Un modello di coltura di organi corneali umani dello stripping di Descemet solo con guarigione accelerata stimolata dal fattore di crescita dei fibroblasti ingegnerizzato 1

Riepilogo

Descemet's Stripping Only è una procedura sperimentale in cui i pazienti con guttae corneale centrale derivanti dalla distrofia corneale endoteliale di Fuchs hanno la membrana di Descemet spogliata per le cellule periferiche per rigenerare lo strato endoteliale. Presentiamo una nuova metodologia che simula il DSO nelle cornee umane distrofiche ex vivo con guarigione accelerata stimolata da eFGF1 (NM141).

Abstract

La distrofia corneale endoteliale di Fuchs (FECD) deriva da cellule endoteliali corneali disfunzionali (CEC) ed è attualmente trattata mediante trapianto dell'intera cornea o della membrana di Descemet. I recenti sviluppi nella chirurgia oculare hanno stabilito lo Stripping Only (DSO) di Descemet, una tecnica chirurgica in cui viene rimosso un cerchio centrale della membrana di Descemet densa di guttae per consentire la migrazione dei CEC sullo stroma liscio, ripristinando la funzione e la visione della cornea. Mentre questa potenziale opzione di trattamento è di grande interesse nel campo della ricerca oftalmica, non sono stati stabiliti modelli ex vivo di successo di DSO e i dati clinici sono limitati. Questo lavoro presenta un nuovo modello di guarigione delle ferite che simula il DSO nelle cornee dei donatori umani. Utilizzando questo approccio per valutare l'efficacia dell'FGF1 (NM141) ingegnerizzato nell'uomo, abbiamo scoperto che il trattamento ha accelerato la guarigione attraverso la stimolazione della migrazione e della proliferazione dei CEC. Questo risultato è stato confermato in 11 paia di cornee umane con segni di distrofia riportati dalle banche oculari al fine di verificare che questi risultati possano essere replicati in pazienti con distrofia di Fuchs, come popolazione target della procedura DSO.

Introduzione

La distrofia corneale endoteliale di Fuchs (FECD) è una malattia caratterizzata dalla perdita della funzione della pompa nelle cellule endoteliali corneali (CEC) e dall'eccessivo accumulo di collagene e altre proteine della matrice extracellulare sulla superficie della membrana di Descemet, formando gutte^{corneali 1}. L'unico trattamento noto per la FECD è la cheratoplastica endoteliale in varie forme, tutte con rischio di rigetto e perdita di cellule endoteliali². Mentre i progressi nella chirurgia oftalmica hanno permesso a queste procedure di diventare meno invasive nel tempo, qualsiasi forma di trapianto comporta il rischio di rigetto e la possibilità di uso di steroidi per tutta la vita, un trattamento con i suoi eventi avversi concomitanti. Inoltre, la carenza globale di tessuto del donatore è tale che è disponibile una sola cornea donatrice ogni 70 pazienti che ne hanno bisogno³. Date queste sfide, ricercatori e medici stanno esplorando metodi chirurgici che evitano del tutto la necessità di tessuto donatore. Una di queste tecniche sperimentali è descemet's Stripping Only (DSO) o Descemetorhexis without Endothelial Keratoplasty (DWEK), in cui i pazienti fecd con guttae localizzate al centro della cornea hanno un cerchio centrale di 4 mm della membrana di Descemet spogliato senza posizionamento dell'innesto. La rimozione delle guttae incoraggia le cellule periferiche sane a migrare verso l'interno e riformare il monostrato endoteliale, invertendo infine l'edema stromale e migliorando la visione. Il concetto è stato originariamente descritto in una serie di casi di studio in cui i pazienti sono stati sottoposti a un intervento chirurgico complicato dal distacco della membrana di Descemet, ma il ripopolamento della CEC si è verificato ancora 4,5,6,7. Sebbene ci siano molti vantaggi in questo metodo, il processo di guarigione è lungo e incoerente, poiché alcuni pazienti richiedono un trapianto di salvataggio se non si vede alcuna guarigione nei mesi successivi all'intervento^{chirurgico 8}. Per questi motivi, un farmaco che stimola una migrazione e una proliferazione più rapide dei CEC può essere utile nel processo di recupero dei pazienti con FECD che hanno subito DSO.

Diversi studi recenti hanno valutato gli inibitori rock come trattamento supplementare per i pazienti sottoposti a DSO e hanno scoperto che i pazienti trattati si sono ripresi più velocemente e avevano densità di cellule endoteliali centrali (ECD) più elevate rispetto a quelli del solo gruppo DSO ^9,10,11. Tuttavia, a causa delle piccole dimensioni del campione e delle differenze tra i regimi di dosaggio, sono necessari ulteriori dati per comprendere meglio l'efficacia degli inibitori ROCK in questo contesto.

I fattori di crescita dei fibroblasti hanno anche dimostrato di stimolare la rigenerazione dell'endotelio corneale sia in vitro con CEC bovini, sia in vivo nelle cornee feline^12,13. eFGF1 (NM141) è una versione ingegnerizzata di FGF-1 contenente diverse sostituzioni di aminoacidi per stabilizzare la molecola, al contrario del nativo FGF-1, che ha un'emivita molto più breve^14,15. In precedenza abbiamo dimostrato la capacità di eFGF1 (NM141) di stimolare la proliferazione di CEC ex vivo nelle cornee umane squartate¹⁶. Questo studio ha cercato di migliorare questo lavoro stabilendo il primo modello ex vivo di successo di DSO in cornee sia normali che distrofiche per determinare se i trattamenti aggiuntivi come eFGF1 (NM141) accelerano la guarigione in questa applicazione.

Protocollo

Questo lavoro ha utilizzato campioni esistenti senza identificazione dei soggetti ed è esente dall'approvazione IRB ai sensi del 45 CFR 46.101 (b) (4).

Le cornee di donatori umani sono state ottenute da varie banche oculari negli Stati Uniti (vedi Tabella dei materiali). Le cornee sono state giudicate individualmente distrofiche dalle banche oculari sulla base di risultati come guttae, pleomorfismo, polimegatismo e / o basso ECD su valutazione speculare. La Figura 1 presenta la colorazione Trypan Blue nella cornea durante la creazione della ferita, immediatamente dopo lo stripping e dopo 2 settimane in coltura.

Figura 1: Diagramma che rappresenta la cornea durante la creazione della ferita, immediatamente dopo lo stripping e dopo 14 giorni in coltura come visualizzato da Trypan Blue. La riduzione dell'area macchiata tra questi punti temporali è stata misurata per determinare il livello di guarigione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Creazione della ferita

1. Utilizzando una pinza sterile, rimuovere la cornea dal supporto e risciacquare in 1x PBS per rimuovere i residui e i detriti cellulari. Dopo il risciacquo, posizionare il lato endoteliale della cornea sul coperchio di una capsula di Petri.
2. Pipettare 30 μL di Trypan Blue in un piatto ben sagomato. Immergere un nuovo punzone per biopsia da 4 mm in Trypan Blue e toccare l'eccesso.
3. Usando entrambe le mani, posizionare il pugno sopra il centro della cornea e abbassarlo direttamente sulla superficie endoteliale, applicando una pressione minima.
4. Senza cambiare la posizione o la pressione sulla cornea, spostare il pugno su una mano e raggiungere la pinza con la mano appena liberata. Utilizzare la pinza per tenere la cornea in posizione mentre si torce delicatamente il pugno della biopsia di circa 90 ° avanti e indietro più volte.
5. Sollevare il pugno direttamente dalla cornea e metterlo da parte.
6. Risciacquare ancora una volta in 1x PBS per rimuovere l'eccesso di Trypan Blue.

2. Lo stripping di Descemet

1. Trasferire la cornea su un coperchio della capsula di Petri in un ambito di dissezione.
   NOTA: Non lasciare la cornea asciutta più di 5 minuti. Se è necessario più tempo per completare il processo, risciacquare nuovamente in 1x PBS per reidratare l'endotelio.
2. Tenendo la cornea in posizione con una pinza curva, segna la membrana di Descemet trascinando leggermente la punta di un ago affilato da 30 G lungo l'anello di Trypan Blue lasciato dal pugno della biopsia. Utilizzare una pressione minima per evitare di interrompere lo stroma sottostante.
3. Con un gancio Sinskey, utilizzare delicati movimenti di scooping per sollevare e staccare la membrana di Descemet attorno al bordo della ferita, lavorando verso il centro della lesione.
   NOTA: la membrana di Descemet dovrebbe avere pochissima resistenza. Se si verificano difficoltà, è probabile che si tiri su lo stroma. Se ciò accade, ricominciare, sollevando da un nuovo punto lungo il bordo della ferita.
4. Una volta che la maggior parte della membrana di Descemet è stata separata dallo stroma, utilizzare una pinza di Gorovoy per rimuovere la membrana e metterla da parte.
5. Esaminare l'area spogliata per eventuali pezzi rimanenti di membrana e rimuovere con pinza Gorovoy.

3. Colorazione blu trypan

NOTA: Dopo lo stripping di Descemet, macchiare la cornea con Trypan Blue per visualizzare l'area della ferita.

1. Riportare la cornea su un coperchio della capsula di Petri nell'armadio di biosicurezza e risciacquare in 1x PBS contenente lo 0,01% (p/v) di CaCl₂ e MgCl₂ per rimuovere i detriti cellulari e facilitare la stretta aderenza dei CEC rimanenti alla membrana intatta di Descemet.
2. Posizionare la cornea in un piatto dolato e pipettare 30 μL di Trypan Blue sullo strato endoteliale per 30 s.
   1. Utilizzare una pinza per scuotere delicatamente la cornea per garantire che l'intera superficie endoteliale sia coperta.
3. Risciacquare l'eccesso di Trypan Blue in 1x PBS con 0,01% (p/v) CaCl₂ e MgCl₂ e visualizzare la cornea colorata al microscopio sezionante per il timepoint Day 0.
   1. Assicurati che la cornea sia bilanciata in modo tale che la luce sia trasmessa uniformemente in tutto e che il posizionamento sia replicabile attraverso i punti temporali.
      NOTA: La pinza può essere utilizzata per tenere la cornea in posizione durante l'imaging, se necessario.

4. Periodo culturale

1. Coltura di cornee in una piastra a sei pozzetti contenente mezzi sierici a basso contenuto di OptiMEM; 1x insulina, transferrina e selenio; 1x antibiotico/antimicotico; 0,02 mg/mL CaCl₂; 0,2 mg/ml di acido ascorbico; e 0,8% di siero bovino fetale inattivato dal calore. Coltivare la cornea sinistra in 8 mL di soli mezzi sierici bassi e la cornea destra in 8 mL di mezzi sierici bassi integrati con 100 ng/mL di eFGF1 (NM141).
   1. Incubare a 37 °C con il 6% di CO₂ per 14 giorni con cambi giornalieri dei fluidi.
2. Ripetere la procedura di colorazione Trypan Blue nei giorni 3, 6, 9, 12 e 14 e visualizzare ogni cornea immediatamente dopo la colorazione. Assicurati di mantenere le impostazioni della fotocamera coerenti su tutti i punti temporali.
3. Il giorno 12, aggiungere 10 μM EdU sia al supporto di controllo che a quello integrato con eFGF1 (NM141) e incubare per 48 ore per etichettare le cellule proliferanti. Rinnova i media con EdU aggiunto di nuovo il giorno 13.
4. Il giorno 14, 48 ore dopo l'aggiunta di EdU, la macchia di Trypan e le cornee di immagine come al solito, tranne invece di 1x PBS con CaCl₂ e MgCl₂, utilizzare 1x PBS semplice per i risciacqui per evitare che il calcio interagisca con la macchia rossa di Alizarin.

5. Colorazione alizarina rossa

1. Il giorno 14, preparare il 5% di Alizarin Red in soluzione salina allo 0,9%.
   NOTA: Alizarin Red non si dissolve completamente in soluzione salina. Dopo la combinazione, soluzione di vortice e roccia per almeno 1 ora. Vortice ancora una volta e filtrare prima dell'uso per rimuovere le particelle non disciolte.
2. Una volta completata la colorazione e l'imaging di Trypan, trasferire le cornee in un piatto smussato e aggiungere 200 μL di Alizarin Red alla superficie endoteliale di ciascuna cornea.
   1. Macchiare per 2 minuti, quindi risciacquare ogni cornea in una capsula di Petri da 1x PBS per rimuovere l'eccesso di Alizarin Red prima di metterlo in una piastra a sei pozzetti pre-riempita con 8 mL di 1x PBS per due lavaggi di 5 minuti.
3. Dopo il secondo lavaggio, visualizzare l'area spogliata di ciascuna cornea al microscopio sezionante.
   NOTA: A differenza dell'imaging Trypan, le cornee possono essere lasciate in 1x PBS per visualizzare la colorazione di Alizarin per evitare che si secchino durante il processo.

6. Fissazione e permeabilizzazione

1. Una volta che le immagini di Alizarin sono state catturate, trasferire le cornee su una piastra a 12 pozzetti e lavare in 4 ml di PBS 1x contenente lo 0,05% di Tween-20 (PBS-T) per 30 minuti per rimuovere eventuali particelle dal tessuto prima della fissazione.
2. Fissare le cornee in 4 ml di PFA al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente.
3. Permeabilizzare le cellule per 5 minuti in 4 mL di 1x PBS contenente l'1% di Triton X-100, quindi lavare tre volte in 4 mL di semplice 1x PBS per 30 minuti ciascuna.

7. Immunoistochimica

1. Bloccare le cornee per 1 ora a 37°C in 4 mL di 1x PBS contenente il 2% di albumina sierica bovina e il 2% di siero di capra.
2. Incubare in 1 mL di soluzione bloccante contenente 2,5 μg/mL di anticorpo primario anti-ZO-1 per 1 ora a 37°C, quindi lavare tre volte in 4 mL di 1x PBS per 30 minuti ciascuno.
   NOTA: La piastra può essere inclinata durante la colorazione degli anticorpi per ridurre al minimo il volume di reagenti necessari. Basta assicurarsi che l'intera cornea sia completamente immersa in soluzione anticorpale.
3. Eseguire la reazione EdU Click-iT utilizzando un cocktail contenente 0,88 mg/mL di acido ascorbico, 0,26 mg/mL di CuSO₄ e 2,5 μM di Alexa Fluor 488 azide.
   1. Preparare i componenti di reazione
      1. Aggiungere 500 μL di 1x PBS a 88 mg di acido ascorbico e vortice fino a dissoluzione.
      2. Aggiungere 840 μL di acqua deionizzata a 44 mg di CuSO₄ e vortice fino a quando non si scioglie.
   2. Preparare il cocktail aggiungendo i seguenti reagenti a 6 mL di 1x PBS in questo ordine, invertendo il tubo da miscelare dopo ogni aggiunta: 30 μL di soluzione di acido ascorbico, 30 μL di soluzione di CuSO₄ e quindi 15 μL di Alexa Fluor 488
      NOTA: Una volta preparata, questa soluzione è sensibile alla luce. Per il resto del protocollo, le cornee devono essere protette dalla luce quando possibile.
   3. Aggiungere 1 mL di cocktail di reazione EdU a ciascuna cornea e reagire per 1 ora a temperatura ambiente.
4. Aggiungere 4 mL di 10 μg/mL Hoechst 33342 a ciascuna cornea e reagire per 2 minuti a temperatura ambiente, quindi lavare tre volte in 1x PBS-T per 30 minuti ciascuno.
5. Incubare in 1 mL di soluzione bloccante contenente 2 μg/mL Alexa Fluor 555 IgG anti-topo di capra etichettati per 1 ora a 37°C, quindi lavare tre volte in 1x PBS-T per 30 minuti ciascuno.
6. Conservare le cornee a 4 °C in 4 mL di 1x PBS con 1% anti/anti, 0,1% ciprofloxacina e 0,1% amfotericina B per prevenire la crescita microbica.
7. Quando si esegue l'imaging confocale, montare intere cornee in 200 μL di terreno di montaggio su vetrini di vetro con coperchio fissato per appiattire.

8. Analisi delle immagini trypan

1. Esegui tutte le analisi delle immagini utilizzando il software open source ImageJ di NIH. Aprire un'immagine utilizzando File > Apri e fare clic su Immagine > Regola > soglia colore.
2. Usa i cursori "Tonalità" per comprendere solo l'intervallo blu e regola il cursore "Luminosità" superiore fino in fondo a sinistra per includere più dell'area macchiata.
   NOTA: se questa azione fa sì che vengano incluse parti dell'immagine che non sono macchiate di Trypan, il dispositivo di scorrimento "Luminosità" può essere riportato al livello originale.
3. Regolare lentamente il cursore superiore "Saturazione" fino a quando la soglia delinea accuratamente l'area macchiata.
   NOTA: è utile avere una copia dell'immagine originale aperta a cui fare riferimento durante questo processo.
4. Fate clic sul pulsante Seleziona nel menu della soglia colore, quindi utilizzate lo strumento pennello di selezione per deselezionare le aree esterne alla ferita che sono state raccolte.
5. Fare clic su Analizza > Misura per segnalare l'area macchiata in pixel.
6. Deseleziona tutto utilizzando Modifica > selezione > Seleziona nessuno e utilizza lo strumento di selezione ovale per adattare il limbus il più vicino possibile, quindi fai clic su Analizza > misura per segnalare l'area della cornea in pixel.
   NOTA: la luminosità può essere aumentata temporaneamente per facilitare la visualizzazione del limbus se questa parte dell'immagine è troppo scura.
7. Registrare i valori dell'area e dividere l'area macchiata per l'area dell'intera cornea, quindi moltiplicare per 100 per calcolare la percentuale di macchie.
8. Ripeti questo processo altre due volte per ogni immagine, quindi prendi la media delle tre misurazioni.

9. Analisi statistica

1. Una volta che tutte le immagini sono state analizzate, dividi la percentuale media macchiata il giorno 14 per la percentuale macchiata il giorno 0 per determinare l'area residua non guarita. Sottrarre questa quantità dal 100% per calcolare la percentuale dell'area spogliata guarita in 14 giorni.
2. Utilizzare un t-test accoppiato per confrontare i valori di guarigione percentuale tra i gruppi di controllo e di trattamento.

Risultati

Questo esperimento è stato inizialmente eseguito in 10 paia di cornee normali di ricerca, in quanto sono più facilmente disponibili. Una volta che il metodo ha dimostrato di avere successo, lo studio è stato replicato in 11 coppie di cornee distrofiche - etichettate come tali da banche oculari basate su una valutazione speculare - per studiare gli effetti di eFGF1 (NM141) in cornee rappresentative della popolazione di pazienti FECD. Per una maggiore rilevanza clinica, le cifre incluse nel presente lavoro rappresentano i dati raccolti dalle cornee distrofiche, se non diversamente specificato.

Dopo aver simulato l'esito chirurgico del DSO, la colorazione Trypan Blue è stata eseguita e ripetuta per tutto il periodo di coltura di 14 giorni e la riduzione della colorazione positiva è stata quantificata per valutare la guarigione delle ferite (Figura 2). La colorazione alizarin Red è stata eseguita anche il giorno 14 per delineare i confini cellulari. Le aree rosso scuro senza un chiaro motivo visibile (di seguito denominata colorazione negativa) apparivano costantemente all'interno della sezione non guarita della lesione e in altre aree della cornea in cui si presumeva che le cellule fossero danneggiate o mancanti. Le aree che si sono macchiate positive per Trypan Blue il giorno 14 corrispondevano bene alla colorazione negativa di Alizarin Red (Figura 2). Tutte le cornee distrofiche trattate con eFGF1 (NM141) hanno mostrato una maggiore guarigione il giorno 14 rispetto al compagno non trattato. In media, le cornee trattate hanno dimostrato una guarigione del 91% rispetto al 38% nelle cornee di controllo, e questa differenza era statisticamente significativa (p < 0,001) (Figura 3A). Questo è paragonabile ai risultati ottenuti da 20 cornee normali, dove i controlli hanno mostrato una media del 32% di guarigione e le cornee trattate hanno raggiunto l'81%, che di nuovo era statisticamente significativo (p < 0,001) (Figura supplementare 1). La percentuale guarita è stata confrontata tra cornee normali e distrofiche utilizzando due t-test su campione assumendo la stessa varianza, e nessuna differenza significativa è stata osservata né nei gruppi di controllo né in quelli di trattamento (dati non mostrati).

Le informazioni sui donatori fornite dalle banche oculari (Tabella 1) per le cornee normali e distrofiche sono state analizzate per determinare se le caratteristiche tra cui l'età, i giorni memorizzati in Optisol, l'intervallo da morte a raccolta, la densità cellulare e il sesso sono correlate alla guarigione. Il coefficiente di correlazione di Pearson (r) è stato utilizzato per indagare su tutti i fattori tranne il sesso, che è stato valutato utilizzando un t-test spaiato per confrontare la guarigione tra maschi e femmine. Il valore assoluto di r era inferiore a 0,25 in tutti i casi, indicando che eventuali correlazioni tra guarigione ed età, giorni memorizzati in Optisol, intervallo da morte a raccolta o densità cellulare erano considerate trascurabili. La differenza nella guarigione tra maschi e femmine non era statisticamente significativa (p = 0,53).

Simile al normale set di dati, 10 delle 22 cornee distrofiche presentavano una notevole colorazione di Trypan al di fuori dell'area spogliata collegata all'area macchiata all'interno della lesione in almeno un timepoint (di solito il giorno 3) - un'osservazione che abbiamo definito colorazione periferica (Figura 4A). Di questi 10, solo due erano cornee di controllo le cui controparti trattate non mostravano lo stesso effetto. Le restanti otto erano tutte coppie abbinate e presentate con gravità simile tra le cornee dello stesso individuo. Sebbene i modelli di colorazione fossero comparabili tra cornee normali e distrofiche, la frequenza della colorazione periferica era più alta nel set di dati distrofici con il 45% delle cornee positive, rispetto al 25% nel gruppo normale. La Figura 4A mostra una coppia che è stata considerata positiva per la colorazione periferica, poiché l'area macchiata al di fuori della lesione ha incontrato il bordo della ferita nelle immagini del Giorno 6 e gradualmente si è ritirata. Nelle corrispondenti immagini di Alizarin Red, le cellule nelle aree con colorazione periferica di Trypan apparivano ingrandite e di forma anormale, proprio come le cellule che migravano nell'area spogliata, e la colorazione negativa era correlata alle aree in cui il Trypan Blue era presente il giorno 14. Nonostante l'ampia porzione della cornea colpita durante tutto il periodo di coltura, la pulizia parziale o completa della periferia macchiata si è verificata in tutte e 10 le cornee. Inoltre, l'ultima percentuale guarita al giorno 14 era all'interno del range normale, rispettivamente al gruppo di trattamento, per tutti tranne una cornea. L'outlier (0811L, nella foto in Figura 4A) ha restituito un valore di guarigione percentuale negativo a causa dei resti di colorazione periferica ancora collegata all'area della lesione al giorno 14 (Figura 3A e Figura 4A). Un secondo modello di colorazione, indicato come colorazione periferica, è stato catturato nelle immagini di Alizarin Red dalla Figura 4B, ma è stato anche evidente nelle immagini di Trypan Blue durante il periodo di coltura in molte cornee (Figura 4B). Questa osservazione è caratterizzata da un anello di colorazione scura attorno al limbus, che indica un endotelio compromesso. Nonostante il termine, questo modello era così comune sia nelle cornee normali che in quelle distrofiche che non venivano conteggiate come positive per la colorazione periferica. In queste immagini, la cornea di controllo ha mostrato una colorazione più vibrante ed estesa il giorno 14, nonostante entrambe le cornee possedessero una gravità e un modello di colorazione simili all'inizio del periodo di coltura. Nella cornea trattata è stato anche notato un numero apparentemente maggiore di cellule, che apparivano più compatte ed esagonali rispetto al controllo, sebbene queste osservazioni non fossero misurate quantitativamente. A causa della curvatura nella periferia, solo la colorazione di Trypan all'interno e immediatamente circostante l'area spogliata è stata inclusa nell'analisi quantitativa. Quando i valori di colorazione percentuale sono stati mediati su tutte le cornee distrofiche, l'emergere della colorazione periferica ha comportato un aumento iniziale rispetto a quello del giorno 0, al contrario della costante diminuzione osservata nelle cornee normali in cui la colorazione periferica era meno prevalente (Figura 3B).

L'immunoistochimica visualizzata dall'imaging confocale rivela l'espressione semi-organizzata di ZO-1, un marcatore funzionale delle giunzioni strette cec, dentro e intorno al bordo della lesione (Figura 5), un modello evidenziato in modo simile dalla colorazione alizarina rossa (Figura 2 e Figura 4). Il pleomorfismo e il polimegatismo sono visibili da ZO-1 nella maggior parte delle cornee distrofiche; tuttavia, questa osservazione può essere attribuita al loro stato malato ed è stata notata dalla banca degli occhi dopo l'esame speculare delle cornee prima della coltura. L'espressione disorganizzata di ZO-1 si osserva all'interno dell'area della lesione delle cornee trattate in cui le cellule erano migrate verso l'interno, anche in linea con i modelli di Alizarin Red. Le cellule che incorporano EdU possono essere viste intorno al bordo della lesione e all'interno dell'area lesionata nelle cornee controllate e trattate (Figura 5). Il modello dei CEC migrati riflette anche i risultati di Trypan Blue, dove nelle cornee di controllo la maggior parte delle cellule sono state trovate all'interno di due campi del bordo della lesione, mentre i CEC nelle cornee trattate possono essere visti in tutta l'area spogliata (Figura 2).

L'etichettatura EdU è stata eseguita come misura qualitativa in questo studio per confermare che la proliferazione ha contribuito alla guarigione. Tuttavia, la quantificazione delle cellule che incorporano EdU non può essere eseguita sistematicamente a causa del gonfiore corneale che impedisce la cattura di immagini coerenti e replicabili all'interno e intorno alla lesione. Come surrogato, l'analisi quantitativa eseguita in uno studio condotto prima della creazione del modello DSO è stata inclusa per dimostrare gli effetti di eFGF-1 (NM141) sulla proliferazione (Figura 6). Le cornee normali dei donatori umani sono state tagliate in quarti usando un bisturi e coltivate in presenza di EdU, con o senza eFGF1 (NM141) per 48 ore come descritto in precedenza (Eveleth, 2020)¹⁶. L'imaging e la successiva analisi delle cellule marcate con Hoechst 33342 e EdU sono state eseguite separatamente nella zona centrale indisturbata dei quarti e nella zona del bordo, all'interno di tre campi da cui è stata tagliata la cornea. Nella zona media, la percentuale di cellule che incorporavano EdU era bassa e altamente variabile tra le 10 cornee analizzate. In media, i trimestri trattati con eFGF1 (NM141) hanno avuto livelli più elevati di incorporazione di EdU nella zona centrale (4,1% ± 7,9%) rispetto ai controlli (1,8% ± 2,9%), sebbene questa differenza non fosse statisticamente significativa (p = 0,239). Sul bordo della ferita, i quarti trattati stimolati con eFGF1 (NM141) hanno mostrato tassi significativamente più elevati di incorporazione di EdU in media (18,1% ± 11,5%) rispetto ai trimestri di controllo (10% ± 9,6%, p = 0,012).

Tabella 1: Informazioni sul donatore per 22 cornee distrofiche e 20 cornee normali utilizzate in questo studio, nonché 10 cornee normali utilizzate in precedenza per la quantificazione dell'EdU. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Figura 2: Colorazione del colorante vitale delle cornee dopo lo stripping di Descemet. Le cornee umane distrofiche sono state spogliate dei 4 mm centrali della membrana di Descemet e incubate con o senza eFGF1 (NM141) (100 ng/mL) per 14 giorni. Le lesioni sono state visualizzate dalla colorazione Trypan Blue nei giorni 0, 3, 6, 9, 12 e 14. I confini della CEC sono stati visualizzati dalla colorazione alizarina rossa il giorno 14. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Le cornee umane distrofiche mostrano una guarigione significativamente maggiore da DSO quando coltivate con eFGF1 (NM141). (A) La percentuale di guarigione è stata determinata misurando l'area macchiata al giorno 14 usando ImageJ e confrontandola con la percentuale macchiata al giorno 0. (B) La percentuale media di macchie figurate nel tempo mostra una diminuzione consistente delle cornee normali mentre raggiunge il picco al giorno 3 delle cornee distrofiche a causa della maggiore prevalenza di colorazione periferica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Colorazione del colorante vitale delle cornee distrofiche con colorazione periferica. (A) La colorazione di Trypan della membrana di Descemet intatta può essere vista avanzare verso il centro, quindi schiarirsi nel tempo sia nelle cornee di controllo che in quelle trattate. (B) I pattern di alizarina intorno al limbus rappresentano una tipica osservazione del danno periferico e del ristabilimento disorganizzato dell'endotelio osservato in molte cornee da donatore, in questo caso distrofiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Stimolazione della migrazione e della proliferazione dei CEC da parte di eFGF1 (NM141) nelle cornee distrofiche spogliate. Micrografie confocali delle cornee spogliate di Descemet colorate per ZO-1 (rosso), EdU (verde) e Hoechst 33342 (blu). La linea tratteggiata rappresenta il bordo della lesione con l'area spogliata sul lato sinistro dell'immagine e la membrana di Descemet intatta sulla destra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Quantificazione di cellule proliferanti da cornee normali squartate con un bisturi e incubate in mezzi contenenti EdU con o senza eFGF-1 (NM141) per 48 ore. I quarti sono stati ripresi in triplice copia nella zona centrale indisturbata e lungo il bordo tagliato, e i conteggi sono stati calcolati in media per determinare la percentuale di cellule che incorporano EdU nelle zone intermedie e di bordo. Figura modificata dal Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, utilizzata con il permesso¹⁶. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Le cornee umane normali mostrano una guarigione significativamente maggiore da DSO quando coltivate con eFGF1 (NM141). ImageJ è stato utilizzato per misurare le aree macchiate e determinare la percentuale di guarigione. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

Molti oftalmologi hanno preoccupazioni nel raccomandare DSO ai loro pazienti per due motivi principali: 1) il lungo processo di guarigione e 2) mancanza di dati (DSO è un nuovo concetto nel campo della chirurgia oftalmica). La ricerca che abbiamo presentato sarebbe di grande utilità per alleviare entrambe queste preoccupazioni. Sulla base dei dati di questo studio e di altri, la FDA ha approvato uno studio clinico di fase 2 in cui eFGF1 (NM141) sarà somministrato a diversi schemi di dosaggio ai pazienti sottoposti a DSO¹⁷.

Il metodo sopra descritto è stato modellato su uno studio condotto da Soh et al., in cui la guarigione endoteliale corneale è stata valutata con e senza l'inibitore ROCK Y-27632 in ferite graffiate e sbucciate¹⁸. Mentre Y-27632 ha accelerato la rigenerazione endoteliale con la membrana di Descemet ancora intatta, nessuna guarigione sostanziale è stata trovata nelle ferite spogliate anche con il trattamento. Utilizzando una tecnica di stripping simile seguita da un trattamento con o senza eFGF1 (NM141), le osservazioni che abbiamo trovato non erano coerenti con quelle di Soh e colleghi. L'assenza di colorazione Trypan Blue in molte cornee trattate al giorno 14 e la presenza di giunzioni strette positive ZO-1 all'interno dello strato endoteliale riformato sostengono che una barriera intatta, parte della funzione naturale del CEC, è stata ripristinata sia nelle cornee normali che in quelle distrofiche. Sebbene non quantificata in questo studio, la presenza di cellule EdU-positive all'interno e intorno all'area spogliata suggerisce anche la proliferazione come meccanismo di guarigione, uno che abbiamo precedentemente stabilito può essere stimolato da eFGF1 (NM141) nelle cornee ferite¹⁶. L'analisi statistica ha mostrato che il trattamento con eFGF1 (NM141) ha portato a una guarigione significativamente maggiore da DSO, in media oltre il doppio delle cornee di controllo al timepoint di 14 giorni. Sebbene i tassi di guarigione varino moderatamente tra gli individui, una caratteristica tipica delle cornee dei donatori, la replicabilità dei risultati su campioni di grandi dimensioni evidenzia anche un metodo altamente misurabile. Per quanto ne sappiamo, non ci sono altri esempi di un modello di stripping di Descemet ex vivo in letteratura.

I componenti chiave del protocollo stesso che servirebbero preziosi per altri ricercatori che studiano DSO sono l'uso di Trypan Blue per rilevare lo stroma nudo e la tecnica di elaborazione delle immagini utilizzata per misurare l'area macchiata. Trypan Blue è comunemente usato in chirurgia oftalmica, in particolare quando si lavora con la membrana di Descemet per rilevare cellule non vitali e aiutare nella visibilità del tessuto. I timepoint di colorazione inclusi in questo protocollo hanno permesso un'efficace colorazione ripetuta senza sovraesporre le cornee al Trypan Blue, poiché ha dimostrato di essere tossico per i CEC ad alte concentrazioni¹⁹. La riduzione dell'area macchiata nell'arco di 14 giorni in tutte le cornee, confermata da Alizarin Red e dall'immunoistochimica come risultato di CEC migrati, dimostra un metodo semplice e riproducibile per misurare la guarigione. Utilizzando il menu della soglia di colore di ImageJ, più analisti hanno raccolto dati con deviazioni standard costantemente inferiori all'1% (dati non mostrati). Sebbene i programmi alternativi possano funzionare in modo simile, ImageJ è un software open source in grado di produrre misurazioni accurate dell'area per monitorare la guarigione.

C'è, tuttavia, un aspetto del protocollo di stripping che abbiamo trovato essere sia necessario per la creazione della ferita, ma ostruttivo per il processo di guarigione complessivo. L'uso di un ago affilato da 30 G per segnare la membrana di Descemet lungo il segno lasciato dal pugno della biopsia consente la creazione di una ferita circolare liscia che viene notata dai medici per supportare una guarigione più rapida¹⁰. Allo stesso tempo, questo passaggio è dannoso per la cornea, in quanto può creare lacrime nelle fibre stromali causando la morte delle cellule stromali, impedendo la migrazione delle cellule endoteliali attraverso il bordo della ferita e inducendo la formazione di noduli che si traducono in un edema post-operatorio più persistente²⁰. I medici che eseguono DSO in genere utilizzano un gancio Sinskey inverso per avviare la ferita, ma senza alcuna pressione intraoculare che mantenga la cornea tesa, questo strumento è meno efficace nel modello ex vivo . Uno strumento alternativo in grado di strappare la membrana di Descemet senza danneggiare lo stroma sottostante migliorerebbe il protocollo, ad esempio il manipolo di irrigazione e aspirazione raccomandato da Macsai e Shiloach¹⁰. Saranno necessarie ulteriori sperimentazioni per determinare se questa tecnica è compatibile con il modello ex vivo .

Una sfida che appare inerente al modello ex vivo è il frequente verificarsi di morte della CEC nell'area periferica della ferita, in particolare nelle cornee distrofiche. Questa quantificazione occasionalmente oscurata dell'area della ferita, poiché la precisione dello strumento di soglia del colore diventa più limitata poiché l'area macchiata si estende oltre il centro della cornea dove la sua curvatura si traduce in una distribuzione della luce irregolare. Tuttavia, queste misurazioni variabili si sono verificate principalmente in punti temporali precedenti prima che la colorazione periferica si ritirasse gradualmente quando i CEC danneggiati si sono eliminati e le cellule vicine si sono allungate, migrate o proliferate per sostituirle. Entro l'ultimo timepoint di 14 giorni, l'area macchiata era localizzata al centro della cornea e tutte le immagini erano misurabili. Un'osservazione simile è stata fatta con frequenza comparabile da Soh et al., dove cinque delle 14 cornee normali hanno presentato ciò che hanno definito "Fallimento prematuro della coltura" (PCF) all'inizio del periodo^{di coltura 18}. Mentre il danno si è invertito nel tempo nelle nostre cornee e tuttavia era permanente nel loro caso, questo può essere attribuito al fatto che il loro metodo richiedeva di ferire un'area più ampia della cornea. L'osservazione di una colorazione periferica di Trypan più diffusa nelle cornee distrofiche può indicare che le cornee distrofiche sono più suscettibili alla morte delle cellule endoteliali rispetto alle cornee sane. Mentre la causa esatta di questa morte cellulare deve ancora essere chiarita, riteniamo improbabile che questo problema sia rilevante per le cornee umane in vivo. Danni all'endotelio periferico non sono stati riportati in alcun caso clinico di studio di DSO a nostra conoscenza, suggerendo che questo fenomeno è unico per le cornee da donatore coltivate ex vivo 6,8,10,11,21. A parte due casi in cui solo le cornee di controllo sono state colorate, tutte le osservazioni di colorazione periferica sono state accoppiate, quindi è improbabile che la causa sia stata l'esposizione a eFGF1 (NM141). Tuttavia, è possibile che in quei casi il trattamento possa aver fornito un effetto protettivo contro il danno che altrimenti avrebbe indotto la colorazione periferica in entrambe le cornee. Sono necessarie ulteriori indagini su questa ipotesi.

Un'altra limitazione a questo metodo è l'approvvigionamento di cornee da donatore rappresentative del fenotipo FECD a cui è destinato il DSO. Le cornee donatrici di qualsiasi tipo sono scarse, da qui la necessità di un intervento chirurgico che eviti l'uso del tessuto donatore. Per i nostri scopi, le uniche cornee disponibili sono quelle respinte dal trapianto per vari motivi. Le banche oculari classificano ulteriormente queste cornee come normali o distrofiche in base a criteri che includono la presenza di guttae, ECD bassa o non misurabile e morfologia IRREGOLARE DELLA CEC. Anche confermare una diagnosi distrofica prima di accettare tessuto da una banca degli occhi è quasi impossibile, poiché la storia medica della maggior parte dei donatori non include la storia oculare passata e le uniche informazioni fornite sono il valore ECD, le note del tecnico e in alcuni casi un'immagine speculare rappresentativa. Le cornee distrofiche ottenute per questo studio non hanno mostrato gutte centrali confluenti al microscopio confocale eseguito dopo il completamento del periodo di coltura, suggerendo che potrebbero rappresentare fasi "precoci" della FECD. Non ci aspettiamo che questo abbia un impatto significativo sulle implicazioni dello studio, poiché lo scopo del DSO è quello di rimuovere le aree confluenti di guttae, consentendo alle cellule periferiche sane di migrare verso l'interno.

Questo metodo fornisce una tecnica altamente applicabile e riproducibile per valutare gli agenti che potrebbero influire sulla proliferazione e la migrazione della CEC. Il modello ha diverse caratteristiche che lo rendono fisiologicamente più rilevante rispetto ai modelli in vitro che coinvolgono CEC in coltura, anche se seminato su innesto di tessuto corneale umano 22,23,24. In primo luogo, i CEC da stimolare sono in un monostrato esattamente come esistono nell'occhio del paziente e stanno migrando attraverso lo stroma corneale come farebbero dopo il DSO clinico. Lo stroma in questione proviene dallo stesso paziente dei CEC, controllando così le potenziali differenze stromali correlate alla FECD. Non è necessario espiantare, dissociare ed espandere le colture di CEC con le sfide e il potenziale associati per la transizione da endoteliale a mesenchimale (EnMT) durante il processo di coltivazione. Il protocollo descritto è di per sé molto simile alla procedura clinica DSO. Mentre bypassa le fasi di coltura ed espansione, questo metodo ha la limitazione che la durata dello studio è limitata dal gonfiore corneale, poiché lo strato epiteliale non viene mantenuto. Questo ci impedisce di studiare la morfologia dei CEC che sono migrati per coprire l'area spogliata, lasciando poco chiaro se alla fine si riorganizzeranno in un array esagonale in questo modello. Garcin et al. hanno sviluppato una potenziale soluzione con la loro macchina di stoccaggio attiva (ASM), un dispositivo che ha dimostrato di mantenere le cornee in coltura fino a 3 mesi con un edema significativamente inferiore rispetto alle cornee mantenute nella coltura tradizionale degli organi²⁵. Un tale dispositivo può essere utile per replicare ed espandere questo lavoro.

Questo modello ha una potenziale utilità nel testare altre terapie di guarigione delle ferite (ad esempio, inibitori ROCK), valutare le modifiche alla tecnica chirurgica e confrontare la guarigione tra diverse popolazioni di donatori o stadi di malattia. Speriamo che questa ricerca, in combinazione con i dati degli studi clinici man mano che escono, incoraggi i medici a considerare il DSO come una preziosa opzione di trattamento per i loro pazienti FECD idonei.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2µm sterile 1000 mL filter units	VWR	10040-440
0.2µm sterile 250 mL filter units	VWR	10040-464
0.2µm sterile 500 mL filter units	VWR	10040-436
10mL syringe Luer-Lok Tip	Becton Dickinson	302995
12 well tissue culture treated plate	Corning	3513
15 mL conical Tubes	VWR	89039-668
16% paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Science	15710
2mL aspirating pipette	VWR	414004-265
310 direct heat CO2 incubator	Forma Scientific	13-998-082	Set to 37°C, 6% CO2
50 mL conical tubes	VWR	89039-660
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU)	Thermo Scientific	C10337
5mL, 10mL, 25mL and 50mL serological pipettes	VWR	89130-896, -898,  -900, -902
6 well tissue culture treated plate	Corning	3516
70% ethanol	BDH	BDH1164-4LP
Alexa Fluor 488 azide	Thermo Scientific	A10266
Alizarin Red S	Sigma	A5533-25G
Analytical balance	Sartorious	R200D
Antibiotic & Antimycotic 100x (anti-anti)	Thermo Scientific	15240-062
Anti-magnetic stainless steel forceps	Excelta	7-SA
Bottle top dispenser	Ward's Science	470134-946
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP9700-100
Calcium chloride (CaCl)	Amresco	1B1110-500G
Chex-all II sterilzation pouches	Propperman	24008
Cirpofloxacin hydrochloride	Alfa Aesar	J61970
Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4)	Sigma	469130-50g
Dissecting microscope	Nikon	SMZ1270
Dry vacuum pump	Welch	2019B-01
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Scientific	A31606-01
Frosted micro slides	VWR	48311-703
Galaxy miniStar microcentrifuge	VWR	C1413, VWR
Goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor Plus 555	Thermo Scientific	A32727
Goat serum	Sigma	G9023
Haemo-Sol detergent	Haemo-Sol International LLC	026-050
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate	Thermo Scientific	H3570
Hot plate/stirrer	Corning	PC-320
Human corneas	Lions Eye Institute for Transplant and Research, Advancing Sight Network, Eversight Eye Bank, Lions Vision Gift, and Georgia Eye Bank	NA
Hydrochloric acid (HCl)	BDH	BDH7204
ImageJ	National Institute of Health	Version 1.52a
Infinity 3s microscopy camera	Lumenera	1URCAP2
Infinity analyze software	Lumenera	Version 6.5.5
Insulin transferrin selenium (ITS)	Corning	41400-045
Iris scissors, 11 cm	World Precision Instruments	501264-G
L- Ascorbic acid	Sigma	A4544-25G
Manual single channel pipet	Rainin	17014-392, -391, -382
Needle PrecisionGlide 30G	Becton Dickinson	305106
N-Met141 TTHX1114	Biopharmaceutical Development Program	NA
Opti-Mem I + GlutaMAX-1 (Opti-MEM)	Thermo Scientific	51985-034
Orion Star A211 pH meter	Thermo Scientific	STARA211
Petri dishes	VWR	89107-632
Potassium chloride (KCl)	BDH	BDH9258-500G
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	VWR	0781-500G
Powerpette plus pipet controller	VWR	75856-456
Precision water bath 188	Precision Scientific Incorporated	WB05	Set to 37°C
Purifier Class II model biosafety cabinet	Labconco	36213043726
Safe-Lock tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22363212
Scalpel size 22 stainless steel	Sklar	446479
Sodium chloride (NaCl)	VWR	2041-2.5K
Sodium hosphate dibasic (Na2HPO4)	VWR	0404-1KG
Standard shaker	VWR	89032-092
Standard solid refrigerator	VWR	10820-402	Set to 4°C
Sterilmatic autoclave	Market Forge	STM-EL
Syringe filters	VWR	28145-477
Test tube rocker	Thermo Scientific	M48725Q
Tru-Punch disposable biopsy punch, 4 mm	Sklar	96-1146
Trypan Blue	Thermo Scientific	15250-061
Tween-20	Sigma	P7949-100mL
Vibrance antifade mounting medium with DAPI	Vector Laboratories Inc.	H-1800
VistaVision cover glasses, no. 1	VWR	16004-098
Vortex Genie 2	Fisher Scientific	G-560
ZO-1 monoclonal antibody (ZO1-1A12)	Thermo Scientific	33-9100