivo de 14 días, y se cuantificó la reducción de la tinción positiva para evaluar la cicatrización de la herida (Figura 2). La tinción de Alizarin Red también se realizó el día 14 para delinear los bordes celulares. Las áreas de color rojo oscuro sin un patrón claro visible (denominadas en lo sucesivo tinción negativa) aparecieron consistentemente dentro de la sección no curada de la lesión y en otras áreas de la córnea donde se presumía que las células estaban dañadas o faltaban. Las áreas que se tiñeron positivamente para Trypan Blue en el día 14 se correspondieron bien con la tinción negativa de Alizarin Red (Figura 2). Todas las córneas distróficas tratadas con eFGF1 (NM141) mostraron una mayor curación en el día 14 en comparación con la pareja no tratada. En promedio, las córneas tratadas demostraron una curación del 91% frente al 38% en las córneas de control, y esta diferencia fue estadísticamente significativa (p < 0,001) (Figura 3A). Esto es comparable a los resultados obtenidos de 20 córneas normales, donde los controles mostraron un promedio de 32% de curación y las córneas tratadas alcanzaron el 81%, lo que nuevamente fue estadísticamente significativo (p < 0,001) (Figura suplementaria 1). El porcentaje de curación se comparó entre córneas normales y distróficas utilizando dos pruebas t de muestra que asumieron una varianza igual, y no se observaron diferencias significativas en los grupos de control o tratamiento (datos no mostrados).

La información de los donantes proporcionada por los bancos de ojos (Tabla 1) para las córneas normales y distróficas se analizó para determinar si las características que incluyen la edad, los días almacenados en Optisol, el intervalo de muerte a recolección, la densidad celular y el sexo se correlacionan con la curación. El coeficiente de correlación de Pearson (r) se utilizó para investigar todos los factores excepto el sexo, que se evaluó mediante una prueba t no emparejada para comparar la curación entre hombres y mujeres. El valor absoluto de r fue inferior a 0,25 en todos los casos, lo que indica que cualquier correlación entre la curación y la edad, los días almacenados en Optisol, el intervalo de muerte a recolección o la densidad celular se consideraron insignificantes. La diferencia en la cicatrización entre hombres y mujeres no fue estadísticamente significativa (p = 0,53).

Similar al conjunto de datos normal, 10 de las 22 córneas distróficas presentaron una tinción notable de Trypan fuera del área despojada conectada al área teñida dentro de la lesión en al menos un punto de tiempo (generalmente el día 3), una observación que denominamos tinción periférica (Figura 4A). De esas 10, solo dos eran córneas de control cuyas contrapartes tratadas no exhibieron el mismo efecto. Los ocho restantes fueron pares emparejados y se presentaron con una gravedad similar entre las córneas del mismo individuo. Aunque los patrones de tinción fueron comparables entre las córneas normales y distróficas, la frecuencia de tinción periférica fue mayor en el conjunto de datos distróficos con un 45% de córneas positivas, en comparación con el 25% en el grupo normal. La Figura 4A muestra un par que se consideró positivo para la tinción periférica, ya que el área teñida fuera de la lesión se encontró con el borde de la herida en las imágenes del Día 6 y retrocedió gradualmente. En las imágenes correspondientes de Alizarin Red, las células en áreas con tinción periférica de Trypan parecían agrandadas y con forma anormal, al igual que las células que migraron al área despojada, y la tinción negativa se correlacionó con las áreas donde Trypan Blue estaba presente en el Día 14. A pesar de la gran porción de la córnea afectada durante todo el período de cultivo, se produjo una limpieza parcial o completa de la periferia teñida en las 10 córneas. Además, el porcentaje final de curación en el día 14 estuvo dentro del rango normal, según el grupo de tratamiento, para todas las córneas menos una. El valor atípico (0811L, representado en la Figura 4A) arrojó un valor negativo de porcentaje curado debido a los restos de tinción periférica que aún se conectaban al área de la lesión en el Día 14 (Figura 3A y Figura 4A). Un segundo patrón de tinción, conocido como tinción periférica, fue capturado en las imágenes de Alizarin Red de la Figura 4B, pero también fue evidente en las imágenes de Trypan Blue durante todo el período de cultivo en muchas córneas (Figura 4B). Esta observación se caracteriza por un anillo de tinción oscura alrededor del limbo, lo que indica endotelio comprometido. A pesar del término, este patrón era tan común en las córneas normales y distróficas que no se contaron como positivas para la tinción periférica. En estas imágenes, la córnea de control mostró una tinción más vibrante y extensa en el día 14, a pesar de que ambas córneas poseían una gravedad y un patrón de tinción similares al principio del período de cultivo. También se observó en la córnea tratada un número aparentemente mayor de células, que parecían más compactas y hexagonales en comparación con el control, aunque estas observaciones no se midieron cuantitativamente. Debido a la curvatura en la periferia, solo se incluyó en el análisis cuantitativo la tinción de Trypan dentro e inmediatamente alrededor del área despojada. Cuando se promediaron los valores de teñidos porcentuales en todas las córneas distróficas, la aparición de tinción periférica resultó en un aumento inicial a partir del día 0, en comparación con la disminución constante observada en córneas normales donde la tinción periférica fue menos frecuente (Figura 3B).

La inmunohistoquímica visualizada por imágenes confocales revela la expresión semiorganizada de ZO-1, un marcador funcional de las uniones estrechas de la CEC, dentro y alrededor del borde de la lesión (Figura 5), un patrón evidenciado de manera similar por la tinción de Alizarin Red (Figura 2 y Figura 4). El pleomorfismo y el polimegatismo son visibles por ZO-1 en la mayoría de las córneas distróficas; sin embargo, esta observación puede atribuirse a su estado enfermo y fue observada por el banco de ojos al examinar especularmente las córneas antes del cultivo. La expresión desorganizada de ZO-1 se observa dentro del área de la lesión de las córneas tratadas donde las células habían migrado hacia adentro, también consistente con los patrones de Alizarin Red. Las células que incorporan EdU se pueden ver alrededor del borde de la lesión y dentro del área lesionada en córneas controladas y tratadas (Figura 5). El patrón de CEC migrados también refleja los resultados de Trypan Blue, donde en las córneas de control se encontraron la mayoría de las células dentro de dos campos del borde de la lesión, mientras que las CEC en las córneas tratadas se pueden ver en toda el área despojada (Figura 2).

El etiquetado de EdU se realizó como una medida cualitativa en este estudio para confirmar que la proliferación contribuyó a la curación. Sin embargo, la cuantificación de las células que incorporan EdU no se pudo realizar sistemáticamente debido a la hinchazón de la córnea que impide que se capturen imágenes consistentes y replicables en y alrededor de la lesión. Como sustituto, se ha incluido el análisis cuantitativo realizado en un estudio realizado antes del establecimiento del modelo DSO para demostrar los efectos del eFGF-1 (NM141) sobre la proliferación (Figura 6). Las córneas normales de donantes humanos se cortaron en cuartos con un bisturí y se cultivaron en presencia de EdU, con o sin eFGF1 (NM141) durante 48 h como se describió anteriormente (Eveleth, 2020)¹⁶. Las imágenes y el análisis posterior de las células marcadas con Hoechst 33342 y EdU se realizaron por separado en la zona media no perturbada de los cuartos y en la zona de borde, dentro de tres campos desde donde se cortó la córnea. En la zona media, el porcentaje de células que incorporaron EdU fue bajo y muy variable en las 10 córneas analizadas. En promedio, los trimestres tratados con eFGF1 (NM141) tuvieron niveles más altos de incorporación de EdU en la zona media (4,1% ± 7,9%) en comparación con los controles (1,8% ± 2,9%), aunque esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p = 0,239). En el borde de la herida, los cuartos tratados estimulados con eFGF1 (NM141) mostraron tasas significativamente más altas de incorporación de EdU cuando se promedió (18,1% ± 11,5%) en comparación con los cuartos de control (10% ± 9,6%, p = 0,012).

Tabla 1: Información del donante para 22 córneas distróficas y 20 normales utilizadas en este estudio, así como 10 córneas normales utilizadas previamente para la cuantificación de EdU. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figura 2: Tinción de tinte vital de las córneas después de la extracción de Descemet. Las córneas humanas distróficas fueron despojadas de los 4 mm centrales de la membrana de Descemet e incubadas con o sin eFGF1 (NM141) (100 ng/mL) durante 14 días. Las lesiones fueron visualizadas por tinción de Trypan Blue en los días 0, 3, 6, 9, 12 y 14. Los bordes de la CCA fueron visualizados por la tinción alizarin Red el día 14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Las córneas humanas distróficas muestran una curación significativamente mayor de DSO cuando se cultivan con eFGF1 (NM141). (A) El porcentaje de curación se determinó midiendo el área teñida en el día 14 usando ImageJ y comparándola con el porcentaje teñido en el día 0. (B) El porcentaje promedio de teñidos graficados a lo largo del tiempo muestra una disminución constante en las córneas normales mientras alcanza su punto máximo en el Día 3 en las córneas distróficas debido a la mayor prevalencia de tinción periférica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Tinción de colorante vital de córneas distróficas con tinción periférica. (A) La tinción de tripano de la membrana intacta de Descemet se puede ver avanzando hacia el centro, luego se despeja con el tiempo tanto en las córneas de control como en las tratadas. (B) Los patrones de alizarina alrededor del limbo representan una observación típica del daño periférico y el restablecimiento desorganizado del endotelio observado en muchas córneas donantes, en este caso distróficas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Estimulación de la migración y proliferación de CECs por eFGF1 (NM141) en córneas distróficas despojadas. Micrografías confocales de las córneas despojadas de Descemet teñidas para ZO-1 (rojo), EdU (verde) y Hoechst 33342 (azul). La línea punteada representa el borde de la lesión con el área despojada en el lado izquierdo de la imagen y la membrana intacta de Descemet a la derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Cuantificación de células proliferantes de córneas normales descuartizadas con un bisturí e incubadas en medios que contienen EdU con o sin eFGF-1 (NM141) durante 48 h. Los cuartos se fotografiaron por triplicado en la zona media no perturbada y a lo largo del borde cortado, y los recuentos promediaron para determinar el porcentaje de células que incorporan EdU en las zonas media y de borde. Figura modificada de Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, utilizada con permiso¹⁶. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1: Las córneas humanas normales muestran una curación significativamente mayor de DSO cuando se cultivan con eFGF1 (NM141). ImageJ se utilizó para medir las áreas manchadas y determinar el % de curación. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Muchos oftalmólogos tienen preocupaciones sobre la recomendación de DSO a sus pacientes por dos razones principales: 1) el largo proceso de curación y 2) la falta de datos (DSO es un nuevo concepto en el campo de la cirugía oftálmica). La investigación que hemos presentado sería de gran utilidad para aliviar ambas preocupaciones. Sobre la base de los datos de este estudio y otros, la FDA ha aprobado un ensayo clínico de Fase 2 en el que eFGF1 (NM141) se administrará en diferentes programas de dosificación a pacientes sometidos a DSO¹⁷.

El método descrito anteriormente se modeló después de un estudio realizado por Soh et al., donde se evaluó la cicatrización endotelial corneal con y sin el inhibidor de ROCK Y-27632 en heridas rayadas y peladas¹⁸. Si bien Y-27632 aceleró la regeneración endotelial con la membrana de Descemet aún intacta, no se encontró una curación sustancial en las heridas despojadas incluso con tratamiento. Utilizando una técnica de extracción similar seguida de tratamiento con o sin eFGF1 (NM141), las observaciones que encontramos no fueron consistentes con las de Soh y sus colegas. La ausencia de tinción de trypan blue en muchas córneas tratadas en el día 14, y la presencia de uniones estrechas positivas ZO-1 dentro de la capa endotelial reformada argumenta que una barrera intacta, parte de la función natural de la CEC, se restauró tanto en córneas normales como distróficas. Aunque no se cuantificó en este estudio, la presencia de células EdU positivas en y alrededor del área despojada también sugiere proliferación como un mecanismo de curación, uno que hemos establecido previamente que puede ser estimulado por eFGF1 (NM141) en córneas lesionadas¹⁶. El análisis estadístico mostró que el tratamiento con eFGF1 (NM141) resultó en una curación significativamente mayor de DSO, en promedio más del doble que las córneas de control en el punto de tiempo de 14 días. Aunque las tasas de curación varían moderadamente entre los individuos, una característica típica de las córneas de los donantes, la replicabilidad de los resultados en tamaños de muestra grandes también evidencia un método altamente medible. Hasta donde sabemos, no hay otros ejemplos de un modelo de stripping ex vivo de Descemet en la literatura.

Los componentes clave del protocolo en sí que servirían valiosos para otros investigadores que estudian DSO son el uso de Trypan Blue para detectar el estroma desnudo y la técnica de procesamiento de imágenes utilizada para medir el área teñida. Trypan Blue se usa comúnmente en cirugía oftálmica, particularmente cuando se trabaja con la membrana de Descemet para detectar células no viables y ayudar en la visibilidad del tejido. Los puntos de tiempo de tinción incluidos en este protocolo permitieron repetir la tinción efectiva sin sobreexponer las córneas al azul de tripano, ya que ha demostrado ser tóxico para los CEC a altas concentraciones¹⁹. La reducción del área teñida durante 14 días en todas las córneas, confirmada por Alizarin Red e inmunohistoquímica como resultado de CEC migradas, demuestra un método simple y reproducible para medir la curación. Utilizando el menú de umbral de color de ImageJ, varios analistas recopilaron datos con desviaciones estándar consistentemente por debajo del 1% (datos no mostrados). Aunque los programas alternativos pueden funcionar de manera similar, ImageJ es un software de código abierto capaz de producir mediciones de área precisas para rastrear la curación.

Sin embargo, hay un aspecto del protocolo de extracción que encontramos que es necesario para la creación de heridas, pero obstructivo para el proceso general de curación. El uso de una aguja afilada de 30 G para marcar la membrana de Descemet a lo largo de la marca dejada por la punción de biopsia permite la creación de una herida lisa y circular que los médicos observan para apoyar una curación más rápida¹⁰. Al mismo tiempo, este paso es perjudicial para la córnea, ya que puede crear desgarros en las fibras estromales causando la muerte de las células estromales, impidiendo la migración de las células endoteliales a través del borde de la herida e induciendo la formación de nódulos que resultan en un edema postoperatorio más persistente²⁰. Los médicos que realizan DSO generalmente usan un gancho Sinskey inverso para iniciar la herida, pero sin ninguna presión intraocular que mantenga la córnea tensa, esta herramienta es menos efectiva en el modelo ex vivo . Una herramienta alternativa capaz de desgarrar la membrana de Descemet sin dañar el estroma subyacente mejoraría el protocolo, por ejemplo, la pieza de mano de riego y aspiración recomendada por Macsai y Shiloach¹⁰. Se necesitará más experimentación para determinar si esta técnica es compatible con el modelo ex vivo .

Un desafío que parece inherente al modelo ex vivo es la frecuente aparición de muerte por CEC en el área periférica a la herida, particularmente en las córneas distróficas. Esto ocasionalmente oscurece la cuantificación del área de la herida, ya que la precisión de la herramienta de umbral de color se vuelve más limitada a medida que el área teñida se extiende más allá del centro de la córnea, donde su curvatura da como resultado una distribución desigual de la luz. Sin embargo, estas mediciones variables ocurrieron principalmente en puntos de tiempo anteriores antes de que la tinción periférica retrocediera gradualmente a medida que las CEC dañadas se despejaban y las células vecinas se estiraban, migraban o proliferaban para reemplazarlas. En el punto de tiempo final de 14 días, el área manchada se había localizado de nuevo en el centro de la córnea, y todas las imágenes eran medibles. Una observación similar fue hecha con frecuencia comparable por Soh et al., donde cinco de las 14 córneas normales presentaron lo que denominaron "Fracaso Prematuro del Cultivo" (PCF) al principio del período de cultivo¹⁸. Si bien el daño se revirtió con el tiempo en nuestras córneas y, sin embargo, fue permanente en su caso, esto puede atribuirse al hecho de que su método requirió herir un área más grande de la córnea. La observación de tinción de Tripano periférica más prevalente en córneas distróficas puede indicar que las córneas distróficas son más susceptibles a la muerte de las células endoteliales que las córneas sanas. Si bien la causa exacta de esta muerte celular aún no se ha dilucidado, creemos que es poco probable que este problema sea relevante para las córneas humanas in vivo. El daño al endotelio periférico no ha sido reportado en ningún estudio de caso clínico de DSO hasta nuestro conocimiento, lo que sugiere que este fenómeno es exclusivo de las córneas de donantes cultivadas ex vivo 6,8,10,11,21. Aparte de dos casos en los que solo se tiñeron las córneas de control, todas las observaciones de tinción periférica se emparejaron, por lo que es poco probable que la causa fuera la exposición a eFGF1 (NM141). Sin embargo, es posible que en esos casos el tratamiento haya proporcionado un efecto protector contra el daño que de otro modo habría inducido la tinción periférica en ambas córneas. Se necesita más investigación sobre esta hipótesis.

Otra limitación de este método es el abastecimiento de córneas donantes representativas del fenotipo FECD para el que está destinado el DSO. Las córneas donantes de cualquier tipo son escasas, de ahí la necesidad de una cirugía que evite el uso de tejido donante. Para nuestros propósitos, las únicas córneas disponibles son las rechazadas del trasplante por diversas razones. Los bancos de ojos clasifican además estas córneas como normales o distróficas en función de criterios que incluyen presencia de guttas, ECD baja o no medible y morfología irregular de CEC. Confirmar un diagnóstico distrófico antes de aceptar tejido de un banco de ojos también es casi imposible, ya que la historia clínica de la mayoría de los donantes no incluye la historia ocular pasada y la única información proporcionada es el valor del ECD, las notas del técnico y, en algunos casos, una imagen especular representativa. Las córneas distróficas obtenidas para este estudio no mostraron guttas centrales confluentes en la microscopía confocal realizada después de que se completó el período de cultivo, lo que sugiere que pueden representar etapas "tempranas" de FECD. No esperamos que esto tenga un impacto significativo en las implicaciones del estudio, ya que el propósito de DSO es eliminar las áreas confluentes de guttas, permitiendo que las células periféricas sanas migren hacia adentro.

Este método proporciona una técnica altamente aplicable y reproducible para evaluar los agentes que podrían afectar la proliferación y migración de la CCA. El modelo tiene varias características que lo hacen más relevante fisiológicamente que los modelos in vitro que involucran CEC cultivados, incluso cuando se siembra en injerto de tejido corneal humano 22,23,24. En primer lugar, los CEC que se estimularán están en una monocapa exactamente como existen en el ojo del paciente, y están migrando a través del estroma corneal como lo harían después de la DSO clínica. El estroma en cuestión es del mismo paciente que los CEC, controlando así las posibles diferencias estromales relacionadas con el FECD. No hay necesidad de explantar, disociar y expandir cultivos de CEC con los desafíos asociados y el potencial para la transición endotelial a mesenquimal (EnMT) durante el proceso de cultivo. El protocolo descrito es en sí mismo muy similar al procedimiento clínico de DSO. Si bien evita los pasos de cultivo y expansión, este método tiene la limitación de que la duración del estudio está restringida por la hinchazón corneal, ya que la capa epitelial no se mantiene. Esto nos inhibe de investigar la morfología de los CEC que han migrado para cubrir el área despojada, lo que no deja claro si eventualmente se reorganizarán en una matriz hexagonal en este modelo. Garcin et al. han desarrollado una solución potencial con su máquina de almacenamiento activo (ASM), un dispositivo que ha demostrado mantener las córneas en cultivo durante un máximo de 3 meses con significativamente menos edema que las córneas mantenidas en el cultivo tradicional de órganos²⁵. Tal dispositivo puede ser útil para replicar y expandir este trabajo.

Este modelo tiene una utilidad potencial para probar otras terapias de curación de heridas (por ejemplo, inhibidores de ROCK), evaluar modificaciones en la técnica quirúrgica y comparar la curación entre diferentes poblaciones de donantes o etapas de la enfermedad. Esperamos que esta investigación, junto con los datos de los ensayos clínicos a medida que se publican, aliente a los médicos a considerar el DSO como una opción de tratamiento valiosa para sus pacientes elegibles con FECD.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2µm sterile 1000 mL filter units	VWR	10040-440
0.2µm sterile 250 mL filter units	VWR	10040-464
0.2µm sterile 500 mL filter units	VWR	10040-436
10mL syringe Luer-Lok Tip	Becton Dickinson	302995
12 well tissue culture treated plate	Corning	3513
15 mL conical Tubes	VWR	89039-668
16% paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Science	15710
2mL aspirating pipette	VWR	414004-265
310 direct heat CO2 incubator	Forma Scientific	13-998-082	Set to 37°C, 6% CO2
50 mL conical tubes	VWR	89039-660
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU)	Thermo Scientific	C10337
5mL, 10mL, 25mL and 50mL serological pipettes	VWR	89130-896, -898,  -900, -902
6 well tissue culture treated plate	Corning	3516
70% ethanol	BDH	BDH1164-4LP
Alexa Fluor 488 azide	Thermo Scientific	A10266
Alizarin Red S	Sigma	A5533-25G
Analytical balance	Sartorious	R200D
Antibiotic & Antimycotic 100x (anti-anti)	Thermo Scientific	15240-062
Anti-magnetic stainless steel forceps	Excelta	7-SA
Bottle top dispenser	Ward's Science	470134-946
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP9700-100
Calcium chloride (CaCl)	Amresco	1B1110-500G
Chex-all II sterilzation pouches	Propperman	24008
Cirpofloxacin hydrochloride	Alfa Aesar	J61970
Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4)	Sigma	469130-50g
Dissecting microscope	Nikon	SMZ1270
Dry vacuum pump	Welch	2019B-01
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Scientific	A31606-01
Frosted micro slides	VWR	48311-703
Galaxy miniStar microcentrifuge	VWR	C1413, VWR
Goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor Plus 555	Thermo Scientific	A32727
Goat serum	Sigma	G9023
Haemo-Sol detergent	Haemo-Sol International LLC	026-050
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate	Thermo Scientific	H3570
Hot plate/stirrer	Corning	PC-320
Human corneas	Lions Eye Institute for Transplant and Research, Advancing Sight Network, Eversight Eye Bank, Lions Vision Gift, and Georgia Eye Bank	NA
Hydrochloric acid (HCl)	BDH	BDH7204
ImageJ	National Institute of Health	Version 1.52a
Infinity 3s microscopy camera	Lumenera	1URCAP2
Infinity analyze software	Lumenera	Version 6.5.5
Insulin transferrin selenium (ITS)	Corning	41400-045
Iris scissors, 11 cm	World Precision Instruments	501264-G
L- Ascorbic acid	Sigma	A4544-25G
Manual single channel pipet	Rainin	17014-392, -391, -382
Needle PrecisionGlide 30G	Becton Dickinson	305106
N-Met141 TTHX1114	Biopharmaceutical Development Program	NA
Opti-Mem I + GlutaMAX-1 (Opti-MEM)	Thermo Scientific	51985-034
Orion Star A211 pH meter	Thermo Scientific	STARA211
Petri dishes	VWR	89107-632
Potassium chloride (KCl)	BDH	BDH9258-500G
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	VWR	0781-500G
Powerpette plus pipet controller	VWR	75856-456
Precision water bath 188	Precision Scientific Incorporated	WB05	Set to 37°C
Purifier Class II model biosafety cabinet	Labconco	36213043726
Safe-Lock tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22363212
Scalpel size 22 stainless steel	Sklar	446479
Sodium chloride (NaCl)	VWR	2041-2.5K
Sodium hosphate dibasic (Na2HPO4)	VWR	0404-1KG
Standard shaker	VWR	89032-092
Standard solid refrigerator	VWR	10820-402	Set to 4°C
Sterilmatic autoclave	Market Forge	STM-EL
Syringe filters	VWR	28145-477
Test tube rocker	Thermo Scientific	M48725Q
Tru-Punch disposable biopsy punch, 4 mm	Sklar	96-1146
Trypan Blue	Thermo Scientific	15250-061
Tween-20	Sigma	P7949-100mL
Vibrance antifade mounting medium with DAPI	Vector Laboratories Inc.	H-1800
VistaVision cover glasses, no. 1	VWR	16004-098
Vortex Genie 2	Fisher Scientific	G-560
ZO-1 monoclonal antibody (ZO1-1A12)	Thermo Scientific	33-9100