Purificazione delle proteine ubiquitinate p53 da cellule di mammifero

Riepilogo

Il protocollo descrive un metodo passo-passo per purificare le proteine ubiquitinate dalle cellule di mammifero usando la proteina oncosoppressore p53 come esempio. Le proteine p53 ubiquitinate sono state purificate dalle cellule in rigorose condizioni di non denaturazione e denaturazione.

Abstract

L'ubiquitinazione è un tipo di modificazione post-traduzionale che regola non solo la stabilità, ma anche la localizzazione e la funzione di una proteina substrato. Il processo di ubiquitinazione avviene intracellulare negli eucarioti e regola quasi tutti i processi biologici cellulari di base. La purificazione delle proteine ubiquitinate aiuta lo studio del ruolo dell'ubiquitinazione nel controllo della funzione delle proteine substrato. Qui, una procedura passo-passo per purificare le proteine ubiquitinate nelle cellule di mammifero è descritta con la proteina oncosoppressore p53 come esempio. Le proteine p53 ubiquitinate sono state purificate in rigorose condizioni di non denaturazione e denaturazione. La proteina p53 cellulare totale Flag-tagged è stata purificata con agarosio coniugato con anticorpi anti-Flag in condizioni non denaturanti. In alternativa, la proteina ubiquitinata cellulare totale marcata con His-è stata purificata utilizzando resina carica di nichel in condizioni di denaturazione. Le proteine p53 ubiquitinate negli eluati sono state rilevate con successo con anticorpi specifici. Utilizzando questa procedura, le forme ubiquitinate di una data proteina possono essere efficacemente purificate dalle cellule di mammifero, facilitando gli studi sui ruoli dell'ubiquitinazione nella regolazione della funzione proteica.

Introduzione

L'ubiquitina è una proteina evolutivamente conservata di 76 aminoacidi ^1,2,3. L'ubiquitina lega covalentemente i residui di lisina sulle proteine bersaglio attraverso cascate che coinvolgono gli enzimi attivanti (E1), coniuganti (E2) e ligasi (E3). L'ubiquitina viene prima attivata dall'enzima E1 e quindi trasferita agli enzimi coniuganti E2. Successivamente, le ubiquitina ligasi E3 interagiscono sia con gli enzimi E2 caricati con ubiquitina che con le proteine del substrato e mediano la formazione di un legame isopeptidico tra il C-terminale dell'ubiquitina e un residuo di lisina nel substrato 1,2,3,4,5. L'ubiquitinazione comporta l'attaccamento delle frazioni di ubiquitina ai residui di lisina sulle proteine del substrato o a se stessa, portando alla monoubiquitinazione o alla poliubiquitinazione delle proteine. Questo processo di ubiquitinazione avviene intracellulare negli eucarioti e regola una grande varietà di processi biologici. L'ubiquitinazione provoca la degradazione delle proteine del substrato attraverso il sistema ubiquitina-proteasoma 1,2,3,4,5. Inoltre, l'ubiquitinazione modula la localizzazione subcellulare delle proteine, la formazione di complessi proteici e il traffico proteico nelle cellule ^3,5. Le frazioni di ubiquitina legate alle proteine del substrato possono essere rimosse dagli enzimi deubiquitinanti (DUB)^6,7. In particolare, i diversi modi in cui le catene di ubiquitina sono assemblate forniscono una miriade di mezzi per regolare vari processi biologici ^1,5. I ruoli esatti dell'ubiquitinazione nella regolazione della funzione proteica del substrato rimangono incompletamente compresi fino ad ora. La purificazione delle proteine ubiquitinate contribuisce alla spiegazione degli effetti dell'ubiquitinazione delle proteine su una varietà di processi cellulari.

La proteina p53 è una delle più importanti proteine oncosoppressori e presenta mutazioni genetiche o inattivazione in quasi tutti i tumori umani 8,9,10,11. La stabilità e l'attività di p53 sono delicatamente regolate in vivo da modificazioni post-traduzionali, tra cui ubiquitinazione, fosforilazione, acetilazione e metilazione^12,13. La proteina p53 ha una breve emivita che va da 6 min a 40 min in varie cellule, che deriva principalmente dalla sua poliubiquitinazione e successiva degradazione proteasomica^10,12. Il doppio minuto 2 del topo (Mdm2) è una ubiquitina ligasi E3 di p53 che si lega al N-terminale di p53 per inibire la sua attività trascrizionale^12,14,15. Mdm2 promuove la poliubiquitinazione e la degradazione proteasomica di p53 per controllarne la stabilità e induce la monoubiquitinazione di p53 per facilitare la sua esportazione nucleare^12,14,15,16. Qui, l'ubiquitinazione di p53 mediata da Mdm2 viene utilizzata come esempio per introdurre in dettaglio un metodo per la purificazione delle proteine ubiquitinate dalle cellule di mammifero. I regolatori che influenzano lo stato di ubiquitinazione delle proteine bersaglio possono essere identificati utilizzando questo test di ubiquitinazione in vivo quando sono sovraespressi o abbattuti / eliminati nelle cellule di mammifero. Inoltre, le proteine ubiquitinate possono essere utilizzate come substrati per il saggio di deubiquitinazione in vitro. È possibile eseguire uno screening ad alto rendimento per identificare DUB specifici per le proteine bersaglio incubando substrati ubiquitinati con singoli DUB. Le proteine ubiquitinate possono agire come un'impalcatura per reclutare proteine di segnalazione a valle nelle cellule. Un complesso proteico bersaglio ubiquitinata può essere purificato mediante immunoprecipitazione sequenziale in condizioni di purificazione native e identificato mediante spettrometria di massa. L'attuale protocollo può essere ampiamente utilizzato per studiare le proteine cellulari regolate dall'ubiquitinazione.

Sono stati stabiliti diversi metodi per purificare le proteine ubiquitinate, che includono l'uso di ubiquitina marcata per affinità, anticorpi ubiquitina, proteine leganti l'ubiquitina e domini isolati leganti l'ubiquitina (UBD)¹⁷. Qui, forniamo un protocollo che utilizza ubiquitina marcata di affinità come mediatore per purificare le proteine ubiquitinate nelle cellule di mammifero. L'uso di ubiquitina poli-His-marcata offre vantaggi rispetto agli altri metodi. Le proteine ubiquitinate vengono purificate in presenza di forti denaturanti, che riducono il legame non specifico alla resina carica di nichel linearizzando le proteine cellulari e interrompendo le interazioni proteina-proteina. Al contrario, l'uso di anticorpi ubiquitina, proteine leganti l'ubiquitina e UBD isolati come mediatori non può escludere efficacemente i partner leganti dalla proteina bersaglio perché la purificazione deve essere eseguita in condizioni meno rigorose. Inoltre, la purificazione può anche portare ad un maggiore legame di proteine non correlate usando questi mediatori. Inoltre, vi è una propensione al legame per vari tipi di legame dell'ubiquitina e per la mono- e poli-ubiquitinazione da parte di proteine leganti l'ubiquitina o UBD isolate¹⁷. L'uso di ubiquitina poli-His-marcata contribuisce ad abbattere tutte le proteine ubiquitinate cellulari. In alternativa, l'uso di agarosio coniugato con anticorpi anti-Flag o anti-HA disponibili in commercio rende più facile immunoprecipitare proteine bersaglio marcate con Flag o HA su larga scala in condizioni non denaturanti. Una seconda fase di purificazione, ad esempio, mediante resina carica di nichel mirata all'ubiquitina poli-His-marcata, può essere utilizzata per acquisire proteine bersaglio ubiquitinate con un'elevata purezza per esperimenti a valle. In particolare, una strategia di purificazione dell'epitopo può essere adattata quando un anticorpo specifico non può essere acquisito per immunoprecipitare efficacemente le proteine bersaglio. Infine, la purificazione delle proteine ubiquitinate nelle cellule di mammifero, rispetto alla purificazione in vitro, mantiene la modalità di legame ubiquitina delle proteine bersaglio in condizioni più fisiologiche.

Protocollo

NOTA: Le cellule H1299 sono state gentilmente fornite dalla Banca delle cellule staminali, Accademia cinese delle scienze e si sono dimostrate negative per la contaminazione da micoplasma.

1. Coltura cellulare

1. Per la coltura iniziale, posizionare 1 x 10⁶ cellule della linea cellulare di adenocarcinoma polmonare umano, H1299 in una capsula di Petri da 10 cm con 10-12 ml di terreno RPMI 1640 integrato con siero bovino fetale (FBS) al 1%, additivo glutamminico all'1%, piruvato di sodio all'1% e antibiotici (100 U/mL di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina). Mantenere le celle a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂. Dividere le celle ogni 2-3 giorni a seconda di quando raggiungono l'80% -90% di confluenza.
2. Un giorno prima della trasfezione, preparare 6-9 x 10 6 celle per tre piastre di Petri e placcare 2-3 x 10⁶ celle in un'unica capsula di Petri da 10 cm contenente 10-12 ml di terreno per ottenere una confluenza del 70%-90% durante la trasfezione.
   NOTA: Le cellule HEK293T possono anche essere utilizzate per purificare le proteine ubiquitinate grazie alla loro elevata efficienza di trasfezione e al livello di espressione proteica.

2. Trasfezione plasmidica

1. Aggiungere 1,5 mL di mezzo sierico ridotto in tre provette da centrifuga da 15 ml.
2. Aggiungere DNA plasmidico pronto per la trasfezione a ciascuna provetta per effettuare diluizioni come segue. Tubo 1: 1 μg di plasmide Flag-p53, 12 μg di vettore vuoto; Tubo 2: 1 μg di plasmide Flag-p53, 3 μg di plasmide His-HA-Ub (HH-Ub) e 9 μg di vettore vuoto; Tubo 3: 1 μg di plasmide Flag-p53, 3 μg di plasmide HH-Ub e 9 μg di plasmide Mdm2. Aggiungere un totale di 0,2 μg di plasmide di proteina fluorescente verde (GFP) a ciascun tubo per monitorare l'efficienza di trasfezione.
   NOTA: È necessario eseguire un esperimento pilota per determinare le quantità ottimali di plasmidi necessarie per ottenere un'espressione efficiente delle proteine bersaglio nelle cellule.
3. Aggiungere 78 μL di reagente di trasfezione liposomica a 4,5 ml di mezzo sierico ridotto in un'altra provetta da centrifuga per diluire i liposomi. Mescolare accuratamente facendo scorrere il tubo e lasciare riposare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
4. Aggiungere 1,5 mL della soluzione liposomica diluita in ciascuna provetta del punto 2.2 contenente 1,5 mL della soluzione di DNA diluito. Mescolare accuratamente e reticolare i plasmidi con i liposomi per almeno 20 minuti a RT. Utilizzare un rapporto plasmide DNA: liposoma di 1: 2 (μg: μL) per ogni trasfezione.
5. Scartare il mezzo originale dalle piastre di Petri e aggiungere 9 ml di terreno sierico ridotto in ogni piatto. Aggiungere 3 ml della miscela liposoma-DNA a ciascun piatto e mescolare la soluzione agitando delicatamente la piastra avanti e indietro 3x, quindi a sinistra e a destra 3x per una distribuzione uniforme della miscela nella piastra.
6. Coltura delle cellule in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO₂. Sostituire il mezzo dopo 4-6 ore e continuare a coltivare le cellule per 24-36 ore.

3. Raccolta delle cellule

1. Dopo 24-36 ore, trattare le cellule con MG132 ad una concentrazione finale di 10 μM per 4-6 ore.
   NOTA: MG132 è un'aldeide peptidica che blocca efficacemente l'attività proteolitica del complesso proteasoma 26S. La quantità di proteine ubiquitinate con catene di poliubiquitina legate alla lisina-48 (K48) può essere aumentata dopo che le cellule sono state trattate con MG132 o altri inibitori del proteasoma.
2. Scartare il terreno, lavare le cellule 2 volte (facendo attenzione a non lavare le cellule) con soluzione salina tamponata fosfato ghiacciata (PBS) e aspirare le cellule con pipet sierologici.
3. Aggiungere 1 mL di PBS al piatto, rimuovere le cellule raschiando con un raschietto pulito e trasferire la sospensione cellulare in provette di microcentrifuga. Centrifugare a 700 x g per 5 minuti per raccogliere i pellet cellulari.

4. Purificazione di proteine ubiquitinate in condizioni di non denaturazione

1. Preparare il tampone di lisi Flag (50 mM Tris-HCl (pH 7,9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM acido etilendiammiamminotetraacetico (EDTA), 1% Triton X-100, 0,2% sarkosyl e 10% glicerolo) appena integrato con cocktail inibitore della proteasi prima dell'uso.
2. Aggiungere 800 μL di tampone di lisi Flag ghiacciato alle celle di ciascuna provetta, mescolare le celle usando un oscillatore a vortice o una pistola per pipette, quindi incubare la miscela su un rotatore a 4 °C per 30 minuti.
3. Sottoporre la miscela a 5-10 brevi impulsi di ultrasuoni. Eseguire l'ultrasonicazione sul ghiaccio ad una frequenza di sonicazione di 20 kHZ e 80% di ampiezza con ogni impulso della durata di 1 s. Incubare la miscela su un rotatore a 40 giri al minuto (rpm) a 4 °C per 30 minuti.
4. Centrifugare i campioni ultrasonicati a 8.000 x g per 20-30 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga.
5. Aliquot 80 μL (1/10) dell'estratto cellulare e miscelare con 20 μL di tampone di carico 5x sodio dodecilsolfato (SDS). Far bollire i campioni a 98 °C per 5 minuti, raffreddare su ghiaccio per 2 minuti e conservare a -20 °C fino all'uso. Utilizzare questi campioni come gruppo di input per monitorare l'espressione proteica.
6. Aggiungere 30 μL di perle anticorpo-coniugate anti-Flag M2 (Flag/M2) agli estratti cellulari rimanenti e incubare su un rotatore a 4 °C per almeno 4 ore o per tutta la notte.
7. Centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a 4 °C per raccogliere le perle. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi Flag ghiacciato alle perle e mescolare capovolgendo il tubo più volte.
8. Centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a 4 °C per raccogliere le perle. Ripetere il passaggio 4.7 per 4-6 volte.
9. Aggiungere 40 μL di peptidi Flag ad una concentrazione finale di 200 ng/μL alle sfere e incubare su un rotatore a 4 °C per 2 ore per eluire le proteine legate.
10. Centrifugare a 1.500 x g per 5 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga.
11. Aggiungere 10 μL di tampone di carico 5x SDS, far bollire la miscela a 98 °C per 5 minuti, raffreddare su ghiaccio per 2 minuti e conservare a -20 °C per il Western blotting. In alternativa, conservare l'eluato dal punto 4.10 direttamente a -80 °C per altri esperimenti a valle.
    NOTA: La quantità di proteine ubiquitinate purificate può essere aumentata aumentando il numero di cellule e la quantità di plasmidi trasfettati. Una strategia di marcatura degli epitopi può essere adattata per purificare i complessi cellulari che si legano specificamente a p53 ubiquitinata in condizioni di purificazione native. Co-esprimendo Flag-p53, mdm2 e HA-ubiquitina, il complesso proteico p53 ubiquitinata può essere immunoprecipitato mediante agarosio sequenziale coniugato con anticorpi Flag e HA da cellule di mammifero. Per mantenere i partner leganti delle proteine p53 ubiquitinate, durante il processo di purificazione deve essere utilizzato il tampone di lisi BC100 meno rigoroso (20 mM Tris-HCl (pH 7,9), 100 mM NaCl, 10% glicerolo, 0,2 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 e 1x inibitore della proteasi). L'eluato del peptide HA viene sottoposto a spettrometria di massa per identificare tutti i partner che si legano specificamente a p53 ubiquitinata.

5. Purificazione delle proteine ubiquitinate in condizioni di denaturazione

1. Aggiungere 1 mL di PBS ghiacciato ai pellet cellulari ottenuti al punto 3.3 e mescolare uniformemente. Aliquot 100 μL (1/10 di volume) della sospensione cellulare in una provetta di microcentrifuga come campione di ingresso.
2. Centrifugare a 700 x g per 5 minuti a 4 °C per raccogliere i pellet cellulari. Aggiungere 80 μL di tampone di lisi Flag al campione di ingresso, mescolare le celle usando un oscillatore a vortice o una pistola per pipette e lisare le celle sul ghiaccio per 1 ora.
3. Centrifugare a 8.000 x g per 20-30 minuti a 4 °C. Aliquot 80 μL del surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga.
4. Aggiungere 20 μL di 5x tampone di carico SDS al surnatante, far bollire a 98 °C per 5-10 minuti, raffreddare su ghiaccio per 2 minuti e conservare a -20 °C fino all'uso.
5. Centrifugare i restanti 900 μL della sospensione cellulare a 700 x g per 5 minuti a 4 °C per raccogliere il pellet cellulare. Aggiungere 1 mL di ubiquitina tampone 1 (tampone UB 1; 6 M guanidina-HCI, 0,1 M Na 2 HPO 4, 6,8 mM NaH 2 PO₄, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) e_0,2% Triton X-100, appena integrato con 10 mM β-mercaptoetanolo e 5 mM imidazolo) ai pellet cellulari e mescolare più volte pipettando su e giù per distribuire uniformemente le cellule.
   NOTA: La concentrazione di imidazolo può variare da 5 mM a 20 mM per ridurre il legame proteico non specifico sulla resina carica di nichel. Il tampone di ubiquitina contiene guanidina cloridrato, che inattiva sia le ligasi che i DUB. β-mercaptoetanolo è un liquido chiaro e incolore con un odore forte e sgradevole simile alle uova marce. Una soluzione ad alta concentrazione causerà gravi danni alla mucosa, al tratto respiratorio superiore, alla pelle e agli occhi. Indossare guanti e occhiali e operare nella cappa aspirante.
6. Sottoporre i lisati cellulari a 10-20 cicli di ultrasuoni fino a quando la soluzione non è più viscosa. Eseguire l'ultrasonicazione sul ghiaccio ad una frequenza di sonicazione di 20 kHZ e 80% di ampiezza con ogni impulso della durata di 1 s. Centrifugare a 8.000 x g per 20-30 minuti a RT e trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga.
7. Aggiungere 30 μL di resina carica di nichel al surnatante e incubare su un rotatore impostato a 15 giri / min per 4 ore o durante la notte a RT. Centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a RT per raccogliere le perle.
8. Aggiungere 1 mL di tampone UB 1, incubare con rotazione in uno shaker per 10 minuti a RT e centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a RT per raccogliere le perle.
9. Aggiungere 1 mL di ubiquitina tampone 2 (tampone UB 2; 8 M urea, 0,1 M Na 2 HPO 4, 6,8 mM NaH 2 PO₄, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) e 0,2% Triton X-100) alle perle, incubare con rotazione in uno shaker per 10 minuti a RT e centrifugare a 1.500 x g per₂minuti per raccogliere le perle. Ripeti ancora una volta.
10. Alle perle, aggiungere 1 mL di PBS, incubare con rotazione in uno shaker per 10 minuti a RT e centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a RT per raccogliere le perle. Ripeti ancora una volta.
11. Eluire le proteine legate incubando le perle con 40 μL di imidazolo ad una concentrazione finale di 0,5 M per 1 ora a RT. Centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a RT.
12. Trasferire il surnatante in una provetta di microcentrifuga pulita, aggiungere 10 μL di tampone di carico 5x SDS, far bollire a 98 °C per 5 minuti, raffreddare su ghiaccio per 2 minuti e conservare a -20 °C per il Western blotting. In alternativa, conservare l'eluato non trattato a -80 °C per altri esperimenti a valle.

6. Individuazione di proteine ubiquitinate purificate mediante Western blotting

1. Risolvere i campioni dei punti 4.11 e 5.12 mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide dodecilsolfato di sodio (SDS-PAGE), quindi trasferirli su una membrana di nitrocellulosa mediante Western blotting per rilevare le proteine bersaglio utilizzando gli anticorpi corrispondenti come descritto¹⁸.
2. In breve, incubare la membrana immergendola in 20 mL di soluzione bloccante contenente il 5% di latte defat in polvere in tampone TBST (15 mM Tris-HCI; pH = 7,6, 4,6 mM Tris-base, 150 mM NaCI, appena integrato con 0,1% Tween-20 prima dell'uso) a RT per 1 ora. Quindi, incubare la membrana con anticorpi primari a RT per 2 ore o durante la notte a 4 °C. Utilizzare i seguenti anticorpi per ogni set. Tutti gli anticorpi primari sono stati utilizzati ad una diluizione di 1:1000.
   1. Rilevare la proteina p53 totale, inclusa p53 ubiquitinata, con un anticorpo monoclonale anti-p53 dopo immunoprecipitazione con perle di agarosio Flag/M2.
   2. Rilevare le proteine p53 ubiquitinate con un anticorpo anti-HA o anticorpo anti-ubiquitina dopo immunoprecipitazione con perle di agarosio Flag/M2.
   3. Rileva le proteine p53 ubiquitinate con un anticorpo monoclonale anti-p53 dopo il pulldown della resina carica di nichel.
   4. Rilevare la proteina ubiquitinata totale con un anticorpo anti-HA o anticorpo anti-ubiquitina dopo il pulldown della resina carica di nichel.
3. Incubare la membrana con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) a RT per 1 ora dopo aver lavato 3 volte con tampone TBST per 5 minuti ciascuno. Tutti gli anticorpi secondari sono stati utilizzati ad una diluizione di 1:3000. Quindi, lavare la membrana con tampone TBST 3x per 5 minuti ciascuno con delicata agitazione.
4. Avviare il sistema di imaging a chemiluminescenza per rilevare i segnali dal Western blotting. Preparare la soluzione di substrato per HRP miscelando le soluzioni A e B in un rapporto di 1:1.
5. Posizionare la membrana di nitrocellulosa nella camera oscura a faccia in su e rivestire uniformemente la soluzione del substrato sulla membrana usando una pistola pipettaggio. Selezionare la procedura di esposizione automatica per acquisire i segnali chemiluminescenti e regolare manualmente il tempo di esposizione fino a quando non viene acquisito un segnale ideale.

Risultati

Il diagramma schematico mostra le proteine p53 marcate con bandiera (Flag-p53) e ubiquitina (HH-Ub) con doppia marcatura His/HA (Figura 1A). Le procedure utilizzate per purificare le proteine ubiquitinate sono riassunte nella Figura 1B. L'ubiquitina Poly-His-taggata può essere legata alle proteine bersaglio nelle cellule di mammifero. Le proteine ubiquitinate possono essere purificate con sfere Flag/M2 in condizioni di non denaturazione o mediante cromatografia...

Discussione

L'ubiquitinazione svolge un ruolo critico in quasi tutti i processi cellulari fisiologici e patologici². Negli ultimi anni, sono stati fatti grandi progressi nella comprensione del ruolo molecolare dell'ubiquitina nelle vie di segnalazione e di come i cambiamenti nel sistema dell'ubiquitina portino a diverse malattie umane². La purificazione delle proteine ubiquitinate contribuisce a fornire informazioni sui ruoli esatti dell'ubiquitinazione in questi processi. Le miscele d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-mercaptoethanol	Sangon Biotech	M6250
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)	GE healthcare	NA931	Secondary antibdoy
Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)	GE healthcare	NA935	Secondary antibdoy
Anti-Flag M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220	FLAG/M2 beads
Anti-GFP monocolonal antibody	Santa cruz	sc-9996	Primary antibody
Anti-HA High Affinity	Roche	11867423001	Primary antibody
Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14)	Santa cruz	sc-965	Primary antibody
Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1)	Santa cruz	sc-126	Primary antibody
EDTA	Sigma-Alddich	E5134	solvent
Fetal Bovine Serum	VivaCell	C04001-500	FBS
FLAG Peptide	Sigma-Alddich	F3290	Prepare elution buffer
GlutaMAX	Gibco	35050-061	supplement
Guanidine-HCI	Sangon Biotech	A100287-0500	solvent
H1299	Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences
Image Lab	Bio-rad		software
Immidazole	Sangon Biotech	A500529-0100	solvent
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate	Millipore	WBKLS0500
Lipofectamine 2000 reagents	Invitrogen	11668019	Transfection reagent
MG132	MedChemExpress	HY-13259	Proteasome inhibitor
Na2HPO4	Sangon Biotech	A501727-0500	solvent
NaCl	Sangon Biotech	A610476-0005	solvent
NaF	Sigma-Alddich	201154	solvent
NaH2PO4	Sangon Biotech	A501726-0500	solvent
Ni-NTA Agarose	QIAGEN	30230	nickel-charged resin
Nitrocellulose Blotting membrane	GE healthcare	10600002	0.45 µm pore size
Opti-MEM reduced serum medium	Gibco	31985-070	Transfection medium
PBS	Corning	21-040-cv
Penicillin-Streptomycin Solution	Sangon Biotech	E607011-0100	antibiotic
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340
RPMI 1640	Biological Industries	01-100-1ACS	medium
Sarkosyl	Sigma-Alddich	L5777	solvent
SDS Loading Buffer	Beyotime	P0015L
Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070	supplement
Tris-base	Sangon Biotech	A501492-0005	solvent
Tris-HCI	Sangon Biotech	A610103-0250	solvent
Triton X-100	Sangon Biotech	A110694-0500	reagent
Tween-20	Sangon Biotech	A100777-0500	supplement
Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System	Bio-rad		ChemiDoc XRS+
Urea	Sangon Biotech	A510907-0500	solvent