Uso de pinzas ópticas duales y microfluídica para estudios de moléculas individuales

Resumen

La bioquímica visual de una sola molécula estudiada a través de cámaras microfluídicas se facilita enormemente utilizando barriles de vidrio, jeringas herméticas al gas, conexiones estables de tubos a células de flujo y eliminación de burbujas mediante la colocación de válvulas de conmutación entre las jeringas y el tubo. El protocolo describe trampas ópticas duales que permiten la visualización de transacciones de ADN e interacciones intermoleculares.

Resumen

La bioquímica visual es una técnica poderosa para observar las propiedades estocásticas de enzimas individuales o complejos enzimáticos que están oscurecidos en el promedio que tiene lugar en los estudios de fase masiva. Para lograr la visualización, las pinzas ópticas duales, donde una trampa es fija y la otra es móvil, se enfocan en un canal de una cámara microfluídica multiflujo colocada en el escenario de un microscopio de fluorescencia invertida. Las pinzas ópticas atrapan moléculas individuales de ADN marcado fluorescentemente y el flujo de fluido a través de la cámara y más allá de las perlas atrapadas, estira el ADN a forma B (bajo una fuerza mínima, es decir, 0 pN) con el ácido nucleico que se observa como una cuerda blanca contra un fondo negro. Las moléculas de ADN se mueven de una corriente a la siguiente, traduciendo la etapa perpendicular al flujo para permitir el inicio de reacciones de manera controlada. Para lograr el éxito, los dispositivos microfluídicos con canales ópticamente claros se acoplan a jeringas de vidrio que se mantienen en su lugar en una bomba de jeringa. Los resultados óptimos utilizan conectores permanentemente unidos a la celda de flujo, tubos que son mecánicamente rígidos y químicamente resistentes, y que están conectados a válvulas de conmutación que eliminan las burbujas que prohíben el flujo laminar.

Introducción

La capacidad de visualizar las interacciones proteína-ADN a nivel de molécula única y en tiempo real ha proporcionado información significativa sobre la estabilidad del genoma ^1,2. Además de trabajar con moléculas individuales de ADN de una en una, la capacidad de ver las transacciones entre moléculas individuales cercanas proporciona información adicional ^3,4,5. La manipulación de moléculas de ADN adicionales requiere tanto trampas ópticas adicionales como células de flujo microfluídico multicanal de alta calidad⁶.

Hay varios métodos disponibles para generar más de una trampa óptica. Estos incluyen espejos de escaneo galvanómetro, moduladores ópticos acústicos y óptica difractiva, que generan pinzas ópticas holográficas 4,7,8,9. A menudo, los espejos de escaneo y los moduladores ópticos acústicos producen trampas de tiempo compartido. En la configuración descrita aquí, el haz de un solo láser Nd: YAG se divide en la polarización, y luego los espejos de escaneo láser del galvanómetro controlan la posición de lo que se denomina la trampa móvil (Figura 1) ⁴. Para facilitar el posicionamiento de espejos y filtros para dirigir el haz de atrapamiento a la abertura posterior del objetivo del microscopio, se utiliza un láser HeNe. Esto facilita la alineación general, ya que el haz HeNe es visible a simple vista, mientras que los rayos infrarrojos no lo son. El haz HeNe también es más seguro para trabajar con lo que hace que el posicionamiento de los espejos y otros componentes sea menos estresante. Inicialmente, la trayectoria del haz para este láser está separada del haz de 1064 nm, pero se introduce en la misma trayectoria del haz y luego en el objetivo del microscopio. Una vez que se logra la alineación física, se realiza el posicionamiento del haz de 1064 nm en la parte superior del haz HeNe y esto se facilita mediante el uso de un visor infrarrojo y varias herramientas de imágenes de haz para visualizar la posición y la calidad del haz. Luego, se introduce el expansor de haz y el haz infrarrojo expandido resultante se alinea en la abertura posterior del objetivo. Finalmente, se retira el objetivo y la potencia en cada haz polarizado se mide y ajusta utilizando placas de onda λ/2 para que sea igual (Figura 1C). Las mediciones de potencia también se realizan una vez que se devuelve el objetivo y, por lo general, hay una pérdida de potencia del 53%. Sin embargo, hay suficiente potencia para formar trampas ópticas fijas y móviles estables en el plano focal (Figura 1D).

Para obtener imágenes de las transacciones de ADN, las células de flujo microfluídico desempeñan un papel clave, ya que permiten mediciones controladas a nivel de molécula única con alta resolución espacial y temporal (Figura 2). El término microfluídico se refiere a la capacidad de manipular fluidos en uno o más canales con dimensiones que van desde 5-500 μm^10,11. El término corriente se refiere al fluido real dentro de un canal y el canal se refiere al canal físico en el que se mueve una corriente o corrientes de fluido. El diseño de celda de flujo de un solo canal tiene un canal físico común donde se observan las reacciones y, por lo general, solo hay una corriente de fluido presente. Por lo tanto, estos diseños se conocen como células de flujo de flujo único. En contraste, las células de flujo múltiple se definen como un dispositivo microfluídico en el que dos o más canales de entrada convergen en un solo canal físico común (Figura 2A). Dentro del canal común, las corrientes de fluido que se originan en los canales individuales fluyen paralelas entre sí, y permanecen separadas con una mezcla mínima entre ellas debido a la difusión (Figura 2B). En la mayoría de las configuraciones experimentales, una sola bomba empuja fluidos en cada canal a la misma velocidad. Por el contrario, cuando se utiliza la dirección límite, tres o más bombas controladas independientemente empujan los fluidos a través de los canales. Sin embargo, cada bomba funciona a una velocidad diferente, pero el caudal neto en el canal común es constante¹². Esto permite el intercambio rápido de los componentes del canal principal simplemente alterando la velocidad de la bomba.

Además del flujo laminar, otro factor crítico es el perfil de velocidad parabólica dentro de la corriente de fluido laminar. La velocidad de flujo más alta ocurre en el medio de la corriente y la más lenta ocurre junto a las superficies (Figura 2C)¹³. Se debe considerar que este perfil estira completamente una molécula de ADN que está unida a una cuenta sostenida en la corriente para una visualización precisa del ADN fluorescente y análisis precisos de una sola molécula. Aquí, el ADN se estira a la forma B y se mantiene en su lugar bajo 0 pN de fuerza. Para lograr esto, el enfoque de la posición de la trampa óptica debe ser a una posición de 10-20 μm de la superficie del cubreobjetos inferior (Figura 2D). Se debe tener cuidado para que la molécula de ADN no se estire más allá de la forma B, ya que esto puede inhibir las reacciones enzimáticas. En condiciones típicas de amortiguación, 1 μm = 3.000 pb de ADN¹⁴. Además, al atrapar 10-20 μm del cubreobjetos, el complejo de ADN se coloca lejos de la superficie, minimizando así las interacciones superficiales.

Se han utilizado muchos métodos para crear canales de dispositivos microfluídicos y estos se pueden hacer en el laboratorio o las células de flujo se pueden comprar de fuentes comerciales 6,15,16,17. Los materiales óptimos utilizados para construir las células de flujo deben ser mecánicamente rígidos, ópticamente transparentes con baja fluorescencia e impermeables a los disolventes orgánicos⁶. Con frecuencia, el vidrio flotado de borosilicato o sílice fundida se utilizan para proporcionar un entorno de flujo estable durante un tiempo prolongado que es adecuado para la captura óptica, la visualización y la detección de fuerza. Estos materiales también permiten el uso de solventes no acuosos (por ejemplo, metanol de grado espectrofotométrico) para simplificar la humectación de la superficie y la eliminación de burbujas de aire, y desnaturalizantes (por ejemplo, clorhidrato de guanidinio 6M) o detergentes para limpiar la celda de flujo. Finalmente, los métodos utilizados para introducir fluidos en las celdas de flujo varían desde complejos sistemas de bombas de vacío hasta bombas de una sola jeringa 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. En el enfoque descrito aquí, se utiliza una bomba de jeringa que puede acomodar hasta 10 jeringas (Figura 3A). Esto proporciona flexibilidad para usar celdas de flujo de un solo canal o celdas de flujo con múltiples canales de entrada. Aquí, se utiliza una celda de flujo de tres canales y se acopla a jeringas mantenidas en su lugar en la bomba de jeringa utilizando tubos de poli-éter-éter-cetona (PEEK) (Figura 3A-C). El flujo de fluidos es controlado por válvulas de conmutación de cuatro vías y, por lo tanto, sirven para minimizar la introducción de burbujas en la celda de flujo (Figura 3A, D). Además, se recomiendan las jeringas estancas al gas Hamilton que tienen paredes de vidrio rígido y émbolos recubiertos de politetrafluoroetileno (PTFE), ya que proporcionan un movimiento de émbolo excepcionalmente suave que es esencial para obtener un flujo suave^14,27.

En el sistema experimental descrito, se han utilizado células de flujo con dos a cinco canales de entrada. El número de canales de entrada está dictado por el experimento que se está realizando. Para el estudio de RecBCD y Hop2-Mnd1, dos canales de corriente fueron suficientes^14,28. Para la helicasa, la enzima se unió al extremo libre del ADN y se tradujo en una corriente que contiene magnesio y ATP para iniciar la translocación y el desenrollamiento. Para Hop2-Mnd1, el ADN atrapado ópticamente se tradujo en la corriente de fluido adyacente que contiene proteínas y amortiguador ± iones metálicos divalentes. El uso de células de flujo de tres canales permite atrapar el ADN en la corriente 1, traducir el ADN en la corriente 2 para permitir que ocurra la unión a las proteínas, y luego a la corriente 3 donde el ATP está presente, por ejemplo, para iniciar reacciones. Una variación de lo anterior es usar proteína marcada con fluorescencia en el canal 2, lo que hace que la corriente de fluido sea completamente blanca e impide la visualización del ADN. Cuando esta molécula se traduce en la corriente 3, tanto las proteínas como el ADN son ahora visibles cuando se inician las reacciones.

El uso de válvulas de conmutación de cuatro vías para controlar el flujo de fluido es un componente crítico del sistema para eliminar las burbujas en las celdas de flujo. Las burbujas son perjudiciales para el flujo estable de fluidos, ya que se contraen y expanden de manera impredecible, lo que resulta en cambios rápidos en la velocidad del flujo y la introducción de turbulencias. Cuando las válvulas se colocan entre las jeringas y el tubo de entrada, la trayectoria del flujo se desconecta cambiando la posición de la válvula cuando se cambian las jeringas. Cuando se coloca la nueva jeringa, el émbolo se puede presionar manualmente para expulsar >6 μL (el volumen muerto de la válvula) y esto elimina las burbujas casi por completo.

La fijación de conectores a las celdas de flujo es con frecuencia el paso limitante de la velocidad en el uso de la celda de flujo. Describimos el uso de dos tipos de conectores: extraíbles conocidos como press-fit y permanentes (conjuntos de nanopuertos). Los conectores extraíbles son fáciles de adherir a una celda de flujo y se pueden probar diferentes tipos de tubos flexibles además del PTFE recomendado con estos conectores. Esta es una forma rápida y rentable de probar tubos y conectores sin sacrificar celdas de flujo de vidrio más caras. En contraste, los ensamblajes de nanopuertos están unidos permanentemente, soportan presiones de hasta 1,000 psi y, en nuestras manos, su uso está restringido a tubos PEEK de diferentes diámetros. Esto no es una desventaja, ya que preferiblemente se utiliza un tubo PEEK. Una sola celda de flujo de vidrio con ensamblajes permanentes unidos se puede reutilizar durante más de 1 año con un uso cuidadoso.

Protocolo

1. Alineación y prueba de trampas láser con perlas de poliestireno

NOTA: Para la configuración, consulte la Figura 1A,B.

PRECAUCIÓN: El experimentador debe usar gafas protectoras adecuadas o gafas de seguridad láser durante la alineación del rayo láser. Como el sistema de pinzas ópticas descrito en este documento utiliza haces HeNe e IR, se requieren dos juegos separados de cristalería de seguridad láser.

1. Alineación del haz HeNe
   1. Coloque todos los componentes ópticos en la placa de pruebas. Alinee la placa de pruebas para que esté lo más cerca posible de un ángulo de 90° en relación con el microscopio.
   2. Conecte el tubo de acoplamiento que contiene el objetivo y la lente telen al microscopio (Figura 1A-11,12).
      NOTA: La lente telan es un sistema de lente que se utiliza para enfocar la imagen en el plano intermedio de la imagen en los oculares.
   3. Encienda el láser HeNe y abra el obturador (Figura 1A-18). El haz debe golpear el filtro (Figura 1A-3) a una altura de 54 mm reflejando el 50% de la luz en el espejo 5 (Figura 1A-5). El 50% restante del haz golpea el espejo 4 (Figura 1A-4) a la misma altura que el espejo 3.
   4. Ajuste el espejo 4 (Figura 1A-4) para que el haz golpee el espejo 6 (Figura 1A-6) a una altura de 51 mm.
   5. Ajuste el espejo 6 (Figura 1A-6) para que el haz se dirija al espejo galvánico inferior a una altura de 51 mm. El haz que sale del espejo galvánico superior será de 57,5 mm.
   6. Ajuste el espejo 3 (Figura 1A-3) para que este haz incida en el espejo 5 (Figura 1A-5) a una altura de 57,5 mm. Una vez reflejado en el espejo 5, el haz debe golpear el espejo 9 (Figura 1A-9) a la misma altura. El haz se recombina efectivamente en el espejo 9, pasa a través del objetivo y el sistema de lentes telan en el espejo 21 (Figura 1A-21), que lo refleja en el objetivo.
   7. Coloque un portaobjetos de microscopio limpio sobre el escenario del microscopio. Encienda la cámara e imagenee los haces de los haces fijos y de escaneo individualmente en la pantalla. Comenzando con el espejo 3, luego 5 y 9, finalmente 21, realice pequeños ajustes para colocar el haz fijo en el centro de la pantalla.
   8. Para asegurarse de que el ángulo del haz que sale del espejo 21 sea de 90°, modifique la altura Z del microscopio y coloque el haz fotografiado en las superficies superior e inferior del portaobjetos. Cuando son idénticos, el haz está en la posición correcta, que es perpendicular al escenario. Obture este haz usando el obturador 19 (Figura 1A-19).
   9. Comenzando con los espejos 4 y 6, realice pequeños ajustes para colocar el haz fijo en el centro de la pantalla. Obturar este haz.
2. Alineación del haz infrarrojo (IR)
   PRECAUCIÓN: Realice todos los pasos a baja potencia láser por razones de seguridad.
   1. Ajuste la placa de onda 14 (Figura 1A-14) para ajustar la relación de haces transmitidos y reflejados que se dividen en el divisor de haz 2 (Figura 1A-2). El divisor de haz 2 refleja el componente s del rayo láser y transmite el componente p.
   2. El haz que pasa a través de 2, golpea el espejo 7 (Figura 1A-7), que desvía el haz hacia el espejo galvánico inferior. Debe seguir la trayectoria del haz HeNe en el espejo 21. Realiza pequeños movimientos del espejo 7 para lograr este posicionamiento.
   3. Ajuste el espejo 2 para que el haz reflejado por el espejo 2 golpee el espejo 10 (Figura 1A-10) a una altura de 57,5 mm.
   4. El haz se refleja desde el espejo 10 sobre el espejo 8 (Figura 1A-8) a una altura de 57,5 mm. El haz posterior debe golpear el espejo 9 a la misma altura. Si no es así, haga pequeños ajustes en los espejos 10 y 8 según sea necesario.
   5. Retire el objetivo y coloque la cabeza del medidor de potencia sobre el puerto en la torreta del objetivo.
   6. Utilice las placas 14, 15 y 16 (Figura 1A-14,15,16) para ajustar la potencia de cada rayo láser de modo que sean iguales como se muestra en la Figura 1C.
   7. Coloque el expansor de haz 1 (Figura 1A-1) en su lugar. Ajuste el rayo láser expandido para que sea circular sin coma ni astigmatismo.
   8. Para probar las trampas ópticas, haga una solución de perlas de poliestireno de 1 μm suspendidas en agua. Luego, coloque 10 μL de esta solución en un portaobjetos de microscopio, coloque un cubreobjetos en la parte superior y selle con esmalte de uñas. Coloque el portaobjetos en la platina del microscopio y pruebe las trampas ópticas atrapando estas perlas de 1 μm. Asegúrese de que las cuentas sean aspiradas por las trampas y mantenidas de manera estable cuando se mueva el escenario. La captura debe ocurrir de manera igualmente eficiente desde todos los lados de la trampa.

2. Preparación de la cámara microfluídica

1. Si la celda de flujo es un dispositivo construido comercialmente hecho de polidimetilsiloxano (PDMS) en un cubreobjetos, continúe con el paso 3. Si se trata de un dispositivo de vidrio con conectores conectados, continúe con el paso 4.
2. Si la celda de flujo no tiene conectores conectados, conéctelos primero a los orificios de entrada en el portaobjetos del microscopio. Consulte el paso 3 para conocer los pasos para conectar conectores.

3. Conexiones de celda de flujo utilizando una celda de flujo PDMS

NOTA: Para la configuración, consulte la Figura 2D.

1. Coloque la celda de flujo sobre una superficie plana y limpia. Sostenga el tubo de PTFE a 3 mm del extremo libre con pinzas. Empuje el tubo en el puerto preformado (el puerto puede soportar una presión de línea de 2 bar).
2. Repita este procedimiento para cada uno de los puertos restantes. Conecte los puertos de entrada a la bomba de jeringa y la salida a una botella de residuos (Figura 4A, B).
3. Llene cada jeringa de vidrio con 1 ml de metanol de grado espectrofotométrico. Conecte cada jeringa a una válvula conmutadora. Asegúrese de que la válvula tenga la salida dirigida a los residuos y purgue cada línea con 50 μL de metanol (Figura 4C, posición cerrada).
4. Cambie la posición de salida a la celda de flujo (Figura 4C, posición abierta). Bombear 800 μL de metanol a través de la celda de flujo a un caudal de 100 μL/h para humedecer las superficies y eliminar burbujas.
5. Al día siguiente, repita este proceso utilizando 800 μL de agua ultrapura. La celda de flujo ya está lista para su uso.

4. Fijación de conectores de tubos de ajuste a presión

NOTA: Para la configuración, consulte la Figura 2F.

1. Si se van a utilizar conectores de tubería de ajuste a presión, retire con cuidado la cinta adhesiva de un lado del conector y colóquela sobre el orificio en el portaobjetos del microscopio. Presione hacia abajo durante unos segundos. Repita el proceso para los conectores restantes.
2. Coloque la celda de flujo sobre una superficie plana y limpia. Sostenga el tubo de PTFE a 3 mm del extremo libre con pinzas. Empuje el tubo en el orificio preformado en el puerto y repita este procedimiento para cada uno de los puertos restantes.
3. Conecte el tubo de las entradas a las válvulas de conmutación. Continúe con el paso 7.

5. Fijación de asambleas permanentes

NOTA: Para la configuración, consulte la Figura 2A-C.

1. Realice la fijación en una superficie limpia y plana o en un colector personalizado para mantener la celda de flujo y los conectores en su lugar mientras se produce la unión.
2. Coloque la celda de flujo sobre una superficie plana limpia o en la sección empotrada del colector (Figura 2B). Coloque una pequeña cantidad de pegamento de vidrio en la parte inferior del conjunto e inserte el sello.
3. Coloque el nanopuerto sobre uno de los orificios de entrada en el portaobjetos del microscopio. Empuje suavemente hacia abajo y manténgalo en su lugar sin movimiento lateral. Repita el proceso para los puertos restantes.
4. Dejar secar o sujetar en su lugar en el colector. Retire suavemente la celda de flujo del colector y asegúrese de que los conjuntos se alineen bien con los puertos de entrada en la celda de flujo. Continúe con el paso 7 cuando esté listo.

6. Conexiones y preparación de células de flujo

NOTA: Para la configuración, consulte la Figura 4A,B.

1. Coloque una celda de flujo en la etapa del microscopio. Conecte el tubo con los conectores apretados para los dedos.
2. Llene cada jeringa de vidrio con 1 ml de metanol de grado espectrofotométrico. Conecte cada jeringa a una válvula conmutadora. Asegúrese de que la válvula tenga la salida dirigida a los residuos y purgue cada línea con 50 μL de metanol (Figura 4C, posición cerrada).
3. Cambie la posición de salida a la celda de flujo (Figura 4C, posición abierta). Bombear 800 μL de metanol a través de la celda de flujo a un caudal de 100 μL/h para humedecer las superficies y eliminar burbujas.
4. Al día siguiente, repita este proceso utilizando 800 μL de agua ultrapura. La celda de flujo ya está lista para su uso.

7. Control del flujo de fluido

1. Gire las válvulas de conmutación a la posición cerrada (Figura 4C). Retire las jeringas, deseche el agua residual y llene las jeringas con soluciones experimentales, por ejemplo, perlas de ADN; enzima; y ATP. Devuelva las jeringas a la bomba y conéctelas a las válvulas de conmutación.
2. En esta posición, fuerce manualmente los émbolos hacia abajo 5-10 μL para eliminar cualquier burbuja. Cambie la posición de la válvula de conmutación a Abrir.
3. Utilice el esquema de caudal para lograr una velocidad de flujo de fluido óptima para el atrapamiento y la visualización como se describe en la Tabla 1. El flujo de fluido óptimo para la captura óptica debe permitir la captura estable de perlas y una vez que el ADN se estira, debe ser en forma B (~ 3,000 pb / μm).

8. Captura de perlas de poliestireno con moléculas individuales de ADN unidas

1. Con un aumento de 10x, ubique el borde entre las corrientes de fluido cerca de los puntos de entrada del canal. Agregue aceite al objetivo 100x y cambie al aumento más alto.
2. Abra las persianas de las trampas ópticas (ambas o una a la vez). Los rayos láser enfocados deben atrapar cuentas y el ADN debe estirarse inmediatamente.
3. Una vez que un complejo ha quedado atrapado, traduzca la etapa perpendicular al flujo (Figura 3A,C, recuadro). Esto moverá el complejo atrapado de la solución de perlas de ADN a la corriente 2. Una traducción adicional moverá el complejo a la corriente 3.

9. Limpieza de células de flujo

NOTA: Realice esto diariamente.

1. Apague la bomba cuando finalice el experimento. Gire las válvulas de conmutación a la posición cerrada (Figura 4C).
2. Retire las jeringas y vacíelas. Enjuague tres veces con agua destilada filtrada.
3. Llene las jeringas con solución limpiadora. Coloque las jeringas en la bomba y conéctelas a las válvulas de conmutación.
4. Purgue las válvulas de conmutación y cambie la posición para abrir. Bombee 800 μL de solución de limpieza a un caudal de 100 μL/h normalmente durante la noche.
5. Al día siguiente, cierre las válvulas de conmutación y luego retire y enjuague las jeringas con agua. Enjuague la celda de flujo y las líneas con 4-800 μL de agua a un caudal de 400-800 μL/h. Si se requiere una limpieza más extenuante de las células de flujo, reemplace la solución de limpieza con clorhidrato de guanidio 6 M.

Resultados

La prueba inicial de la alineación y resistencia de la trampa se realiza con perlas de poliestireno no fluorescentes de 1 μm. Dado que la mayor parte de la investigación realizada en el laboratorio utiliza fluorescencia, probamos aún más la resistencia de la trampa utilizando perlas de poliestireno verde dragón de 1 μm (Figura 1D, E). Posteriormente, el trabajo cambia a la captura óptica de complejos ADN-perla donde el ADN se tiñe con el colorante intercalante bis-Y...

Discusión

El montaje cuidadoso del sistema de flujo es fundamental para el resultado exitoso de los experimentos ^4,6. Uno de los aspectos más desafiantes del protocolo es la fijación de conectores a la superficie del vidrio. Para ello, utilizamos los dos enfoques siguientes: conectores de tubos de ajuste a presión y conjuntos de nanopuertos. Los conectores de ajuste a presión se adhieren fácilmente al vidrio seguido de empujar el tubo de PTFE en los orificios preforma...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x objective	Leica	506318 or 506038	Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging
10X Objective	Leica	506263	Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell
1 mm fluorescent beads	Bangs Labs	FSDG004	Used for tap performance, focal position determination
1 mm polystyrene beads	Bangs Labs	CPO1004	Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules
63x objective	Leica	506081	Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens
Alignment laser	Lumentum	1100 series	10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics
Beam alignment camera	Amscope	MU303	A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position
Camera control and Image capture software	Hamamatsu	HCImage	Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching
Camera; Orca flash 4	Hamamatsu	c13440-20cu	CCD camera for imaging of single-molecule experiments
C-mount for the beam alignment camera	Spot imaging solutions	DE50CMT	Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment
C-mount for the Orca Flash 4 camera			Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.
Cy5  fluorescence filter cube	Semrock	cy5-404a-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only
Fitc-Txred  fluorescence filter cube	Semrock	fitc/txred-2x-b-000	Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed
Fluidics tubing	Grace Bio	46004	PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used
GFP fluorescence filter cube	Semrock	gfp-3035b-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only
Glass flow cells	Translume	Custom	Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)
Glass glue	Loctite	233841	Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells
Glass/PDMS sandwich flow cells	CIDRA Precision services	Custom design	Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)
Hamilton Cleaning solution	Hamilton	18311	Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully
Illumination system	Sutter Instrument	Lamda DG4	Discontinued so recommend Lambda 721
Illumination system	Sutter Instrument	Lamda DG4	Discontinued so recommend Lambda 721
Image analysis software	Media cybernetics	Image Pro Premiere	Analysis of images and single molecule tracking
Image analysis software	Fiji/NIH Image/Image J	Shareware	Analysis of images and single molecule tracking
Image display card	Melles Griot	06 DLA 001	Alternate product from Thorlabs: VRC5
Immersion oil	Zeiss	444960	Immersol 518 F fluorescence free
Laser beam alignment tools	Thor labs	FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1	Used to ensure beams are horizontal and at the correct height
Laser beam viewer	Canadian Photonics labs	IR 3150	Used to image IR beam spots on mirrors and  targets
Laser power meter	Thor labs		Measurement of laser output as well as trap strength
Laser safety glasses (HeNe)	Thor labs	LG7 or 8	Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm
Laser safety glasses (IR)	Thor labs	LG11	Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm
Mcherry  fluorescence filter cube	Semrock	mcherry-a-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only
Microscope	Leica	DMIRE2	DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror
Microscope control software	UCSF/shareware	uManager	Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control
Nanoport assembly	IDEX	N333	Connectors that are bonded to flow cells
Optical table support	Thor Labs	PA52502	Active isolation table support
Optics and lenses	Solar TII	Various	Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system
PDMS flow cells	ufluidix	Custom	Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)
PEEK tubing	IDEX	1532	Provides excellent connection to flow cells and switching valves
Pinkel fluorescence filter cube	Semrock	lf488/543/635-3x-a-000	Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly
Press fit tubing connectors	GraceBio	46003	Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass
Scanning mirrors	GSI Lumonics	VM500	Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific
Stage	Leica
Stage micrometer	Electron Microscopy Sciences	68042-08	Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration
Switching valves	IDEX	V-101T	Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells
Syringe and valve manifold	Machine shop	None	Custom built
Syringe pump	Harvard Apparatus	PHD 2000	Controls fluid flow through flow cells
Syringe pump software	Harvard Apparatus	70-6000	Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow
Syringes	Hamilton	81320	Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers
Table top	Thor Labs	T36H	Optical table top or breadboard
Trapping laser	Newport/Spectra Physics	J-series; BL106C	Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser