Cartografía automatizada del espacio visual de los ojos compuestos de la mosca doméstica

Resumen

El protocolo aquí describe la medición de la organización espacial de los ejes visuales de los ojos de las moscas domésticas, mapeados por un dispositivo automático, utilizando el fenómeno pseudopupil y el mecanismo de la pupila de las células fotorreceptoras.

Resumen

Este artículo describe la medición automática de la organización espacial de los ejes visuales de los ojos compuestos de insectos, que consisten en varios miles de unidades visuales llamadas ommatidia. Cada ommatidio toma muestras de la información óptica desde un pequeño ángulo sólido, con una sensibilidad distribuida gaussiana aproximada (medio ancho del orden de 1°) centrada alrededor de un eje visual. Juntos, los ommatidios recopilan la información visual de un campo de visión casi panorámico. La distribución espacial de los ejes visuales determina así la resolución espacial del ojo. El conocimiento de la organización óptica de un ojo compuesto y su agudeza visual es crucial para los estudios cuantitativos del procesamiento neuronal de la información visual. Aquí presentamos un procedimiento automatizado para mapear los ejes visuales de un ojo compuesto, utilizando un fenómeno óptico intrínseco e in vivo , el pseudopúpilo y el mecanismo de la pupila de las células fotorreceptoras. Describimos la configuración optomecánica para escanear ojos de insectos y utilizamos los resultados experimentales obtenidos de una mosca doméstica, Musca domestica, para ilustrar los pasos en el procedimiento de medición.

Introducción

La compacidad de los sistemas visuales de insectos y la agilidad de sus propietarios, que demuestran un procesamiento de información visual altamente desarrollado, han intrigado a personas de orígenes científicos y no científicos. Los ojos compuestos de insectos han sido reconocidos como potentes dispositivos ópticos que permiten capacidades visuales agudas y versátiles ^1,2. Las moscas, por ejemplo, son bien conocidas por sus respuestas rápidas a los objetos en movimiento, y las abejas son famosas por poseer visión del color y visión de polarización².

Los ojos compuestos de los artrópodos consisten en numerosas unidades anatómicamente similares, los ommatidios, cada uno de los cuales está cubierto por una lente facetaria. En Diptera (moscas), el ensamblaje de lentes facetarias, conocidas colectivamente como la córnea, a menudo se aproxima a un hemisferio. Cada ommatidium toma muestras de luz incidente desde un pequeño ángulo sólido con medio ancho del orden de 1°. Los ommatidios de los dos ojos juntos muestran aproximadamente el ángulo sólido completo, pero los ejes visuales de los ommatidios no están distribuidos uniformemente. Ciertas áreas oculares tienen una alta densidad de ejes visuales, lo que crea una región de alta agudeza espacial, coloquialmente llamada fóvea. La parte restante del ojo tiene entonces una resolución espacial más gruesa 3,4,5,6,7,8,9.

Un análisis cuantitativo de la organización óptica de los ojos compuestos es crucial para estudios detallados del procesamiento neuronal de la información visual. Los estudios de las redes neuronales del cerebro de un insecto¹⁰ a menudo requieren el conocimiento de la distribución espacial de los ejes ommatídicos. Además, los ojos compuestos han inspirado varias innovaciones técnicas. Muchas iniciativas para producir ojos artificiales bioinspirados se han basado en estudios cuantitativos existentes de ojos compuestos reales ^11,12,13. Por ejemplo, se diseñó un sensor basado en semiconductores con alta resolución espacial basado en el modelo de ojos compuestos de insectos 11,14,15,16,17. Sin embargo, los dispositivos desarrollados hasta ahora no han implementado las características reales de los ojos de insectos existentes. Las representaciones precisas de los ojos compuestos de insectos y su organización espacial requerirán datos detallados y confiables de los ojos naturales, que no están ampliamente disponibles.

La razón principal de la escasez de datos es la extrema tediosidad de los procedimientos disponibles para trazar las características espaciales de los ojos. Esto ha motivado los intentos de establecer un procedimiento de mapeo ocular más automatizado. En un primer intento de análisis automatizados de ojos compuestos de insectos, Douglass y Wehling¹⁸ desarrollaron un procedimiento de escaneo para mapear los tamaños de las facetas en la córnea y demostraron su viabilidad para algunas especies de moscas. Aquí ampliamos su enfoque desarrollando métodos no solo para escanear las facetas de la córnea, sino también para evaluar los ejes visuales de los ommatidios a los que pertenecen las facetas. Presentamos el caso de los ojos de mosca doméstica para ejemplificar los procedimientos involucrados.

La configuración experimental para escanear los ojos de los insectos es: parcialmente óptica, es decir, un microscopio con cámara y óptica de iluminación; parcialmente mecánico, es decir, un sistema de goniómetro para rotar el insecto investigado; y parcialmente computacional, es decir, el uso de controladores de software para los instrumentos y programas para ejecutar mediciones y análisis. Los métodos desarrollados abarcan una variedad de procedimientos computacionales, desde la captura de imágenes, la elección de canales de cámara y el establecimiento de umbrales de procesamiento de imágenes hasta el reconocimiento de ubicaciones de facetas individuales a través de puntos brillantes de luz reflejados desde sus superficies convexas. Los métodos de transformada de Fourier fueron cruciales en el análisis de imágenes, tanto para detectar facetas individuales como para analizar los patrones de facetas.

El documento está estructurado de la siguiente manera. Primero presentamos la configuración experimental y el fenómeno pseudopupil, el marcador óptico utilizado para identificar los ejes visuales de los fotorreceptores en ojos vivos 19,20,21. Posteriormente, se describen los algoritmos utilizados en el procedimiento de escaneo y análisis de imágenes.

Protocolo

El protocolo está de acuerdo con las pautas de cuidado de insectos de la Universidad.

1. Preparación de una mosca doméstica, Musca domestica

1. Recoger la mosca de la población criada en laboratorio. Coloque la mosca en el soporte de latón (Figura 1).
   1. Corte 6 mm de la parte superior del tubo de sujeción (ver Tabla de Materiales). La nueva parte superior del tubo tiene un diámetro externo de 4 mm y un diámetro interno de 2,5 mm (Figura 1A). Coloque la mosca viva dentro del tubo, selle el tubo con algodón para evitar dañar la mosca y empuje la mosca de tal manera que la cabeza sobresalga del tubo y su cuerpo esté restringido (Figura 1B). Inmovilizar la cabeza con cera de abeja de tal manera que los ojos permanezcan descubiertos (Figura 1C-E).
   2. Vuelva a cortar el tubo de tal manera que la longitud del tubo sea de 10 mm (Figura 1C). Coloque el tubo de plástico con la mosca en el soporte de latón, de modo que un ojo de la mosca apunte hacia arriba cuando el soporte esté apoyado en una mesa (Figura 1D, E).
2. Ajuste la orientación del tubo de tal manera que con la elevación del goniómetro a 0 ° (es decir, la etapa azimutal está en posición horizontal), el haz de iluminación vertical del microscopio sea perpendicular a la superficie del ojo en una región central, entre ventral y dorsal, y entre los bordes anterior y posterior del ojo, de modo que todo el ojo pueda escanearse dentro del rango de acimut y elevación permitido por la configuración.

2. Alineación del eje azimutal giratorio del goniómetro con el eje óptico del microscopio

1. Monte un pasador de alineación en la etapa de rotación azimutal para que la posición x-y de la punta se pueda ajustar para que coincida con el eje azimutal en la etapa motorizada. Mientras visualiza con el microscopio, equipado con un objetivo 5x, concéntrese en la punta utilizando el joystick del eje Z (Figura 2).
2. Alinee el ajuste x-y del eje azimutal con el eje óptico del microscopio y asegúrese de que los ejes rotativos de elevación y acimut estén prealineados con el pasador centrado, utilizando los joysticks de los ejes x e y.
3. Manipula los joysticks de acimut y elevación para comprobar si el pin está centrado con respecto a ambos grados de libertad. Cuando está bien centrada, la punta del pasador permanece, aproximadamente, en la misma posición durante las rotaciones de acimut y elevación.

3. Alineación del ojo de mosca con las etapas motorizadas

1. Con la etapa de elevación a 0°, monte la mosca y su soporte en la etapa azimutal. Observa el ojo de la mosca con el microscopio.
2. Con el LED de iluminación encendido, ajuste la posición horizontal de la mosca para que el centro del pseudopúplo esté alineado con el microscopio. Ajuste la posición vertical de la mosca utilizando el tornillo giratorio del soporte (Figura 1D), de modo que el pseudopúplo profundo (DPP; Figura 3) 19,20,21 se enfoca en el nivel del eje de elevación.
3. Alinee el DPP con respecto a los ejes de acimut y elevación centrándolo en el campo de visión (ver Figura 2). Use los imanes pegados a la parte inferior del soporte de la mosca para fijarlo firmemente a una placa de hierro montada en la etapa de acimut, al tiempo que permite ajustes de deslizamiento manuales.
   1. Cambie la vista a la cámara digital montada en el microscopio. Ejecute la inicialización de software del sistema GRACE, que incluye la inicialización de los controladores del motor y el controlador LED Arduino (Figura 4). Por lo tanto, abra MATLAB R2020a o una versión superior. Ejecute el script de MATLAB Initialize_All_Systems (archivo complementario 1).
4. Confirme si el pseudopúpulo de la mosca (Figura 3B, C) está en el centro de la imagen proyectada en la pantalla de la computadora.

4. Enfoque automático y autocentro

1. Llevar el foco al nivel del pseudopúplo corneal (CPP; Figura 3B) 19,20,21 manualmente mediante el joystick del eje Z.
2. Ejecute el algoritmo de enfoque automático (Archivo suplementario 1, script AF) para obtener una imagen nítida a nivel de la córnea. Compruebe devolviendo el foco al nivel DPP ajustando la etapa motorizada del eje Z. Almacene la distancia entre el DPP y el CPP (en pasos de motor).
3. Ajuste el centrado pseudopupil ejecutando el algoritmo de autocentrado (archivo complementario 1, script AC). Vuelva a centrar la atención en el nivel de CPP.
4. Vuelva a ejecutar el algoritmo de enfoque automático. Cero las etapas motorizadas en sus posiciones actuales (X,Y,Z,E,A) = (0,0,0,0,0), donde E es elevación y A es acimut.
5. Ejecute el algoritmo de escaneo (Archivo suplementario 1, script Scan_Begin), que muestrea las imágenes oculares a lo largo de las trayectorias en pasos de 5 °, mientras realiza los algoritmos de autocentrado y enfoque automático.
6. Al final del muestreo, apague el controlador LED y los controladores del motor.
7. Procese las imágenes aplicando los algoritmos de procesamiento de imágenes (Archivo Complementario 1, script ImProcFacets).

Resultados

Animales y estimulación óptica
Los experimentos se realizan en moscas domésticas (Musca domestica) obtenidas de un cultivo mantenido por el Departamento de Genética Evolutiva de la Universidad de Groningen. Antes de las mediciones, una mosca se inmoviliza pegándola con una cera de bajo punto de fusión en un tubo bien ajustado. La mosca se monta posteriormente en el escenario de un goniómetro motorizado. El centro de las dos etapas rotativas coincide con el punto focal de una configurac...

Discusión

La distribución espacial de los ejes visuales de los ojos de la mosca doméstica se puede trazar utilizando el fenómeno pseudopupil de los ojos compuestos y los cambios de reflexión causados por el mecanismo de la pupila dependiente de la luz. Por lo tanto, una mosca investigada se monta en un sistema goniométrico, que permite la inspección del patrón de faceta local con una configuración de microscopio equipada con una cámara digital, todo bajo control informático. El análisis de imágenes produce mapas ocular...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Camera	PointGrey	BFLY-U3-23S6C-C	Acquision of amplified images and digital communication with PC
High power star LED	Velleman	LH3WW	Light source for observation and imaging the compound eye
Holder for the investigated fly	University of Groningen		Different designs were manufactured by the university workshop
Linear motor	ELERO	ELERO Junior 1, version C	Actuates the upper microscope up and down. (Load 300N, Stroke speed 15mm/s, nominal current 1.2A)
Low temperature melting wax	various		The low-temperature melting point wax serves to immobilize the fly and fix it to the holder
Microscope	Zeiss		Any alternative microscope brand will do; the preferred objective is a 5x
Motor and LED Controller	University of Groningen	Z-o1	Designed and built by the University of Groningen and based on Arduino and Adafruit technologies.
Motorized Stage	Standa (Vilnius, Lithuania)	8MT175-50XYZ-8MR191-28	A 6 axis motorized stage modified to have 5 degrees of freedom.
Optical components	LINUS		Several diagrams and lenses forming an epi-illumination system (see Stavenga, Journal of Experimental Biology 205, 1077-1085, 2002)
PC running MATLAB	University of Groningen		The PC is able to process the images of the PointGrey camera, control the LED intensity, and send control commants to the motor cotrollers of the system
Power Supply (36V, 3.34A)	Standa (Vilnius, Lithuania)	PUP120-17	Dedicated power supply for the STANDA motor controllers
Soldering iron	various		Used for melting the wax
Stepper and DC Motor Controller	Standa (Vilnius, Lithuania)	8SMC4-USB-B9-B9	Dedicated controllers for the STANDA motorized stage capable of communicating with MATLAB
Finntip-61	Finnpipette Ky, Helsinki	FINNTIP-61, 200-1000μL	PIPETTE TIPS FOR FINNPIPETTES, 400/BOX. It is used to restrain the fly
Carving Pen Shaping/Thread Burning Tool	Max Wax		The tip of the carving pen is designed to transfer wax to the head of fly
MATLAB	Mathworks, Natick, MA, USA	main program plus Image Acquisition, Image Analysis, and Instrument Control toolboxes.	Programming language used to implement the algorithms