Descemet'in Sadece Mühendislik Fibroblast Büyüme Faktörü 1 Tarafından Uyarılan Hızlandırılmış İyileşme ile Sıyırılmasının İnsan Kornea Organ Kültürü Modeli

Özet

Descemet's Stripping Only, Fuchs Endotelyal Kornea Distrofisinden kaynaklanan merkezi kornea guttası olan hastalarda, periferik hücrelerin endotel tabakasını yenilemesi için Descemet'in zarının sıyrıldığı deneysel bir prosedürdür. Bu yazıda, eFGF1 (NM141) tarafından uyarılan hızlandırılmış iyileşme ile distrofik insan kornealarında ex vivo'da DSO'yu simüle eden yeni metodoloji sunulmaktadır.

Özet

Fuchs Endotelyal Kornea Distrofisi (FECD), disfonksiyonel kornea endotel hücrelerinden (CEC'ler) kaynaklanır ve şu anda tüm kornea veya Descemet zarının nakli ile tedavi edilmektedir. Oküler cerrahideki son gelişmeler, CEC'lerin pürüzsüz stroma üzerine göçüne izin vermek, korneaya fonksiyon ve vizyonu geri kazandırmak için guttae-yoğun Descemet zarının merkezi bir çemberinin çıkarıldığı cerrahi bir teknik olan Descemet's Stripping Only (DSO) 'yi kurmuştur. Bu potansiyel tedavi seçeneği oftalmik araştırmalar alanında büyük ilgi görmesine rağmen, DSO'nun başarılı bir ex vivo modeli oluşturulmamıştır ve klinik veriler sınırlıdır. Bu çalışma, insan donör kornealarında DSO'yu simüle eden yeni bir yara iyileştirme modeli sunmaktadır. İnsan mühendisliği FGF1'in (NM141) etkinliğini değerlendirmek için bu yaklaşımı kullanarak, tedavinin göçün uyarılması ve CEC'lerin çoğalması yoluyla iyileşmeyi hızlandırdığını bulduk. Bu bulgu, bu sonuçların DSO prosedürünün hedef popülasyonu olarak Fuchs Distrofisi olan hastalarda çoğaltılabileceğini doğrulamak için göz bankaları tarafından bildirilen distrofi belirtileri olan 11 çift insan korneasında doğrulandı.

Giriş

Fuchs Endotelyal Kornea Distrofisi (FECD), kornea endotel hücrelerinde (CEC'ler) pompa fonksiyonunun kaybı ve Descemet zarının yüzeyinde kollajen ve diğer hücre dışı matriks proteinlerinin aşırı birikmesi ile karakterize bir hastalıktır ve kornea guttae^1'i oluşturur. FECD için bilinen tek tedavi, hepsi rejeksiyon ve endotel hücre kaybı riski taşıyan çeşitli formlarda endotelyal keratoplastidir². Oftalmik cerrahideki ilerlemeler bu prosedürlerin zamanla daha az invaziv hale gelmesini sağlamış olsa da, herhangi bir transplantasyon şekli reddedilme riski ve yaşam boyu steroid kullanımı olasılığı, kendi eşlik eden advers olayları olan bir tedavi ile birlikte gelir. Ayrıca, küresel donör doku sıkıntısı,³ ihtiyacı olan her 70 hasta için sadece bir donör kornea bulunabilecek şekildedir. Bu zorluklar göz önüne alındığında, araştırmacılar ve klinisyenler donör dokuya olan ihtiyacı tamamen önleyen cerrahi yöntemleri araştırıyorlar. Bu deneysel tekniklerden biri, korneanın merkezine lokalize guttalı FECD hastalarının greft yerleştirilmeden sıyrılmış merkezi 4 mm'lik bir Descemet zarı çemberine sahip olduğu Endotelyal Keratoplasti (DWEK) olmadan Descemet'in Sadece Sıyırma (DSO) veya Endotelyal Keratoplasti (DWEK) olmadan Dessemetorheksi'dir. Guttaların çıkarılması, sağlıklı periferik hücreleri içe doğru göç etmeye ve endotel tek tabakasını reforme etmeye, sonunda stromal ödemi tersine çevirmeye ve vizyonu iyileştirmeye teşvik eder. Kavram başlangıçta hastaların Descemet zarının ayrılmasıyla komplike olan bir ameliyat geçirdikleri bir dizi vaka çalışmasında tanımlanmıştır, ancak CEC yeniden popülasyonu hala 4,5,6,7 olmuştur. Bu yöntemin birçok avantajı olmasına rağmen, iyileşme süreci uzun ve tutarsızdır, çünkü bazı hastalar ameliyatı takip eden aylarda iyileşme görülmezse kurtarma nakline ihtiyaç duyarlar⁸. Bu nedenlerden dolayı, CEC'lerin daha hızlı göç etmesini ve çoğalmasını uyaran bir ilaç, DSO geçiren FECD hastalarının iyileşme sürecinde faydalı olabilir.

Son zamanlarda yapılan birkaç çalışma, DSO uygulanan hastalar için ek bir tedavi olarak ROCK inhibitörlerini değerlendirmiş ve tedavi edilen hastaların DSO'nun ^sadece 9,10,11 grubundakilerden daha hızlı iyileştiğini ve daha yüksek merkezi endotel hücre yoğunluğuna (ECD) sahip olduğunu bulmuştur. Bununla birlikte, küçük numune boyutları ve dozlama rejimleri arasındaki farklılıklar nedeniyle, bu ortamda ROCK inhibitörlerinin etkinliğini daha iyi anlamak için daha fazla veriye ihtiyaç vardır.

Fibroblast Büyüme Faktörlerinin kornea endotelinin rejenerasyonunu hem sığır CEC'leri ile in vitro hem de in vivo in feline korneas^12,13 ile uyardığı gösterilmiştir. eFGF1 (NM141), çok daha kısa bir yarı ömre sahip olan 14,15 olan doğal FGF-1'in aksine, molekülü stabilize etmek için birkaç amino asit ikamesi içeren FGF-1'in tasarlanmış bir versiyonudur. Daha önce eFGF1'in (NM141) çeyrek insan kornealarında CEC'lerin ex vivo proliferasyonunu uyarma yeteneğini göstermiştik¹⁶. Bu çalışma, eFGF1 (NM141) gibi yardımcı tedavilerin bu uygulamada iyileşmeyi hızlandırıp hızlandırmadığını belirlemek için hem normal hem de distrofik kornealarda DSO'nun ilk başarılı ex vivo modelini kurarak bu çalışmayı geliştirmeye çalışmıştır.

Protokol

Bu çalışma, deneklerin tanımlanması olmadan mevcut örnekleri kullanmıştır ve 45 CFR 46.101 (b) (4) uyarınca IRB onayından muaftır.

İnsan donör korneaları ABD'deki çeşitli göz bankalarından elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu). Kornealar, speküler değerlendirme sonucunda guttae, pleomorfizm, polimegatiz ve/veya düşük EKD gibi bulgulara dayanarak göz bankaları tarafından bireysel olarak distrofik olarak değerlendirildi. Şekil 1 , yara oluşumu sırasında, sıyırmadan hemen sonra ve kültürde 2 hafta sonra korneada Tripan Mavisi lekelenmesini göstermektedir.

Şekil 1: Yara oluşumu sırasında, sıyırma işleminden hemen sonra ve Trypan Blue tarafından görselleştirildiği gibi kültürde 14 gün sonra korneayı temsil eden diyagram. Bu zaman noktaları arasındaki lekeli alandaki azalma, iyileşme seviyesini belirlemek için ölçüldü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Yara oluşumu

1. Steril forseps kullanarak, korneayı ortamdan çıkarın ve artık ortamı ve hücre kalıntılarını gidermek için 1x PBS'de durulayın. Duruladıktan sonra, kornea endotel tarafını bir Petri kabının kapağına yerleştirin.
2. Pipet, 30 μL Trypan Blue'yu iyi hazırlanmış bir tabağa koyun. Tripan Mavisi'ne yeni bir 4 mm'lik biyopsi yumruğunu batırın ve fazlalıklardan yararlanın.
3. Her iki elinizi kullanarak, zımbayı korneanın merkezinin üzerine yerleştirin ve minimum basınç uygulayarak doğrudan endotel yüzeyine indirin.
4. Kornea üzerindeki pozisyonu veya basıncı değiştirmeden, yumruğu bir elinize kaydırın ve yeni serbest bırakılan el ile forsepslere uzanın. Biyopsi yumruğunu birkaç kez yaklaşık 90 ° ileri geri bükerken korneayı yerinde tutmak için forsepsleri kullanın.
5. Zımbayı korneadan yukarı doğru kaldırın ve bir kenara koyun.
6. Fazla Tripan Mavisi'ni çıkarmak için 1x PBS'de bir kez daha durulayın.

2. Descemet'in sıyırması

1. Petri kabı kapağındaki kornea'yı diseksiyon kapsamına aktarın.
   NOT: Korneayı 5 dakikadan daha uzun süre kuru bırakmayın. İşlemi tamamlamak için daha fazla zamana ihtiyaç duyulursa, endoteli yeniden sulandırmak için 1x PBS'de tekrar durulayın.
2. Korneayı kavisli forsepslerle yerinde tutarak, biyopsi yumruğunun bıraktığı Trypan Blue halkası boyunca keskin bir 30 G iğnenin ucunu hafifçe sürükleyerek Descemet'in zarını puanlayın. Altta yatan stromayı bozmamak için minimum basınç kullanın.
3. Bir Sinskey kancasıyla, lezyonun merkezine doğru çalışarak Descemet'in zarını yara kenarının etrafına kaldırmak ve soymak için nazik kepçe hareketleri kullanın.
   NOT: Descemet'in zarı çok az direnç göstermelidir. Zorluk yaşanırsa, muhtemelen stroma yukarı çekilir. Bu olursa, yara kenarı boyunca yeni bir noktadan kaldırarak tekrar başlayın.
4. Descemet'in zarının çoğunluğu stromadan ayrıldıktan sonra, zarı çıkarmak ve bir kenara koymak için Gorovoy forseps kullanın.
5. Kalan membran parçaları için sıyrılmış alanı inceleyin ve Gorovoy forseps ile çıkarın.

3. Tripan Mavi boyama

NOT: Descemet'in sıyırılmasını takiben, yara bölgesini görselleştirmek için korneayı Tripan Mavisi ile lekeleyin.

1. Petri kabı kapağındaki korneayı biyogüvenlik kabinine geri koyun ve hücre kalıntılarını_{gidermek ve kalan} CEC'lerin bozulmamış Descemet zarına sıkı bir şekilde yapışmasını kolaylaştırmak için% 0.01 (w / v) CaCl 2 ve MgCl₂ içeren 1x PBS'de durulayın.
2. Korneayı iyi hazırlanmış bir kaba koyun ve 30 sn'lik endotel tabakasına 30 sn.
   1. Tüm endotel yüzeyinin kaplandığından emin olmak için korneayı hafifçe sallamak için forseps kullanın.
3. Fazla Tripan Mavisi'ni 1x PBS'de% 0.01 (w / v) CaCl₂ ve MgCl₂ ile durulayın ve lekeli korneayı 0. Gün zaman noktası için diseksiyon mikroskobu altında görüntüleyin.
   1. Korneanın dengelendiğinden emin olun, böylece ışık boyunca eşit olarak iletilir ve konumlandırma zaman noktaları arasında tekrarlanabilir.
      NOT: Forseps, gerekirse görüntüleme sırasında korneayı yerinde tutmak için kullanılabilir.

4. Kültür dönemi

1. OptiMEM'den oluşan düşük serum içeren altı kuyucuklu bir plakada kültür korneaları; 1x insülin, transferrin ve selenyum; 1x antibiyotik/antimikotik; 0.02 mg/mL CaCl₂; 0.2 mg/mL askorbik asit; ve% 0.8 ısı inaktive fetal sığır serumu. Sol korneayı sadece 8 mL düşük serum ortamında ve sağ korneayı 100 ng / mL eFGF1 (NM141) ile desteklenmiş 8 mL düşük serum ortamında kültürleyin.
   1. Günlük medya değişiklikleri ile 14 gün boyunca% 6 CO₂ ile 37 ° C'de inkübe edin.
2. Trypan Blue boyama prosedürünü 3, 6, 9, 12 ve 14. günlerde tekrarlayın ve boyama işleminden hemen sonra her korneayı görüntüleyin. Kamera ayarlarını tüm zaman noktalarında tutarlı tuttuğunuzdan emin olun.
3. 12. Günde, hem kontrol hem de eFGF1 (NM141) takviyeli ortama 10 μM EdU ekleyin ve çoğalan hücreleri etiketlemek için 48 saat boyunca kuluçkaya yatırın. 13. günde tekrar eklenen EdU ile medyayı yenileyin.
4. 14. Günde, EdU, Trypan boyası ve görüntü kornealarının eklenmesinden 48 saat sonra, CaCl 2 ve MgCl₂ ile 1x PBS_yerine, kalsiyumun Alizarin Kırmızı lekesi ile etkileşime girmesini önlemek için durulamalar için düz 1x PBS kullanın.

5. Alizarin Kırmızı boyama

1. 14. Günde,% 0.9 tuzlu su çözeltisinde% 5 Alizarin Kırmızısı hazırlayın.
   NOT: Alizarin Kırmızısı tuzlu su çözeltisi içinde tamamen çözünmeyecektir. Birleştirildikten sonra, vorteks çözeltisi ve en az 1 saat boyunca sallanır. Bir kez daha vorteks yapın ve çözülmemiş parçacıkları çıkarmak için kullanmadan önce filtreleyin.
2. Tripan boyama ve görüntüleme tamamlandıktan sonra, korneaları iyi bir kaba aktarın ve her korneanın endotel yüzeyine 200 μL Alizarin Kırmızısı ekleyin.
   1. 2 dakika bekletin, ardından iki 5 dakikalık yıkama için 8 mL 1x PBS ile önceden doldurulmuş altı kuyucuklu bir tabağa yerleştirmeden önce fazla Alizarin Kırmızısı'nı çıkarmak için her korneayı 1x PBS'lik bir Petri kabında durulayın.
3. İkinci yıkamadan sonra, her korneanın soyulmuş bölgesini diseksiyon mikroskobu altında görüntüleyin.
   NOT: Trypan görüntülemeden farklı olarak, kornealar, işlem sırasında kurumasını önlemek için Alizarin boyamasını görüntülemek için 1x PBS'de bırakılabilir.

6. Fiksasyon ve geçirgenlik

1. Alizarin görüntüleri yakalandıktan sonra, korneaları 12 delikli bir plakaya aktarın ve fiksasyondan önce dokudan herhangi bir parçacığı çıkarmak için% 0.05 Tween-20 (PBS-T) içeren 4 mL 1x PBS'de 30 dakika boyunca yıkayın.
2. Korneaları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 PFA'nın 4 mL'sinde sabitleyin.
3. % 1 Triton X-100 içeren 4 mL 1x PBS'de hücreleri 5 dakika geçirgenleştirin, ardından her biri 30 dakika boyunca 4 mL düz 1x PBS'de üç kez yıkayın.

7. İmmünohistokimya

1. Korneaları, %2 sığır serum albümini ve %2 keçi serumu içeren 4 mL 1x PBS'de 37°C'de 1 saat boyunca bloke edin.
2. 37°C'de 1 saat boyunca 2,5 μg/mL primer antikor fare anti-ZO-1 içeren 1 mL'lik bloke edici solüsyonda inkübe edin, ardından her biri 30 dakika boyunca 4 mL 1x PBS'de üç kez yıkayın.
   NOT: Plaka, gerekli reaktiflerin hacmini en aza indirmek için antikor boyama sırasında eğilebilir. Sadece tüm korneanın tamamen antikor çözeltisine batırıldığından emin olun.
3. 0,88 mg/mL askorbik asit, 0,26 mg/mL CuSO 4 ve 2,5 μM Alexa Fluor₄₈₈ azid içeren bir kokteyl kullanarak EdU Click-iT reaksiyonunu gerçekleştirin.
   1. Reaksiyon bileşenlerini hazırlama
      1. Çözünene kadar 88 mg askorbik asit ve vortekse 500 μL 1x PBS ekleyin.
      2. 44 mg_CuSO 4'e 840 μL deiyonize su ekleyin ve çözünene kadar vorteks.
   2. Aşağıdaki reaktifleri bu sırayla 6 mL'lik 1x PBS'ye ekleyerek, her eklemeden sonra karıştırmak üzere tüpü ters çevirerek kokteyl hazırlayın: 30 μL askorbik asit çözeltisi, 30 μL CuSO₄ çözeltisi ve ardından 15 μL Alexa Fluor 488
      NOT: Bir kez hazırlandıktan sonra, bu çözelti ışığa duyarlıdır. Protokolün geri kalanı için, kornealar mümkün olduğunca ışıktan korunmalıdır.
   3. Her korneaya 1 mL EdU reaksiyon kokteyli ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat reaksiyona sokun.
4. Her korneaya 4 mL 10 μg / mL Hoechst 33342 ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika reaksiyona girin, ardından her biri 30 dakika boyunca 1x PBS-T'de üç kez yıkayın.
5. 2 μg/mL Alexa Fluor 555 etiketli keçi fare karşıtı IgG içeren 1 mL'lik bloke edici çözeltiyi 37°C'de 1 saat boyunca inkübe edin, ardından her biri 30 dakika boyunca 1x PBS-T'de üç kez yıkayın.
6. Korneaları 4 °C'de 4 mL'lik 1x PBS'de %1 anti/anti, %0,1 siprofloksasin ve %0,1 Amfoterisin B ile depolayarak mikrobiyal büyümeyi önleyin.
7. Konfokal görüntüleme yaparken, tüm korneaları 200 μL montaj ortamına, kapak kayması düzleştirmek için bantlanmış cam slaytlara monte edin.

8. Trypan Görüntü Analizi

1. NIH'nin açık kaynaklı yazılımı ImageJ'yi kullanarak tüm görüntü analizlerini gerçekleştirin. Dosya > Aç'ı kullanarak bir görüntü açın ve Görüntü > Renk eşiğini ayarla>yı tıklatın.
2. Yalnızca mavi aralığı kapsayacak şekilde "Ton" kaydırıcılarını kullanın ve lekeli alanın daha fazlasını içerecek şekilde üst "Parlaklık" kaydırıcısını sola doğru ayarlayın.
   NOT: Bu eylem, görüntünün Trypan lekeli olmayan bölümlerinin dahil edilmesine neden olursa, "Parlaklık" kaydırıcısı orijinal düzeyine döndürülebilir.
3. Eşik lekeli alanı doğru bir şekilde özetleyene kadar üst "Doygunluk" kaydırıcısını yavaşça ayarlayın.
   NOT: Bu işlem sırasında başvurmak üzere orijinal görüntünün bir kopyasının açık olması yararlı olacaktır.
4. Renk eşiği menüsündeki Seç düğmesini tıklayın, sonra alınan yaranın dışındaki alanların seçimini kaldırmak için seçim fırçası aracını kullanın.
5. Lekeli alanı piksel cinsinden bildirmek için Analiz > Ölçü'yü tıklayın.
6. > Seçimini Düzenle'yi kullanarak tümünün seçimini kaldırın > Hiçbirini Seçme'yi seçin ve limbüse mümkün olduğunca yakın oturması için oval seçim aracını kullanın, ardından korneanın alanını piksel cinsinden raporlamak için > Ölçüyü Analiz Et'i tıklayın.
   NOT: Görüntünün bu kısmı çok karanlıksa limbusun görselleştirilmesine yardımcı olmak için parlaklık geçici olarak açılabilir.
7. Alan değerlerini kaydedin ve lekeli bölgeyi tüm korneanın alanına bölün, ardından lekeli yüzdeyi hesaplamak için 100 ile çarpın.
8. Bu işlemi her görüntü için iki kez daha tekrarlayın, ardından üç ölçümün ortalamasını alın.

9. İstatistiksel Analiz

1. Tüm görüntüler analiz edildikten sonra, kalan iyileşmemiş alanı belirlemek için 14. Günde boyanan ortalama yüzdeyi 0. Günde lekelenen yüzdeye bölün. 14 gün içinde iyileşen soyulmuş alanın yüzdesini hesaplamak için bu miktarı% 100'den çıkarın.
2. Kontrol ve tedavi grupları arasındaki yüzde iyileşmiş değerleri karşılaştırmak için eşleştirilmiş bir t-testi kullanın.

Sonuçlar

Bu deney başlangıçta 10 çift normal araştırma korneasında gerçekleştirildi, çünkü bunlar en kolay şekilde mevcuttu. Yöntemin başarılı olduğu gösterildikten sonra, çalışma, FECD hasta popülasyonunu temsil eden kornealarda eFGF1'in (NM141) etkilerini incelemek için speküler değerlendirmeye dayalı göz bankaları tarafından bu şekilde etiketlenmiş 11 çift distrofik korneada çoğaltıldı. Daha fazla klinik alaka düzeyi için, bu çalışmada yer alan rakamlar, aksi belirtilmedikçe distrofik kornealardan toplanan verileri temsil etmektedir.

DSO'nun cerrahi sonucu simüle edildikten sonra, Tripan Mavisi boyama yapıldı ve 14 günlük kültür periyodu boyunca tekrarlandı ve pozitif boyamadaki azalma yara iyileşmesini değerlendirmek için ölçüldü (Şekil 2). Alizarin Kırmızı boyama da hücre sınırlarını belirlemek için 14. günde yapıldı. Net bir patern görünmeyen koyu kırmızı alanlar (bundan böyle negatif boyama olarak anılacaktır), lezyonun iyileşmemiş bölümünde ve hücrelerin hasar gördüğü veya eksik olduğu varsayılan korneanın diğer bölgelerinde tutarlı bir şekilde ortaya çıkmıştır. 14. günde Tripan Mavisi için pozitif boyanan alanlar, Alizarin Kırmızısı tarafından negatif boyanma ile iyi bir şekilde uyuşuyordu (Şekil 2). eFGF1 (NM141) ile tedavi edilen tüm distrofik kornealar, tedavi edilmeyen eşe kıyasla 14. günde daha fazla iyileşme gösterdi. Ortalama olarak, tedavi edilen kornealarda kontrol kornealarında %38'e karşılık %91 iyileşme göstermiş ve bu fark istatistiksel olarak anlamlıydı (p < 0.001) (Şekil 3A). Bu, kontrollerin ortalama% 32 iyileşme gösterdiği ve tedavi edilen korneaların% 81'e ulaştığı 20 normal korneadan elde edilen sonuçlarla karşılaştırılabilir, bu da yine istatistiksel olarak anlamlıydı (p < 0.001) (Ek Şekil 1). İyileşme yüzdesi, eşit varyans varsayılarak iki örnek t-testi kullanılarak normal ve distrofik kornealar arasında karşılaştırıldı ve kontrol veya tedavi gruplarında anlamlı bir fark görülmedi (veriler gösterilmedi).

Hem normal hem de distrofik kornealar için göz bankaları tarafından sağlanan donör bilgileri (Tablo 1), yaş, Optisol'de saklanan günler, ölümden toplama aralığına, hücre yoğunluğuna ve cinsiyete kadar olan özelliklerin iyileşme ile ilişkili olup olmadığını belirlemek için analiz edildi. Pearson'ın korelasyon katsayısı (r), erkekler ve kadınlar arasındaki iyileşmeyi karşılaştırmak için eşleştirilmemiş bir t-testi kullanılarak değerlendirilen cinsiyet dışındaki tüm faktörleri araştırmak için kullanıldı. R'nin mutlak değeri her durumda 0.25'in altındaydı, bu da iyileşme ve yaş, Optisol'de depolanan günler, toplama aralığına ölüm veya hücre yoğunluğu arasındaki herhangi bir korelasyonun ihmal edilebilir olarak kabul edildiğini gösteriyordu. Erkekler ve kadınlar arasındaki iyileşme farkı istatistiksel olarak anlamlı değildi (p = 0.53).

Normal veri setine benzer şekilde, 22 distrofik korneadan 10'u, lezyon içindeki lekeli bölgeye bağlı soyulmuş alanın dışında, en az bir zaman noktasında (genellikle Gün 3) kayda değer Tripan boyaması ile sunuldu - periferik boyama olarak adlandırdığımız bir gözlem (Şekil 4A). Bu 10 kişiden sadece ikisi, tedavi edilen meslektaşları aynı etkiyi göstermeyen kontrol kornealarıydı. Kalan sekizi eşleşen çiftlerdi ve aynı bireyden kornealar arasında benzer şiddette sunuldular. Boyama paternleri normal ve distrofik kornealar arasında karşılaştırılabilir olmasına rağmen, periferik boyama sıklığı distrofik veri setinde korneaların %45'i pozitif iken normal grupta %25'e kıyasla daha yüksekti. Şekil 4A , lezyonun dışındaki lekeli alanın 6. Gün görüntülerinde yara kenarıyla buluştuğu ve yavaş yavaş geri çekildiği için periferik boyama için pozitif olarak kabul edilen bir çifti göstermektedir. İlgili Alizarin Kırmızısı görüntülerinde, periferik Trypan boyaması olan bölgelerdeki hücreler, soyulmuş bölgeye göç eden hücreler gibi, genişlemiş ve anormal şekilli görünüyordu ve negatif boyama, Trypan Blue'nun 14. Günde bulunduğu alanlarla ilişkiliydi. Kültür dönemi boyunca etkilenen korneanın büyük bir kısmına rağmen, lekeli çevrenin kısmen veya tamamen temizlenmesi 10 korneanın hepsinde meydana geldi. Ek olarak, 14. Günde iyileşen son yüzde, bir kornea hariç herkes için tedavi grubuna bağlı olarak normal aralıktaydı. Aykırı değer (Şekil 4A'da resmedilen 0811L), 14. Günde hala lezyon alanına bağlı olan periferik boyama kalıntıları nedeniyle negatif yüzde iyileşmiş bir değer döndürmüştür (Şekil 3A ve Şekil 4A). Uzak periferik boyama olarak adlandırılan ikinci bir boyama paterni, Şekil 4B'deki Alizarin Kırmızısı görüntülerinde yakalandı, ancak birçok korneada kültür dönemi boyunca Trypan Blue görüntülerinde de belirgindi (Şekil 4B). Bu gözlem, limbüsün etrafında koyu renkli bir lekelenme halkası ile karakterizedir ve tehlikeye atılmış endotel olduğunu gösterir. Terime rağmen, bu model hem normal hem de distrofik kornealarda o kadar yaygındı ki, periferik boyama için pozitif olarak sayılmadılar. Bu görüntülerde, kontrol korneası, her iki korneaların da kültür döneminin başlarında benzer şiddete ve boyama modeline sahip olmasına rağmen, 14. Günde daha canlı ve kapsamlı boyama gösterdi. Tedavi edilen korneada ayrıca, bu gözlemler nicel olarak ölçülmemesine rağmen, kontrole kıyasla daha kompakt ve altıgen görünen görünüşte daha fazla sayıda hücre olduğu belirtildi. Periferideki eğrilik nedeniyle, sadece soyulmuş alanın içinde ve hemen çevresinde Tripan boyama kantitatif analize dahil edildi. Tüm distrofik kornealarda yüzde boyalı değerlerin ortalaması alındığında, periferik boyamanın ortaya çıkışı, periferik boyamanın daha az yaygın olduğu normal kornealarda görülen sabit azalmanın aksine, 0. Gün'den itibaren ilk artışla sonuçlandı (Şekil 3B).

Konfokal görüntüleme ile görselleştirilen immünohistokimya, CEC sıkı kavşaklarının fonksiyonel bir belirteci olan ZO-1'in lezyon kenarının içinde ve çevresinde yarı organize ekspresyonunu ortaya koymaktadır (Şekil 5), Alizarin Kırmızı boyama ile benzer şekilde kanıtlanmış bir model (Şekil 2 ve Şekil 4). Pleomorfizm ve polimegatizem, çoğu distrofik korneada ZO-1 tarafından görülebilir; Bununla birlikte, bu gözlem hastalıklı durumlarına bağlanabilir ve kültürlemeden önce korneaların speküler muayenesi üzerine göz bankası tarafından not edilmiştir. Düzensiz ZO-1 ekspresyonu, hücrelerin içeri doğru göç ettiği tedavi edilen korneaların lezyon alanında, Alizarin Kırmızısı desenleriyle de tutarlı olarak gözlenir. EdU içeren hücreler lezyonun sınırının çevresinde ve lezyonlu bölgenin içinde kontrol altında ve tedavi edilen kornealarda görülebilir (Şekil 5). Göç eden CEC'lerin paterni aynı zamanda kontrol kornealarında çoğu hücrenin lezyon kenarının iki alanında bulunduğu, tedavi edilen kornealardaki CEC'lerin soyulmuş alan boyunca görülebildiği Trypan Blue sonuçlarını da yansıtır (Şekil 2).

Bu çalışmada proliferasyonun iyileşmeye katkıda bulunduğunu doğrulamak için nitel bir ölçüt olarak EdU etiketlemesi yapılmıştır. Bununla birlikte, EdU içeren hücrelerin miktarı, lezyonun içinde ve çevresinde tutarlı, tekrarlanabilir görüntülerin yakalanmasını engelleyen kornea şişmesi nedeniyle sistematik olarak gerçekleştirilememiştir. Vekil olarak, DSO modelinin kurulmasından önce yapılan bir çalışmada yapılan nicel analiz, eFGF-1'in (NM141) proliferasyon üzerindeki etkilerini göstermek için dahil edilmiştir (Şekil 6). Normal insan donör korneaları bir neşter kullanılarak dörde bölündü ve daha önce tarif edildiği gibi 48 saat boyunca eFGF1 (NM141) olsun veya olmasın, EdU varlığında kültürlendi (Eveleth, 2020)¹⁶. Hoechst 33342 ve EdU etiketli hücrelerin görüntülenmesi ve müteakip analizi, çeyreklerin bozulmamış orta bölgesinde ve kenar bölgesinde, korneanın kesildiği üç alanda ayrı ayrı gerçekleştirildi. Orta bölgede, EdU'yu içeren hücrelerin yüzdesi, analiz edilen 10 kornea boyunca düşük ve oldukça değişkendi. Ortalama olarak, eFGF1 (NM141) ile tedavi edilen çeyrekler, orta bölgede kontrollere (% 1.8 ±% 2.9) kıyasla daha yüksek EdU katılım seviyelerine sahipti (% 4.1 ±% 7.9), ancak bu fark istatistiksel olarak anlamlı değildi (p = 0.239). Yara kenarında, eFGF1 (NM141) ile uyarılan tedavi edilen çeyrekler, kontrol çeyreklerine kıyasla (% 10 ±% 9.6, p = 0.012) ortalama alındığında (% 18.1 ±% 11.5) anlamlı derecede daha yüksek EdU birleşme oranları göstermiştir.

Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan 22 distrofik ve 20 normal kornea ile daha önce EdU kantitasyonu için kullanılan 10 normal kornea için donör bilgileri. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Resim 2: Descemet'in sıyırılması sonrası korneaların hayati boya boyaması. Distrofik insan korneaları, merkezi 4 mm'lik Descemet zarından sıyrıldı ve 14 gün boyunca eFGF1 (NM141) (100 ng / mL) ile veya eFGF1 (NM141) olmadan inkübe edildi. Lezyonlar 0, 3, 6, 9, 12 ve 14. günlerde Tripan Blue boyaması ile görüntülendi. CEC sınırları, 14. günde Alizarin Kırmızısı boyama ile görselleştirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Distrofik insan korneaları, eFGF1 (NM141) ile kültürlendiğinde DSO'dan önemli ölçüde daha fazla iyileşme göstermektedir. (A) İyileşme yüzdesi, ImageJ kullanılarak 14. Günde lekelenmiş alanın ölçülmesi ve bunu 0. Günde boyanan yüzde ile karşılaştırılmasıyla belirlenmiştir. (B) Zaman içinde grafiklendirilen ortalama boyanmış yüzde, normal kornealarda tutarlı bir düşüş gösterirken, periferik boyama prevalansının daha yüksek olması nedeniyle distrofik kornealarda 3. günde zirveye ulaşır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Distrofik korneaların periferik boyama ile vital boya boyaması. (A) Bozulmamış Descemet zarının tripan boyaması, merkeze doğru ilerlediği, daha sonra hem kontrol hem de tedavi edilen kornealarda zamanla temizlendiği görülebilir. (B) Limbüs çevresindeki Alizarin paternleri, periferik hasarın tipik bir gözlemini ve birçok donör korneada görülen endotelin düzensiz yeniden oluşumunu temsil eder - bu durumda distrofiktir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Soyulmuş distrofik kornealarda eFGF1 (NM141) ile göçün uyarılması ve CEC'lerin çoğalması. Descemet'in soyulmuş kornealarının konfokal mikrografları ZO-1 (kırmızı), EdU (yeşil) ve Hoechst 33342 (mavi) için boyanmıştır. Noktalı çizgi, görüntünün sol tarafında soyulmuş alan ve sağda sağlam Descemet'in zarı ile lezyon kenarını temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Normal kornealardan çoğalan hücrelerin bir neşter kullanılarak dörde bölündüğü ve 48 saat boyunca eFGF-1 (NM141) olsun veya olmasın EdU içeren ortamlarda inkübe edilmesi. Çeyrekler, bozulmamış orta bölgede ve kesilmiş kenar boyunca üçlü olarak görüntülendi ve orta ve kenar bölgelerinde EdU'yu içeren hücrelerin yüzdesini belirlemek için sayımların ortalaması alındı. Oküler Farmakoloji ve Tedavi Dergisi'nden değiştirilen şekil, izin^{alınarak kullanılmıştır 16}. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Normal insan korneaları, eFGF1 (NM141) ile kültürlendiğinde DSO'dan önemli ölçüde daha fazla iyileşme gösterir. ImageJ lekeli alanları ölçmek ve iyileşme yüzdesini belirlemek için kullanıldı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışmalar

Birçok göz doktorunun DSO'yu hastalarına iki ana nedenden dolayı önerme konusunda endişeleri vardır: 1) uzun iyileşme süreci ve 2) veri eksikliği (DSO, oftalmik cerrahi alanında yeni bir kavramdır). Sunduğumuz araştırma, bu endişelerin her ikisini de hafifletmek için büyük fayda sağlayacaktır. Bu çalışmadan ve diğerlerinden elde edilen verilere dayanarak, FDA, eFGF1'in (NM141) DSO¹⁷ uygulanan hastalara değişen doz programlarında uygulanacağı bir Faz 2 klinik çalışmasını onaylamıştır.

Yukarıda tarif edilen yöntem, Soh ve ark. tarafından yapılan ve kornea endotel iyileşmesinin hem çizilmiş hem de soyulmuş yaralarda ROCK inhibitörü Y-27632 ile ve ROCK inhibitörü olmadan değerlendirildiği bir çalışmadan sonra modellenmiştir¹⁸. Y-27632, Descemet'in zarı hala sağlam olan endotel rejenerasyonunu hızlandırırken, sıyrılmış yaralarda tedaviyle bile önemli bir iyileşme bulunamadı. Benzer bir sıyırma tekniğini ve ardından eFGF1 (NM141) ile veya eFGF1 (NM141) olmadan tedavi kullanarak, bulduğumuz gözlemler Soh ve meslektaşlarınınkilerle tutarlı değildi. 14. Günde tedavi edilen birçok korneada Tripan Mavisi boyamasının olmaması ve reforme edilmiş endotel tabakası içinde ZO-1 pozitif sıkı kavşakların varlığı, CEC'nin doğal fonksiyonunun bir parçası olan sağlam bir bariyerin hem normal hem de distrofik kornealarda restore edildiğini savunmaktadır. Bu çalışmada nicelleştirilmemiş olsa da, soyulmuş alanın içinde ve çevresinde EdU-pozitif hücrelerin varlığı, daha önce kurduğumuz bir iyileşme mekanizması olarak proliferasyonun, yaralı kornealarda eFGF1 (NM141) tarafından uyarılabileceğini düşündürmektedir^. İstatistiksel analiz, eFGF1 (NM141) ile yapılan tedavinin, DSO'dan önemli ölçüde daha fazla iyileşme ile sonuçlandığını, 14 günlük zaman diliminde kontrol kornealarının ortalama iki katından daha yüksek olduğunu göstermiştir. İyileşme oranları bireyler arasında orta derecede değişmekle birlikte - donör korneaların tipik bir özelliği - sonuçların büyük örneklem büyüklükleri üzerinde tekrarlanabilirliği de oldukça ölçülebilir bir yöntem olduğunu kanıtlamaktadır. Bildiğimiz kadarıyla literatürde ex vivo Descemet'in sıyırma modelinin başka bir örneği yoktur.

DSO'yu inceleyen diğer araştırmacılar için değerli olacak protokolün kendisinin temel bileşenleri, çıplak stromayı tespit etmek için Trypan Blue'nun kullanılması ve lekeli alanı ölçmek için kullanılan görüntü işleme tekniğidir. Tripan Mavisi, oftalmik cerrahide, özellikle canlı olmayan hücreleri tespit etmek ve dokunun görünürlüğüne yardımcı olmak için Descemet'in zarıyla çalışırken yaygın olarak kullanılır. Bu protokolde yer alan boyama zaman noktaları, korneaları Trypan Blue'ya aşırı maruz bırakmadan etkili tekrar boyama yapılmasına izin verdi, çünkü yüksek konsantrasyonlarda CEC'ler için toksik olduğu gösterilmiştir¹⁹. Alizarin Red ve immünohistokimya tarafından göç edilen CEC'lerin sonucu olduğu doğrulanan tüm kornealarda lekeli alanın 14 gün boyunca azaltılması, iyileşmeyi ölçmek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem göstermektedir. ImageJ'nin renk eşiği menüsünü kullanarak, birden fazla analist standart sapmaları sürekli olarak %1'in altında olan verileri topladı (veriler gösterilmedi). Alternatif programlar benzer şekilde performans gösterebilse de, ImageJ iyileşmeyi izlemek için doğru alan ölçümleri üretebilen açık kaynaklı bir yazılımdır.

Bununla birlikte, sıyırma protokolünün, yara oluşumu için her ikisini de gerekli bulduğumuz, ancak genel iyileşme sürecine engel olan bir yönü vardır. Descemet'in zarını biyopsi yumruğunun bıraktığı iz boyunca puanlamak için keskin, 30 G'lik bir iğne kullanmak, klinisyenler tarafından daha hızlı iyileşmeyi desteklemek için not edilen pürüzsüz, dairesel bir yaranın oluşturulmasını sağlar¹⁰. Aynı zamanda, bu adım korneaya zarar verir, çünkü stromal liflerde stromal hücre ölümüne neden olan gözyaşları oluşturabilir, endotel hücrelerinin yara kenarı boyunca göçünü engelleyebilir ve ameliyat sonrası daha kalıcı ödem ile sonuçlanan nodüllerin oluşumunu indükleyebilir²⁰. DSO uygulayan klinisyenler tipik olarak yarayı başlatmak için ters bir Sinskey kancası kullanırlar, ancak korneayı gergin tutan herhangi bir göz içi basıncı olmadan, bu araç ex vivo modelinde daha az etkilidir. Altta yatan stromaya zarar vermeden Descemet'in zarını yırtabilen alternatif bir alet, örneğin Macsai ve Shiloach¹⁰ tarafından önerilen sulama ve aspirasyon el aleti gibi protokolü geliştirecektir. Bu tekniğin ex vivo modelle uyumlu olup olmadığını belirlemek için daha fazla deneye ihtiyaç duyulacaktır.

Ex vivo modele özgü görünen bir zorluk, özellikle distrofik kornealarda, yaranın periferik bölgesinde CEC ölümünün sık görülmesidir. Bu bazen yara bölgesinin kantitatasyonunu gizler, çünkü lekeli alan korneanın merkezinin ötesine uzandıkça renk eşik aracının doğruluğu daha sınırlı hale gelir ve eğriliği eşit olmayan ışık dağılımına neden olur. Bununla birlikte, bu değişken ölçümler öncelikle periferik boyama, hasarlı CEC'ler temizlendikçe ve komşu hücreler onları değiştirmek için gerildikçe, göç ettikçe veya çoğaldıkça yavaş yavaş geri çekilmeden önce daha erken zaman noktalarında meydana geldi. Son 14 günlük zaman noktasında, lekeli alan korneanın merkezine geri dönmüştü ve tüm görüntüler ölçülebilirdi. Benzer bir gözlem, 14 normal korneadan beşinin, kültür periyodu^18'in başlarında 'Prematüre Kültür Yetmezliği' (PCF) olarak adlandırdıkları şeyi sundukları Soh ve ark. tarafından karşılaştırılabilir sıklıkta yapılmıştır. Hasar kornealarımızda zamanla tersine dönmüş ve yine de vakalarında kalıcı olsa da, bu, yöntemlerinin korneanın daha geniş bir alanını yaralamayı gerektirdiği gerçeğine bağlanabilir. Distrofik kornealarda daha yaygın periferik Tripan boyamasının gözlenmesi, distrofik korneaların endotel hücre ölümüne sağlıklı kornealardan daha duyarlı olduğunu gösterebilir. Bu hücre ölümünün kesin nedeni henüz aydınlatılamamış olsa da, bu konunun in vivo olarak insan kornealarıyla ilgili olmasının muhtemel olmadığına inanıyoruz. Periferik endotel hasarı, DSO'nun bildiğimiz kadarıyla herhangi bir klinik vaka çalışmasında bildirilmemiştir, bu da bu fenomenin donör kornealara özgü olduğunu düşündürmektedir. ex vivo 6,8,10,11,21. Sadece kontrol kornealarının boyandığı iki örnek dışında, periferik boyamanın tüm gözlemleri eşleştirildi, bu nedenle nedenin eFGF1'e (NM141) maruz kalması muhtemel değildir. Bununla birlikte, bu gibi durumlarda tedavinin, aksi takdirde her iki korneada periferik lekelenmeye neden olacak hasara karşı koruyucu bir etki sağlamış olması mümkündür. Bu hipotez üzerinde daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.

Bu yöntemin bir başka sınırlaması, DSO'nun amaçlandığı FECD fenotipini temsil eden donör korneaların tedarik edilmesidir. Her türlü donör kornea azdır, bu nedenle donör doku kullanımından kaçınan bir ameliyata ihtiyaç vardır. Bizim amaçlarımız için, mevcut tek kornea, çeşitli nedenlerle nakilden reddedilenlerdir. Göz bankaları ayrıca bu korneaları gutta varlığı, düşük veya ölçülemeyen ECD ve düzensiz CEC morfolojisi gibi kriterlere göre normal veya distrofik olarak sınıflandırır. Bir göz bankasından doku kabul etmeden önce distrofik bir tanıyı doğrulamak da neredeyse imkansızdır, çünkü çoğu donörün tıbbi öyküsü geçmiş oküler öyküyü içermez ve sağlanan tek bilgi ECD değeri, teknisyenin notları ve bazı durumlarda temsili bir speküler görüntüdür. Bu çalışma için elde edilen distrofik kornealar, kültür periyodu tamamlandıktan sonra yapılan konfokal mikroskopi üzerine konfluent santral guttae göstermedi, bu da FECD'nin "erken" aşamalarını temsil edebileceğini düşündürmektedir. Bunun çalışmanın etkileri üzerinde önemli bir etkisi olmasını beklemiyoruz, çünkü DSO'nun amacı, sağlıklı periferik hücrelerin içe doğru göç etmesine izin vererek guttae'nin akıcı alanlarını çıkarmaktır.

Bu yöntem, CEC proliferasyonunu ve göçünü etkileyebilecek ajanları değerlendirmek için oldukça uygulanabilir ve tekrarlanabilir bir teknik sağlar. Model, insan kornea dokusu grefti^22,23,24'e tohumlandığında bile, kültürlenmiş ^CEC'leri içeren in vitro modellerden fizyolojik olarak daha alakalı kılan çeşitli özelliklere sahiptir. İlk olarak, uyarılacak CEC'ler tam olarak hastanın gözünde olduğu gibi tek katmanlı bir tabakadadır ve klinik DSO'dan sonra olduğu gibi kornea stroması boyunca göç ederler. Söz konusu stroma, CEC'lerle aynı hastadandır, bu nedenle FECD ile ilişkili potansiyel stromal farklılıkları kontrol eder. Kültürleme işlemi sırasında CEC'lerin kültürlerini Endotelyal - Mezenkimal Geçiş (EnMT) için ilişkili zorluklar ve potansiyel ile genişletmeye, ayrıştırmaya ve genişletmeye gerek yoktur. Tarif edilen protokolün kendisi klinik DSO prosedürüne çok benzer. Kültür ve genişleme adımlarını atlarken, bu yöntem, epitel tabakası korunmadığı için çalışma süresinin kornea şişmesi ile sınırlandırılması sınırlamasına sahiptir. Bu, soyulmuş alanı kaplamak için göç eden CEC'lerin morfolojisini araştırmamızı engeller ve sonunda bu modelde altıgen bir diziye yeniden düzenlenip düzenlenmeyeceklerini belirsiz bırakır. Garcin ve ark., geleneksel organ kültüründe tutulan kornealardan önemli ölçüde daha az ödem ile korneaları kültürde 3 aya kadar tuttuğu gösterilen bir cihaz olan aktif depolama makineleri (ASM) ile potansiyel bir çözüm geliştirmişlerdir²⁵. Böyle bir cihaz, bu çalışmanın çoğaltılmasında ve genişletilmesinde yardımcı olabilir.

Bu model, diğer yara iyileştirici tedavileri (örneğin, ROCK inhibitörleri) test etmede, cerrahi teknikteki modifikasyonları değerlendirmede ve farklı donör popülasyonları veya hastalık aşamaları arasındaki iyileşmeyi karşılaştırmada potansiyel faydaya sahiptir. Bu araştırmanın, ortaya çıkan klinik çalışma verileriyle birlikte, klinisyenleri DSO'yu uygun FECD hastaları için değerli bir tedavi seçeneği olarak görmeye teşvik ettiğini umuyoruz.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2µm sterile 1000 mL filter units	VWR	10040-440
0.2µm sterile 250 mL filter units	VWR	10040-464
0.2µm sterile 500 mL filter units	VWR	10040-436
10mL syringe Luer-Lok Tip	Becton Dickinson	302995
12 well tissue culture treated plate	Corning	3513
15 mL conical Tubes	VWR	89039-668
16% paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Science	15710
2mL aspirating pipette	VWR	414004-265
310 direct heat CO2 incubator	Forma Scientific	13-998-082	Set to 37°C, 6% CO2
50 mL conical tubes	VWR	89039-660
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU)	Thermo Scientific	C10337
5mL, 10mL, 25mL and 50mL serological pipettes	VWR	89130-896, -898,  -900, -902
6 well tissue culture treated plate	Corning	3516
70% ethanol	BDH	BDH1164-4LP
Alexa Fluor 488 azide	Thermo Scientific	A10266
Alizarin Red S	Sigma	A5533-25G
Analytical balance	Sartorious	R200D
Antibiotic & Antimycotic 100x (anti-anti)	Thermo Scientific	15240-062
Anti-magnetic stainless steel forceps	Excelta	7-SA
Bottle top dispenser	Ward's Science	470134-946
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP9700-100
Calcium chloride (CaCl)	Amresco	1B1110-500G
Chex-all II sterilzation pouches	Propperman	24008
Cirpofloxacin hydrochloride	Alfa Aesar	J61970
Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4)	Sigma	469130-50g
Dissecting microscope	Nikon	SMZ1270
Dry vacuum pump	Welch	2019B-01
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Scientific	A31606-01
Frosted micro slides	VWR	48311-703
Galaxy miniStar microcentrifuge	VWR	C1413, VWR
Goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor Plus 555	Thermo Scientific	A32727
Goat serum	Sigma	G9023
Haemo-Sol detergent	Haemo-Sol International LLC	026-050
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate	Thermo Scientific	H3570
Hot plate/stirrer	Corning	PC-320
Human corneas	Lions Eye Institute for Transplant and Research, Advancing Sight Network, Eversight Eye Bank, Lions Vision Gift, and Georgia Eye Bank	NA
Hydrochloric acid (HCl)	BDH	BDH7204
ImageJ	National Institute of Health	Version 1.52a
Infinity 3s microscopy camera	Lumenera	1URCAP2
Infinity analyze software	Lumenera	Version 6.5.5
Insulin transferrin selenium (ITS)	Corning	41400-045
Iris scissors, 11 cm	World Precision Instruments	501264-G
L- Ascorbic acid	Sigma	A4544-25G
Manual single channel pipet	Rainin	17014-392, -391, -382
Needle PrecisionGlide 30G	Becton Dickinson	305106
N-Met141 TTHX1114	Biopharmaceutical Development Program	NA
Opti-Mem I + GlutaMAX-1 (Opti-MEM)	Thermo Scientific	51985-034
Orion Star A211 pH meter	Thermo Scientific	STARA211
Petri dishes	VWR	89107-632
Potassium chloride (KCl)	BDH	BDH9258-500G
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	VWR	0781-500G
Powerpette plus pipet controller	VWR	75856-456
Precision water bath 188	Precision Scientific Incorporated	WB05	Set to 37°C
Purifier Class II model biosafety cabinet	Labconco	36213043726
Safe-Lock tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22363212
Scalpel size 22 stainless steel	Sklar	446479
Sodium chloride (NaCl)	VWR	2041-2.5K
Sodium hosphate dibasic (Na2HPO4)	VWR	0404-1KG
Standard shaker	VWR	89032-092
Standard solid refrigerator	VWR	10820-402	Set to 4°C
Sterilmatic autoclave	Market Forge	STM-EL
Syringe filters	VWR	28145-477
Test tube rocker	Thermo Scientific	M48725Q
Tru-Punch disposable biopsy punch, 4 mm	Sklar	96-1146
Trypan Blue	Thermo Scientific	15250-061
Tween-20	Sigma	P7949-100mL
Vibrance antifade mounting medium with DAPI	Vector Laboratories Inc.	H-1800
VistaVision cover glasses, no. 1	VWR	16004-098
Vortex Genie 2	Fisher Scientific	G-560
ZO-1 monoclonal antibody (ZO1-1A12)	Thermo Scientific	33-9100