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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il protocollo qui dimostra che le vescicole extracellulari possono essere adeguatamente separate dai terreni di coltura cellulare condizionati utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale.

Abstract

Le vescicole extracellulari (EV) sono strutture legate alla membrana lipidica di dimensioni nanometriche che vengono rilasciate da tutte le cellule, sono presenti in tutti i biofluidi e contengono proteine, acidi nucleici e lipidi che riflettono la cellula madre da cui derivano. La corretta separazione degli EV dagli altri componenti in un campione consente la caratterizzazione del loro carico associato e fornisce informazioni sul loro potenziale come comunicatori intercellulari e biomarcatori non invasivi per numerose malattie. Nel presente studio, le EV derivate dagli oligodendrociti sono state isolate dai terreni di coltura cellulare utilizzando una combinazione di tecniche all'avanguardia, tra cui l'ultrafiltrazione e la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) per separare le EV da altre proteine extracellulari e complessi proteici. Utilizzando colonne SEC disponibili in commercio, le EV sono state separate dalle proteine extracellulari rilasciate dalle cellule di oligodendroglioma umano sia in condizioni di controllo che di stress del reticolo endoplasmatico (ER). I marcatori EV canonici CD9, CD63 e CD81 sono stati osservati nelle frazioni 1-4, ma non nelle frazioni 5-8. GM130, una proteina dell'apparato di Golgi, e calnexina, una proteina integrale dell'ER, sono stati usati come marcatori EV negativi e non sono stati osservati in nessuna frazione. Inoltre, quando si raggruppano e si concentrano le frazioni 1-4 come frazione EV e le frazioni 5-8 come frazione proteica, è stata osservata l'espressione di CD63, CD81 e CD9 nella frazione EV. L'espressione di GM130 o calnexina non è stata osservata in nessuno dei tipi di frazione. Le frazioni aggregate da entrambe le condizioni di stress di controllo e ER sono state visualizzate con microscopia elettronica a trasmissione e le vescicole sono state osservate nelle frazioni EV, ma non nelle frazioni proteiche. Anche le particelle nell'EV e le frazioni proteiche di entrambe le condizioni sono state quantificate con l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle. Insieme, questi dati dimostrano che SEC è un metodo efficace per separare le EV dai terreni di coltura cellulare condizionati.

Introduzione

L'esplosione di interesse nello studio delle vescicole extracellulari (EV) è stata accompagnata da importanti progressi nelle tecnologie e nelle tecniche utilizzate per separare e studiare queste particelle eterogenee di dimensioni nanometriche. Nel tempo trascorso dalla loro scoperta quasi quattro decenni fa1,2, queste piccole strutture membranose sono state trovate per contenere lipidi bioattivi, acidi nucleici e proteine, e svolgono un ruolo importante nella comunicazione intercellulare 3,4. Le EV vengono rilasciate da tutti i tipi di cellule e sono quindi presenti in tutti i fluidi biologici, compresi plasma sanguigno e siero, saliva e urina. Le EV all'interno di questi fluidi sono molto promettenti per servire come biomarcatori non invasivi per varie malattie, tra cui malattie neuroinfiammatorie e neurodegenerative, tumori e disturbi autoimmuni 5,6,7. Inoltre, gli studi meccanicistici in vitro possono essere eseguiti attraverso tecniche di coltura cellulare separando le EV rilasciate nel terreno di coltura 3,8,9.

Per comprendere il ruolo delle EV nella fisiopatologia della malattia, un'adeguata separazione dal fluido in cui si trovano è fondamentale. Il gold standard per la separazione delle EV è stato a lungo l'ultracentrifugazione differenziale (dUC)10, tuttavia sono emerse tecniche più sofisticate per ottenere una migliore separazione delle EV da altri componenti extracellulari. Alcune di queste tecniche includono gradienti di densità, frazione di flusso asimmetrico (A4F), citometria a flusso, immunocattura, precipitazione di polietilenglicole e cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) 11,12,13. Ogni tecnica ha il suo insieme di vantaggi e svantaggi; tuttavia, la SEC in particolare ha dimostrato di separare gli EV sia dai fluidi biologici che dai supernatanti di coltura cellulare in modo abbastanza efficace 8,14,15. SEC ha anche il vantaggio di essere relativamente semplice e facile da usare.

SEC è un metodo che separa i componenti di un fluido in base alle dimensioni. Con questa tecnica, una colonna di resina (prodotta internamente o acquistata commercialmente) viene utilizzata per frazionare un campione. Le particelle piccole nel campione rimangono intrappolate tra le perle all'interno della resina, mentre le particelle più grandi sono in grado di passare attraverso la resina più liberamente, e quindi eluire all'inizio del processo. Poiché le EV sono di dimensioni maggiori rispetto a molte proteine extracellulari e aggregati proteici, le EV passano attraverso la colonna più velocemente e si eluiscono nelle frazioni precedenti rispetto alle proteine extracellulari14.

In questo documento sui metodi, viene delineato l'uso di SEC per la separazione di EV da terreni di coltura cellulare (CCM) da oligodendrociti umani in condizioni di stress sia di controllo che del reticolo endoplasmatico (ER). Utilizzando questo protocollo, è dimostrato che le EV separate con questa tecnica si trovano all'interno di frazioni specifiche che possono essere raggruppate insieme e concentrate per la caratterizzazione a valle, e che le EV separate derivano da cellule e non da una fonte esogena come il siero bovino fetale (FBS) utilizzato per integrare il CCM. La presenza dei marcatori EV canonici, CD63, CD81 e CD916,17,18,19 nelle frazioni EV e la loro assenza nelle frazioni proteiche è dimostrata con western blotting. Utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), le EV vengono visualizzate e visualizzano la morfologia attesa e vengono osservate solo nella frazione EV. Le particelle vengono anche contate nelle frazioni EV e proteiche di entrambe le condizioni di stress di controllo e ER, e un gran numero di particelle all'interno dell'intervallo di dimensioni previsto di 50-200 nm di diametro sono osservati nei campioni EV. Insieme, questi dati supportano l'idea che SEC sia un metodo efficiente ed efficace per separare le EV dai terreni di coltura cellulare.

Protocollo

1. Preparazione di tamponi e reagenti

NOTA: Produrre reagenti di coltura cellulare nella cappa di coltura cellulare per mantenere la sterilità.

  1. Preparazione di reagenti di coltura cellulare
    1. Preparare il normale DMEM ad alto contenuto di glucosio aggiungendo 50 ml di FBS e 5 ml di penicillina-streptococco (Pen-Strep) in 500 ml di DMEM ad alto contenuto di glucosio e conservare a 4 °C. Utilizzare questo mezzo per la coltura e l'espansione delle cellule.
    2. Preparare DMEM ad alto contenuto di glucosio impoverito dagli esosomi aggiungendo 50 ml di FBS impoverito di esosomi e 5 ml di Pen-Strep in 500 ml di DMEM ad alto contenuto di glucosio e conservare a 4 °C. Utilizzare questo supporto per i trattamenti cellulari prima dell'isolamento EV.
    3. Preparare la tunicamicina aggiungendo 10 mg di tunicamicina a 1 mL di dimetilsolfossido (DMSO). Produrre aliquote da 50 μL in provette da 0,2 mL e conservare a -20 °C.
  2. Preparazione di reagenti di separazione EV
    1. Preparare 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) aggiungendo 9,89 g di polvere di PBS a 1 L di acqua deionizzata (DI) in un cilindro graduato da 1 L. Mescolare la soluzione su una piastra di agitazione fino a quando il PBS si dissolve.
    2. Utilizzare l'autoclave per sterilizzare la vetreria prima di aggiungere PBS. Mettere la vetreria in un cestino, chiudere la porta e sterilizzare per 30 minuti a 121 °C.
    3. All'interno di un armadio a flusso laminare, collegare un vuoto al filtro da 0,22 μm e posizionare il filtro sopra la bottiglia autoclavata. Versare lentamente il PBS sul filtro e raccogliere il PBS filtrato nel flacone autoclavato.
    4. Preparare 0,5 M di idrossido di sodio aggiungendo 9,99 g di idrossido di sodio a 500 ml di 1x PBS in un cilindro graduato da 500 ml. Agitare la soluzione su una piastra di agitazione fino a quando l'idrossido di sodio si dissolve nel PBS e quindi filtrare utilizzando un filtro da 0,22 μm in un flacone autoclavato da 500 ml.
    5. Preparare lo 0,05% di azoturo di sodio aggiungendo 0,25 g di azoturo di sodio a 500 ml di 1x PBS in un cilindro tarato da 500 mL. Mescolare la soluzione su una piastra di agitazione fino a quando l'azoturo di sodio si dissolve nel PBS, quindi filtrare utilizzando un filtro da 0,22 μm in un flacone autoclavato da 500 ml.
  3. Preparazione di reagenti di isolamento, quantificazione e identificazione delle proteine
    1. Preparare 100 mL di tampone di lisi RIPA combinando 1 mL di 1 M Tris (pH 7,4), 1 mL di 10% di sodio dodecilsolfato (SDS), 1 g di desossicolato, 1 mL di NP-40 e 0,89 g di cloruro di sodio (NaCl). Portare il volume a 100 mL con H2O distillato e conservare a 4 °C. Per ottenere la soluzione di RIPA più fosfatasi e inibitori della proteasi, aggiungere 10 μL di fosfatasi e inibitore della proteasi per ogni 1 mL di tampone RIPA in una provetta da 15 mL e conservare la soluzione a 4 °C.
    2. Immediatamente prima dell'uso, preparare il reagente di lavoro del test BCA aggiungendo 10 ml di reagente A e 200 μL di reagente B forniti dal kit di analisi BCA in una provetta da 15 ml. Immediatamente prima dell'uso, preparare il reagente di lavoro del test microBCA aggiungendo 25 parti di reagente A, 24 parti di reagente B e 1 parte di reagente C in una provetta da 15 ml.
    3. Preparare 10x tampone per elettroforesi su gel aggiungendo 30,3 g di Tris base, 144 g di glicina e 10 g di SDS in 1 L di acqua DI. Conservare il buffer corrente a 4 °C. Preparare 1x tampone di trasferimento aggiungendo 3,03 g di Tris base, 14,4 g di glicina e 200 ml di metanolo e regolare il volume a 1 L con acqua DI. Conservare il buffer di trasferimento a 4 °C.
    4. Preparare la soluzione salina tamponata Tris con Tween-20 (TBS-Tween) aggiungendo 2,4 g di Tris base, 8 g di NaCl e 1 mL di Tween-20 in 1 L di acqua DI. Conservare TBS-Tween a 4 °C.
    5. Preparare una soluzione bloccante al 5% aggiungendo 5 g di latte in polvere non grasso a 100 ml di TBS-Tween. Conservare il buffer bloccante a 4 °C.
    6. Immediatamente prima dell'uso, preparare il substrato chemiluminescente aggiungendo 4 mL di soluzione di perossido e 4 mL di soluzione di luminol/enhancer in un tubo da 15 mL e capovolgere delicatamente per miscelare.

2. Coltura e trattamento delle cellule

  1. Seminare due palloni di coltura cellulare T175 con 2,3 x 106 cellule di oligodendroglioma umano (HOG) ciascuna. Portare il volume finale di DMEM normale ad alto glucosio a 25 ml e incubare a 37 °C con il 5% di CO2 in un incubatore di coltura cellulare per 48 ore.
  2. Alla fine delle 48 ore, DMEM caldo ad alto contenuto di glucosio impoverito di esosomi in un bagno d'acqua a 37 °C. Per il trattamento, aggiungere 25 μL di 10 mg/ml di tunicamicina a 25 ml di mezzi impoveriti di esosomi, concentrazione finale di 10 μg/ml di tunicamicina per indurre lo stress ER. Per il controllo, aggiungere 25 μL di DMSO a 25 mL di mezzi impoveriti dagli esosomi.
  3. Rimuovere e smaltire il normale DMEM ad alto contenuto di glucosio dalle cellule e sciacquare delicatamente le cellule e il pallone con 10 ml di 1x PBS. Aspirare e scartare PBS.
  4. Aggiungere 25 mL di terreno di controllo nel matraccio marcato con controllo e 25 mL di 10 μg/mL di tunicamicina nei terreni nel trattamento marcato con il pallone. Restituire i palloni all'incubatore per colture cellulari per 24 ore.

3. Raccolta e concentrazione di CCM condizionati (figura 1)

  1. Mettere il PBS a bagnomaria a 37 °C. Osservare i palloni al microscopio composto con obiettivo 10x e 100x. Prendi nota di eventuali differenze tra i palloni. Eseguire i seguenti passaggi sia per i palloni di controllo che per quelli trattati.
  2. Prelevare il materiale dal matraccio e metterlo in un tubo da 50 ml. Centrifugare il tubo a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 50 ml.
  3. Centrifugare il tubo a 2.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 50 mL e metterlo in ghiaccio.
  4. Ottenere quattro unità di ultrafiltrazione cutoff da 15 mL 3 kDa e aggiungere 5 mL di PBS a ciascun tubo. Innescare il filtro centrifugando le unità di ultrafiltrazione a 4.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
    NOTA: Nel protocollo attuale sono state utilizzate unità di ultrafiltrazione con cutoff del peso molecolare da 3 kDa per trattenere tutte le proteine extracellulari rilasciate dalle cellule. Anche le unità di ultrafiltrazione di cutoff del peso molecolare più grandi (ad esempio, 30 kDa) funzionerebbero con questo protocollo, tuttavia le proteine extracellulari più piccole di 30 kDa verrebbero filtrate e rimosse dai campioni20,21.
  5. Rimuovere il PBS dalle unità di ultrafiltrazione. Dividere il surnatante di ciascuna condizione (controllo e trattamento con tunicamicina) in due unità di ultrafiltrazione ciascuna, circa 12,5 ml di mezzo in ciascuna.
  6. Centrifugare i tubi a 4.000 x g per 1 ora e 45 minuti a 4 °C, o fino a quando il mezzo concentrato (indicato come retentato) in ciascuna unità di ultrafiltrazione è concentrato a 250 μL o meno.
  7. Trasferire il retentato da entrambe le unità di ultrafiltrazione di controllo in una provetta da microcentrifuga marcata da 1,5 ml. Trasferire il retentato da entrambe le unità di ultrafiltrazione trattate in un'altra provetta da microcentrifuga marcata da 1,5 ml.
  8. Misurare il volume totale del retentato in ciascuna provetta di microcentrifuga in modo che sia di 500 μL. Se il campione è inferiore a 500 μL, aggiungere 0,22 μm filtrato 1x PBS fino a quando il volume finale è 500 μL. Posizionare le provette in un congelatore a -80 °C.

4. Raccolta delle cellule

  1. Mettere tripsina, PBS e DMEM impoverito di esosomi in un bagno d'acqua a 37 °C. Aggiungere 7 ml di tripsina ai palloni di controllo e trattati e mettere nell'incubatore per 5 minuti.
  2. Visualizza al microscopio per vedere se le cellule sono sollevate. Se le cellule non vengono sollevate, picchiettare con decisione il pallone contro il palmo della mano per rimuovere le cellule.
  3. Lavare il matraccio con 7 mL di DMEM impoverito di esosomi. Raccogliere la sospensione cellulare dal pallone e metterla in provette da 15 ml.
  4. Centrifugare i tubi per 10 minuti a 500 x g a 4 °C. Rimuovere il surnatante e aggiungere 5 ml di 1x PBS al pellet cellulare. Pipettare delicatamente la miscela per rompere il pellet.
  5. Centrifugare i tubi a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e aggiungere 200 μL di RIPA più fosfatasi e soluzione inibitore della proteasi al pellet cellulare, pipetta da miscelare.
  6. Trasferire le cellule nella soluzione RIPA in provette da 1,5 ml. Lasciare riposare i tubi sul ghiaccio per 5 minuti. Centrifugare i tubi a 14.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
  7. Trasferire il surnatante in nuove provette da 1,5 ml. Etichettare i tubi con le condizioni e la data del trattamento. Mettere i tubi in un congelatore a -80 °C.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.

5. Separazione EV mediante cromatografia ad esclusione dimensionale (Figura 2)

NOTA: eseguire i seguenti passaggi due volte, una volta per il retentato di controllo e una volta per il retentato trattato con tunicamicina.
NOTA: il PBS utilizzato in questa sezione è 1x PBS filtrato da 0,22 μm.

  1. Attivare il raccoglitore automatico delle frazioni (AFC) e regolare le impostazioni per raccogliere otto frazioni, 0,5 mL per frazione e buffer (vuoto) del volume predefinito.
    NOTA: Le condizioni operative AFC sono le seguenti: volume colonna/letto = 10 ml; volume vuoto = 2,70 ml; volume di lavaggio = 15 ml; dimensione ottimale della frazione = 500 μL; buffer richiesto per run = 65 mL; portata a 20 °C = 1,0 mL/min; Riusabilità della colonna = cinque usi.
  2. Rimuovere la colonna (vedere la tabella dei materiali) da 4 °C e lasciare che la colonna si riscaldi a temperatura ambiente prima di iniziare (di solito ~30 min).
  3. Prelevare i campioni retentati dal congelatore a -80 °C e metterli sul ghiaccio per scongelare. Durante l'attesa, impostare otto tubi etichettati da 1,5 ml nel carosello AFC con i coperchi rivolti verso l'interno.
  4. Inserire la colonna nell'AFC con il codice a barre rivolto verso il lettore. Inizia la raccolta seguendo le istruzioni sullo schermo per verificare che ci siano tubi nella giostra e che il raccoglitore dei rifiuti funzioni correttamente.
  5. Iniziare a lavare la colonna aggiungendo 15 mL di 1x PBS alla colonna dopo che il buffer di archiviazione è stato completamente assorbito nella parte superiore della matrice di colonna. Non aggiungere PBS troppo presto in quanto ciò diluirebbe il buffer di archiviazione e impedirebbe un adeguato svuotamento.
  6. Appena prima che tutti i 15 mL di PBS vengano assorbiti dalla matrice, fare clic su OK per interrompere il lavaggio e rimuovere qualsiasi PBS residuo dalla parte superiore della matrice a colonna con una micropipetta. Non toccare la matrice.
  7. Aggiungere 500 μL di campione al centro della colonna. Fare clic su OK per iniziare l'esecuzione. Guarda il campione assorbire nella matrice e aggiungere rapidamente 8 ml di PBS alla colonna immediatamente dopo che il campione è stato completamente assorbito.
  8. L'AFC dissiperà automaticamente il volume del vuoto al centro del carosello e quindi raccoglierà tutte le otto frazioni di 500 μL ciascuna. Al termine della corsa, rimuovere le frazioni dalla giostra e posizionarle sul ghiaccio. Le frazioni 1-4 contengono EV mentre le frazioni 5-8 contengono proteine extracellulari. Rimuovere il volume vuoto dal centro della giostra.
  9. Aggiungere 10 ml di PBS alla colonna dopo che le otto frazioni sono state raccolte per lavare qualsiasi campione residuo dalla colonna. Dopo che il campione di retentato è stato completamente lavato attraverso la colonna, aggiungere 15 mL di 1x PBS alla colonna.
  10. Mentre il PBS finale viene assorbito dalla matrice, aggiungere 500 μL di idrossido di sodio 0,5 M al centro della matrice della colonna. Quando l'idrossido di sodio viene assorbito, aggiungere 30 ml di 1x PBS alla colonna e lasciarlo passare.
  11. Se si esegue un altro campione, aggiungere otto provette di microcentrifuga marcate da 1,5 ml al carosello e ripetere i passaggi 5,7-5,10.
  12. Una volta completati tutti gli esempi, completare i passaggi seguenti per conservare la colonna per un utilizzo successivo. Dopo aver lavato 30 mL di PBS attraverso la colonna come descritto al punto 5.10, aggiungere 15 mL di azoturo di sodio allo 0,05% alla colonna.
  13. Lasciare circa 5 mL di azoturo di sodio sulla parte superiore della matrice della colonna. Rimuovere la colonna dall'AFC e fissare i cappucci superiore e inferiore. Riposizionare la colonna a 4 °C per la conservazione (la colonna può essere utilizzata fino a cinque volte).

6. Ultrafiltrazione di EV e frazioni proteiche

  1. Ottenere due unità di ultrafiltrazione cutoff da 2 mL, 3 kDa per campione. Utilizzare un'unità per concentrare le frazioni EV (frazioni 1-4) e l'altra per concentrare le frazioni proteiche (frazioni 5-8). Ogni unità è composta da tre parti: cono, filtro e cilindro passante; Etichettare correttamente ogni parte.
  2. Costruire l'unità di ultrafiltrazione e aggiungere 1 mL di 1x PBS filtrato da 0,22 μm alla porzione filtrante e al tappo con il pezzo del cono. Centrifugare l'unità di ultrafiltrazione, con il lato a cono verso l'alto a 3.500 x g per 10 minuti a 4 °C.
  3. Rimuovere il PBS filtrato dal cilindro passante. Capovolgere l'unità di ultrafiltrazione (cono-side down) e centrifugare per 2 minuti a 1.000 x g a 4 °C. Rimuovere qualsiasi PBS residuo dal cono.
  4. Aggiungere le frazioni appropriate (l'intero volume di 500 μL) a ciascuna unità di ultrafiltrazione (il volume totale sarà di 2 ml). Centrifugare le colonne con il cono rivolto verso l'alto per 1 h 45 min a 3.500 x g a 4 °C, o fino a quando il livello di retentato è a 100 μL.
  5. Rimuovere il cilindro passante e scartare il flusso attraverso. Capovolgere l'unità di ultrafiltrazione (cono-side down) e centrifugare per 2 minuti a 1.000 x g a 4 °C.
  6. Trasferire il retentato nel cono in una provetta da microcentrifuga marcata da 1,5 mL e portare ciascun volume di campione a 150 μL con 0,22 μm filtrato 1x PBS. Posizionare i tubi in congelatore a -80 °C.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.

7. Controlli multimediali

  1. Procurarsi due matraccio per coltura cellulare T175. Etichettare un controllo del pallone e l'altro trattamento. DMEM caldo ad alto contenuto di glucosio impoverito dagli esosomi in bagnomaria a 37 °C.
  2. Aggiungere 25 μL di soluzione madre di tunicamicina (10 mg/ml) a 25 mL di terreno e introdurre il trattamento marcato con il pallone. Aggiungere 25 μL di DMSO a 25 mL di fluido e inserire il controllo etichettato con il pallone. Conservare i palloni in un incubatore per colture cellulari per 24 ore.
  3. Raccogliere supporti ed elaborare per separare i veicoli elettrici come descritto nei passaggi 3.2-3.8. Successivamente, eseguire tutti i passaggi descritti nelle sezioni 5 e 6.

8. Western blotting

  1. Quantificazione proteica da lisati cellulari e frazioni proteiche con saggio BCA
    NOTA: La quantificazione delle proteine da campioni di controllo e trattati con tunicamicina viene eseguita con le seguenti fasi.
    1. Scongelare le cellule lisate e le frazioni proteiche sul ghiaccio. Fare tre tubi di diluizione per ogni campione; 1:2, 1:10 e 1:100.
    2. Caricare in triplice copia su una piastra di analisi a fondo chiaro con 96 pozzetti, 25 μL di proteine sieroalbumina bovina (BSA) standard e 25 μL di ciascuna diluizione del campione. Aggiungere un reagente di lavoro da 200 μL a ciascun pozzetto contenente standard o campione, utilizzando una pipetta multicanale.
    3. Incubare la piastra a 37 °C per 30 minuti, quindi leggere la piastra con un lettore di piastre ad un'assorbanza di 562 nm. Calcolare la concentrazione proteica in ciascun campione e determinare il volume di campione necessario per ottenere 20 μg di proteine per i lisati cellulari e 15 μg di proteine per le frazioni proteiche.
  2. Quantificazione delle proteine da frazioni EV con test microBCA
    1. Disgelo dei campioni EV sul ghiaccio. Fare due diluizioni per ogni campione: 1:50 e 1:100.
    2. Caricare in triplice copia su una piastra di analisi a fondo chiaro a 96 pozzetti, 100 μL di standard di proteina BSA e 100 μL di ogni diluizione del campione. Aggiungere 100 μL di reagente di lavoro microBCA a ciascun pozzetto contenente standard o campione, utilizzando una pipetta multicanale.
    3. Incubare la piastra a 37 °C per 2 ore, quindi leggere la piastra con un lettore di piastre ad un'assorbanza di 562 nm. Calcolare la concentrazione proteica in ciascun campione e determinare il volume di campione necessario per ottenere 15 μg di proteine per le frazioni EV.
  3. Western blotting
    NOTA: il protocollo Western blotting è stato eseguito in modo simile a quello descritto in22 e modificato come descritto di seguito.
    1. Realizza gel di poliacrilammide al 10% con un kit per la produzione di gel, seguendo le istruzioni del produttore.
    2. Per l'elettroforesi su gel, preparare campioni di lisato cellulare combinando in una provetta da 1,5 mL, il volume di lisato cellulare necessario per 20 μg di proteine, 5 μL di tampone Laemmli 4x e il volume di tampone RIPA necessario per portare il volume totale a 20 μL.
    3. Preparare campioni di EV e frazione proteica combinando in una provetta da 1,5 mL il volume di campione necessario per 15 μg di proteine, 5 μL di tampone Laemmli 4x e tampone RIPA ad un volume di 20 μL.
    4. Preparare i campioni di controllo dei supporti combinando in una provetta da 1,5 ml 15 μL di campione e 5 μL di tampone Laemmli 4x.
      NOTA: A seconda degli anticorpi da utilizzare, il tampone Laemmli può contenere o meno un agente riducente, come 50 mM ditiotreitolo (DTT).
    5. Far bollire tutti i campioni a 95 °C per 5 minuti, trasferire i campioni sul ghiaccio per raffreddarli e centrifugare brevemente per 30 s a 10.000 x g, quindi riportare i campioni sul ghiaccio.
    6. Aggiungere i gel al serbatoio di elettroforesi e aggiungere 1x tampone di esecuzione per elettroforesi su gel. Caricare 15 μL di scala proteica e 20 μL di campione. Eseguire il gel a 200 V per 30-50 minuti, o fino a quando i campioni hanno raggiunto il fondo del gel, appena prima di fuoriuscire.
    7. Trasferire la proteina su una membrana PVDF con 1x tampone di trasferimento a 4 °C per 30 minuti a 100 V, o fino al completamento del trasferimento. La Figura supplementare 1, la Figura supplementare 2 e la Figura supplementare 3 mostrano immagini senza macchie di ogni macchia dopo il completamento del trasferimento.
    8. Bloccare la membrana in latte al 5% / TBS-Tween per 1 ora a temperatura ambiente su uno shaker. Incubare la membrana in soluzione di anticorpi primari per una notte su uno shaker a 4 °C. Vedere Tabella 1 per informazioni sulla diluizione degli anticorpi.
    9. Il giorno seguente, rimuovere l'anticorpo primario e lavare la membrana 3x con TBS-Tween per 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente su uno shaker.
    10. Preparare anticorpi secondari appropriati in latte al 5% / TBS-Tween. Vedere la Tabella 1 per informazioni sulla diluizione. Aggiungere l'anticorpo secondario alla membrana e incubare su uno shaker a temperatura ambiente per 1 ora, quindi lavare 3 volte con TBS-Tween per 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente su uno shaker.
    11. Aggiungere il substrato chemiluminescente alla membrana e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente su uno shaker. Maschera immagine utilizzando l'analisi colorimetrica e chemiluminescente. La Figura 4 supplementare, la Figura supplementare 5 e la Figura 6 supplementare mostrano immagini non ritagliate di ogni macchia.

9. Imaging TEM

  1. Scarico incandescente23 400 griglie rivestite in carbonio/formvar per rimuovere gli idrocarburi e rendere le griglie idrofile.
  2. Aggiungere 5 μL di EV o campione di frazione proteica alle griglie. Incubare le griglie a temperatura ambiente per 3-5 min.
  3. Rimuovere la soluzione in eccesso assorbendo con carta da filtro. Lavare le griglie con 5 μL di acqua nanopura e rimuovere l'eccesso con l'esplosione.
  4. Applicare 5 μL di acetato acquoso di uranile all'1% e togliere immediatamente. Lasciare asciugare le griglie. Griglie di immagini a 120 kV su un microscopio elettronico a trasmissione e cattura immagini con una fotocamera a coppia carica.

10. Analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA)

  1. Ottenere campioni di EV e frazione proteica da -80 °C e scongelare su ghiaccio.
  2. Accendere il computer e lo strumento NTA. Apri il software NTA e inizierà a inizializzarsi automaticamente.
  3. Selezionare la pompa appropriata che contiene acqua priva di particelle e fare clic su Risciacqua lo strumento per risciacquare la cella. Durante il risciacquo, iniettare 10-20 ml di acqua priva di particelle nella porta di iniezione sulla parte anteriore dello strumento utilizzando una siringa ed evitare bolle d'aria.
  4. Apparirà la schermata di controllo della qualità delle celle; fare clic su OK e inizierà il controllo della qualità delle celle. Dopo che il controllo è stato superato con successo, verrà visualizzata la schermata pop-up di autoallineamento che indica: Riempire la cella con sospensione di allineamento a 100 nm (diluizione 1:250.000).
    1. Preparare la diluizione 1 della sospensione di allineamento aggiungendo 10 ml di acqua priva di particelle e 10 μL di perle di polistirene da 100 nm a un tubo (diluizione 1:1.000). Capovolgere delicatamente per mescolare. La diluizione 1 ha una durata di conservazione di 2-3 giorni a 4 °C.
    2. Creare la diluizione 2 della sospensione di allineamento aggiungendo 20 ml di acqua priva di particelle e 80 μL di diluizione 1 (1:1.000) in un tubo per creare la diluizione di 1:250.000. Capovolgere delicatamente il tubo per mescolare. La diluizione 2 ha una durata di conservazione di 30-60 minuti a temperatura ambiente.
  5. Riempire la cella con 2 mL di diluizione 2 (1:250.000). Fare clic su OK e il programma completerà l'autoallineamento (messa a fuoco) e l'ottimizzazione della messa a fuoco. La scheda di analisi si aprirà creando un profilo che fornisce risultati della pulizia e della simmetria della cella di misura in una parabola. Apparirà una schermata pop-up che afferma: View Video Microscope è ora pronto per gli esperimenti; fare clic su OK e il programma tornerà alla scheda di controllo delle celle.
  6. Risciacquare le perle di polistirolo dalla cella iniettando acqua priva di particelle nella porta di iniezione per lavare la cella. Continuare il lavaggio fino a quando il numero di particelle rilevate è compreso tra 0-10 (di solito tra 5-10 ml). Aggiungere 1 mL di PBS filtrato da 0,22 μm per innescare la cella per il primo campione.
  7. Diluire il primo campione con PBS filtrato da 0,22 μm (iniziare con diluizione 1:1000) e inserire il fattore di diluizione nel programma. Inserire 1 mL di campione nella cella e attendere 5 minuti affinché il movimento delle particelle rallenti, poiché inizialmente si muoveranno molto rapidamente sullo schermo. Impostare la sensibilità e l'otturatore rispettivamente su 75,0 e 100.
  8. Il numero di particelle rilevate per la diluizione ideale del campione è di 50-200 particelle. Se sono riportate particelle inferiori a 50 o superiori a 200, regolare la diluizione del campione. Se è necessaria una nuova diluizione, lavare la cella con acqua priva di particelle fino a quando non vengono rilevate 0-10 particelle. Ripetere l'aggiunta del campione diluito e il lavaggio fino a trovare la diluizione ideale.
  9. Controlla tutte le 11 posizioni della telecamera per visualizzare che il movimento delle particelle è rallentato e assicurati che il numero di particelle rilevate sia simile tra tutte le posizioni della telecamera. Se il numero di particelle differisce notevolmente tra le posizioni della telecamera, aggiungere altro campione.
  10. Fare clic sulla scheda Misurazione ed eseguire l'acquisizione video. Nella scheda di acquisizione video, inserisci il nome personalizzato per il campione e identifica una posizione sicura. Seleziona le caselle di salvataggio automatico.txt e salvataggio automatico.pdf per salvare i dati.
  11. Impostare la temperatura su 25 °C, fare clic su 488 nm per impostare il laser e fare clic su 11 per le posizioni della telecamera. Fare clic su OK per eseguire la raccolta dati. Il programma inizierà ad analizzare il numero di particelle e le dimensioni in tutte le 11 posizioni. Nella scheda di analisi, verrà visualizzato un grafico a barre con diametro/nm sull'asse x e particelle/ml sull'asse y.
  12. Dopo la raccolta dei dati, verrà visualizzata una schermata pop-up intitolata Panoramica delle posizioni che fornisce i dati per ciascuna delle 11 posizioni. Se sono state rimosse più di due posizioni dall'analisi, ripetere la procedura con più campioni. In caso contrario, fare clic sul pulsante Continua . Si aprirà un file PDF e txt contenente i risultati. Salvare i file in un luogo sicuro.
  13. Per eseguire un altro esempio, passare alla scheda Controllo celle e ripetere i passaggi da 10.6 a 10.12. In tal caso, lavare la cella con acqua priva di particelle fino a quando il numero di particelle rilevate è 0-10 (circa 5-10 ml). Risciacquare la cella con 1 mL di PBS filtrato da 0,22 μm, chiudere il programma e spegnere il computer.

Risultati

Il Western blotting rivela un'adeguata separazione dei veicoli elettrici dal CCM
Per valutare l'efficacia del SEC per separare le EV dai terreni di coltura cellulare, è stata eseguita una macchia occidentale utilizzando ogni singola frazione dai campioni di controllo per sondare l'espressione dei tre marcatori EV canonici, CD9, CD63 e CD81, nonché GM130 e calnexin18, che sono stati utilizzati come controlli negativi (Figura 3). L'espressione dell...

Discussione

SEC è un metodo intuitivo per separare adeguatamente i veicoli elettrici dal CCM condizionato. Al fine di isolare specificamente le EV derivate da cellule, deve essere presa in considerazione un'attenta considerazione del tipo di CCM e dei suoi integratori. Molti terreni di coltura cellulare devono essere integrati con FBS, che contiene EV derivate dall'animale in cui è stato raccolto il siero. Queste EV sieriche possono saturare e mascherare qualsiasi segnale prodotto da EV derivate da cellule in coltura

Divulgazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Gli autori desiderano ringraziare la Penn State Behrend e la Hamot Health Foundation per i finanziamenti, nonché la Penn State Microscopy Facility di University Park, PA.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolVWR97064-588
4X Laemmli Sample BufferBioRad1610747
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mLSigma-AldrichUFC9003083 kDa cutoff
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membraneSigma-AldrichUFC2003243 kDa cutoff
Ammonium PersulfateSigma-AldrichA3678-100G
Anti rabbit IgG, HRP linked AntibodyCell Signaling Technology7074V1:1000 Dilution
Anti-Calnexin antibodyAbcam ab225951:500 Dilution
Anti-CD9 Mouse Monoclonal AntibodyBioLegend3121021:500 Dilution
Anti-GM130 antibody [EP892Y] - cis-Golgi MarkerAbcamab526491:500 Dilution
Anti-mouse IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7076V1:1000 Dilution
Automatic Fraction CollectorIzon Science
BCA assay KitBio-Rad
CCD cameraGatan Orius SC200
Cd63 Mouse anti HumanBD5560191:1000 Dilution
CD81 AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-239621:1000 Dilution
Cellstar Filter Cap Cell Culture FlasksGreiner Bio-One660175
ChemiDoc MP ImagerBioRad
Clarity Western ECL SubstrateBioRad1705061
deoxycholateSigma-AldrichD6750-10G
dithiothreitolSigma3483-12-3
DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodiumCytivaSH300022.FS
Fetal Bovine Serum Premium gradeVWR97068-085
Fetal Bovine Serum, exosome-depletedThermo ScientificA2720801
GlycineBioRad1610718
Great Value Nonfat Dry MilkAmazonB076NRD2TZ
HOG Human Oligodendroglioma Cell LineSigma-AldrichSCC163
Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pkIzon Science
Methanol >99.8% ACSVWRBDH1135-4LP
Mini-PROTEAN Glass platesBioRad1653310with 0.75mm spacers
Mini-PROTEAN Short platesBioRad1653308
NP-40Sigma-Aldrich492016
Penicillin-Streptomycin,SolutionSigma-AldrichP4458-100mL
Phosphate Buffered Saline PBSFisher ScientificBP66150
Pierce BCA Protein Assay Kits and ReagentsThermo Fisher Scientific23227
Pierce PVDF Transfer MembranesThermo Scientific88518
Pierce Western Blotting Filter PaperThermo Scientific84783
Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mLBio BasicTB0560
Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)Cell Signaling Technology5872S
Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)]ABCamab1250111:1000 dilution
Slodium hydroxideSigma-AldrichSX0603
Sodium azideFisher ScientificBP922I-500
Sodium ChlorideSigma-AldrichS9888-500G
Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pelletsSigma-Aldrich75746-1KG
TetramethylethylenediamineSigma-AldrichT9281-25ML
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10%BioRad1610183
Transmission Electron MicroscopeFEI Tecnai 12 Biotwin
TrisBioRad1610716
Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesiumCytivaSH30042.01
TunicamycinTocris3516
Zeta View softwareAnalytikNTA software

Riferimenti

  1. Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).
  2. Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).
  3. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  4. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  5. Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).
  6. Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14 (2018).
  7. Thompson, A. G., et al. Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers. Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).
  8. O'Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo. Cell Reports. 39 (2), 110651 (2022).
  9. Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
  10. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).
  11. Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).
  12. Tzaridis, T., et al. Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211 (2021).
  13. Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. Journal of Chromatography A. 1636, 461773 (2021).
  14. Gámez-Valero, A., et al. Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  15. Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
  16. Campos-Silva, C., et al. High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry. Scientific Reports. 9 (1), 2042 (2019).
  17. Norman, M., et al. L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma. Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).
  18. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  19. Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).
  20. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145 (2021).
  21. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  22. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
  23. Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 2 (12), 3239 (2007).
  24. Williams, R. L., Urbé, S. The emerging shape of the ESCRT machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).
  25. Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).
  26. Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
  27. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
  28. Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
  29. Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450 (2020).
  30. Guerreiro, E. M., et al. Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography. PLoS ONE. 13 (9), 02024276 (2018).
  31. Onódi, Z., et al. Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma. Frontiers in Physiology. 9, 1479 (2018).
  32. Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).

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