根尖腸管モデルにおけるルシファーイエローを用いた腸透過性の決定

要約

本プロトコルは、腸透過性を決定するために頂端外腸介様モデルにおいてルシファーイエローを利用する方法を概説する。この方法は、壊死性腸炎などの炎症性腸疾患をモデル化するエンテロイドにおける傍細胞透過性を決定するために使用することができる。

要約

エンテロイドは、壊死性腸炎(NEC)などの炎症性腸疾患の研究における新たな研究ツールです。それらは伝統的に、上皮細胞の頂端表面が内腔に面する基底外側外側(BO)立体配座で成長しています。このモデルでは、治療と実験のためにエンテロイドの管腔表面にアクセスすることは困難であり、宿主と病原体の相互作用を研究する能力が制限されています。これを回避するために、壊死性腸炎の新生児頂端アウト(AO)モデルが作成されました。腸管上皮細胞透過性の変化はNECにとって病的であるため、このプロトコルでは、細胞透過性のマーカーとしてルシファーイエロー(LY)を使用することを概説しています。LYは、3つの主要な傍細胞経路(孔、漏れ、および無制限) すべてを介して 腸上皮バリアを通過します。AOモデルでLYを使用すると、NECの透過性をより広く研究できます。IRBの承認と親の同意に続いて、腸組織の外科的サンプルがヒトの早産児から収集されました。腸幹細胞は陰窩分離 によって 採取され、エンテロイドの増殖に使用されました。エンテロイドは成熟するまで成長した後、AOを形質転換するか、BOコンフォメーションのままにしました。これらは、処理されていない(対照)か、リポ多糖(LPS)で処理され、 in vitro NECの誘導のために低酸素条件にかけられた。LYは透過性を評価するために使用されました。頂端タンパク質帯閉塞-1および基底外側タンパク質β-カテニンの免疫蛍光染色により、AO立体構造が確認された。LPSおよび低酸素で処理されたAOおよびBOエンテロイドは、対照と比較して有意に増加した傍細胞透過性を示した。AOエンテロイドとBOエンテロイドの両方が、対照と比較して、処理されたエンテロイドの内腔へのLYの取り込みの増加を示しました。AO腸様モデルにおけるLYの利用は、傍細胞透過性の3つの主要な経路すべての研究を可能にする。さらに、宿主と病原体の相互作用の調査と、これがBO腸介類モデルと比較して透過性にどのように影響するかを調べることができます。

概要

エンテロイドは、臓器制限ヒト腸管幹細胞に由来する3次元(3D)構造^である1,2。それらは完全に上皮系譜で構成されており、分化した腸上皮細胞タイプ²をすべて含んでいます。エンテロイドはまた、内部コンパートメントを形成する頂端管腔表面と周囲の媒体に面する基底外側表面からなる細胞極性を維持する。エンテロイドは、それらが生成された宿主の特性を保持するという点でユニークなモデルです³。したがって、未熟児のヒト乳児から生成されたエンテロイドは、壊死性腸炎(NEC)など、主にこの集団に影響を与える疾患の調査に役立つモデルを表しています。

従来の腸管モデルは、基底外側(BO)コンフォメーションで成長し、腸管は基底膜マトリックス(BMM)のドームに包まれています。BMMは、基底外側表面が外側にある3D構造を維持するように腸管を誘導します。BOエンテロイドは、2次元(2D)初代ヒト細胞株とin vivo動物モデルの間のギャップを埋めるNECに適したモデル^です2,4。NECは、LPSや細菌などの病原体をエンテロイド周囲の培地に入れ、続いて低酸素条件に曝露することによってエンテロイドに誘導されます^2,3。BO腸内NECモデルの課題は、in vivoで頂端表面で発生する宿主と病原体の相互作用の効果的な研究を可能にしないことです。腸透過性の変化は、これらの宿主 - 病原体相互作用によるものである。透過性が疾患の病態生理学的根拠にどのように影響するかをよりよく理解するためには、頂端表面の治療を含むモデルを作成する必要があります。

Coらは、 成熟したBOエンテロイドがBMMドームを除去し、それらを培地⁵に再懸濁することによって頂端アウト(AO)コンフォメーションを形成するように誘導され得ることを最初に実証した。この記事は、AOエンテロイドが正しい上皮極性を維持し、すべての腸細胞タイプを含み、腸上皮バリアを支持し、頂端表面へのアクセスを可能にすることを実証^{しました5}。AOエンテロイドをNECモデルとして使用することで、疾患プロセスの生理学的再現と宿主-病原体相互作用の研究を実現します。

NECの病態生理学への主要な寄与の1つは、腸透過性の増加です⁶。インビトロ⁷で腸透過性を試験する方法として、いくつかの分子が提案されている。これらのうち、ルシファーイエロー(LY)は、それぞれ428nmおよび540nmに励起および発光ピークを有する親水性色素^{である8。}すべての主要な傍細胞経路を通過するため、血液脳および腸上皮バリアを含むさまざまなアプリケーションで傍細胞透過性を評価するために使用されてきました^8,9。LYの伝統的な用途は、半透性表面¹⁰上で単層で増殖した細胞を使用する。LYは頂端表面に塗布され、傍細胞タイトジャンクションタンパク質を交差して基底外側に集まります。基底外側コンパートメントにおけるより高いLY濃度は、タイトジャンクションタンパク質の減少とそれに続く腸上皮細胞バリアの破壊および透過性の増加を示しています¹⁰。また、LYを培地に追加し、個々のエンテロイドを内腔¹¹へのLYの取り込みのために画像化した3D BO腸内モデルでも説明されています。これにより、LY取り込みの可視化による定性分析は可能になりますが、定量分析は限られています。このプロトコルは、3D配向を維持しながら、AOエンテロイドのin vitroNEC腸内モデルを使用して傍細胞透過性を評価するためにLYを使用する独自の技術を概説します。この方法は、透過性の定性的および定量的分析の両方に使用できます。

プロトコル

本研究は、オクラホマ大学の治験審査委員会の承認(IRB、#11610、11611)に準拠して実施されました。IRB仕様に従って人間の手術検体を収集する前に、保護者の同意が必要でした。IRBの承認と親の同意に続いて、ヒト小腸組織は、NECまたはストーマ切除や閉鎖修復などの他の腸切除の手術を受けている乳児(サンプル収集時に36〜41週の範囲の矯正妊娠期間(GA)であり、すべて推定GA25〜34週、2:1 M:Fの早産の病歴がある)から取得されました。エンテロイドは、空腸または回腸のいずれかから得られた組織から生成した。

1.ヒト乳児由来の腸管培養:全組織からの陰窩分離とメッキ

1. 前回の報告⁴に続いて、培養培地、キレートバッファー#1、およびキレートバッファー#2(表1)を準備します。キレートバッファーは4°Cで保存し、48時間以内に使用します。
2. ヒトミニガット培地を準備します(表1)。使用前にストックを-20°Cで保管し、37°Cの水浴で温めてください。
3. 50%L-WRNコンディショニング培地(CM)を準備します(表1)。ストックを4°Cで最大1週間保管します。
   注:馴化培地の100%L-WRN塩基は、Miyoshiらによるプロトコルに記載されています¹²。
4. 前回の報告⁴に続く手術標本から得られた小腸組織サンプルからエンテロイドを作製する。腸組織0.75〜2.5g片から24ウェルプレートにエンテロイドの4ウェルをプレート化する。
   注:エンテロイドは、30 mLのロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培地に50 mLのコニカルチューブで4°Cで最大48時間保存した組織から正常に生成できます。
5. 24ウェルプレートを37°C、5%_CO2 インキュベーターに逆さまに15〜20分間入れて、BMMドーム⁴の重合を可能にします。
6. 500 μLの50%L-WRN CM(ステップ1.3に記載)と0.5 μLのY-27632、ROCK阻害剤(RI、 材料の表を参照)を各ウェルに追加します。2〜3日後、RIを含まない50%L-WRN CMと交換します。

2. AOエンテロイドの創製

1. BMMに埋め込まれたエンテロイドを50%L-WRN^{CM 4}で7〜10日間成長させます。
2. 培地を取り出し、500 μLの細胞回収溶液(CRS、 材料表を参照)を1つのウェルに加えます。ドームをこすり、ピペットで上下に数回動かしてから、CRS /エンテロイド/ BMM溶液を次のウェルに追加します。
3. ドームをこすり、ピペットで上下に数回動かし、溶液をマイクロ遠心チューブに入れます。500 μLのCRSを2番目のウェルに加え、ピペットで上下に動かしてから、最初のウェルに追加します。この溶液を同じ1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。
4. 手順2.3を繰り返し、すべてのウェル内容物がCRSになるまで、2つのウェルを1つの微量遠心チューブにプールします。
   注:大量のAOエンテロイドを生成する場合は、2つ以上のウェルを1つの大きな15 mLコニカルチューブにプールできます。ウェルあたり500 μLのCRS比を維持することは、BMMの完全な可溶化を確実にするために重要です。
5. プールされたCRS /エンテロイド/ BMM溶液を含む微量遠心チューブ(ステップ2.3)をローテーターに4°Cで1時間置き、BMMを可溶化します。
6. 溶液を200 x g で4°Cで3分間遠心分離し、マイクロピペットで上清を除去し、ペレットを残します。
7. 腸管ペレットをマイクロ遠心チューブあたり1 mLの50%L-WRN CM(ステップ1.3で調製)に再懸濁します。.再懸濁したエンテロイド/培地溶液500 μLを、超低接着24ウェル組織培養プレートの各ウェルに静かにピペットで移します(材料の表を参照)。
8. 実験の前に、5%_CO2 で37°Cで3日間インキュベートします。

3. ホールマウント免疫蛍光染色 による AO腸状立体構造の検証

1. 培地懸濁液中のエンテロイドを3日間インキュベートした後、エンテロイド/培地懸濁液を1つのウェルからマイクロ遠心チューブにピペットで入れます。
2. エンテロイド/培地懸濁液を200 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 マイクロピペットで上清を除去します。
3. エンテロイドを20 μLのBMMに再懸濁します。10 μLの腸内懸濁液を顕微鏡スライド上にピペットで移し、約1 cm x 1 cm角の薄層に広げます。残りの10 μLの腸内懸濁液を同じスライドの別の部分に繰り返して、エンテロイド/ BMM懸濁液の塗抹標本が2つあるようにします。
4. エンテロイド/ BMM塗抹標本を室温(RT)で15分間固化させます。
5. ヒュームフード内で作業し、スライドを染色ジャーに入れ、エンテロイド/BMM塗抹標本を覆うまで4%パラホルムアルデヒドを充填します(スライド容量10のガラス染色ジャーを使用する場合は、1スライドで~30 mL)。固定が行われるまで30分(室温)待ちます。
   注意: 4%パラホルムアルデヒドは危険であり、目の損傷/刺激、皮膚の炎症、および癌を引き起こす可能性があります。使用するときは、常にヒュームフードの下で作業してください。取り扱うときは、保護手袋と個人用保護具を着用してください。承認された廃棄物処理容器に廃棄してください。
6. 4%パラホルムアルデヒドを適切な廃棄物容器に捨ててください。30 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を染色ジャーに加えるか、PBSがエンテロイド/BMM塗抹標本を覆うまで加えます。RTで3分間放置してから、PBSをパラホルムアルデヒド廃棄物ボトルに廃棄します。この手順をさらに2回繰り返して、合計3回の洗浄を行います。
7. 新しい染色ジャーに、PBSで希釈した0.5%トリトンX-10030 mLを入れます。エンテロイド/BMM塗抹標本を含むスライドをトリトン溶液に入れ、RTで20分間透過させます。
8. PBSで希釈した0.5%トリトンX-100を廃棄します。30 mLのPBSを染色ジャーに加え、3分間放置します。デカントしてPBSを廃棄します。
9. エンテロイド/ BMM塗抹標本の周りのスライドをそっと拭き、邪魔しないように注意してください。疎水性バリアペン(バリアPAPペン、 材料表を参照)を使用して、各エンテロイド/ BMM塗抹標本の周りに円を描きます。二次抗体を産生した動物に特異的な20%血清を作ります( 材料の表を参照)。
10. 顕微鏡スライドを実験台に平らに置きます。ステップ3.9の特定の20%血清100 μLを疎水性バリアペンで囲んだ各エンテロイド/BMM塗抹標本にピペッティングすることにより、4°Cで1時間スライドをブロックします。
11. PBSで希釈したβ-カテニンおよびZO-1一次抗体のそれぞれ1:100および1:200希釈を含む100 μL溶液を調製します。
    注:各一次抗体は、画像化されたときに異なる免疫蛍光チャネルを持つことを保証するために、異なる動物からのものでなければなりません。本研究では、マウスβ-カテニン抗体とウサギZO-1抗体を利用します( 資料表を参照)。
12. カウンターのスライドをタップして20%の血清を取り除き、エンテロイド/ BMM塗抹標本を乱さないように注意しながら、そっと拭いて乾かします。100 μLのβ-カテニン/ZO-1一次抗体溶液をエンテロイド/BMM塗抹標本の1つにピペットで貼り付けます。一次抗体を含まないPBS100 μLを、ネガティブコントロールとして他のエンテロイド/BMM塗抹標本にピペットで移します。
13. プラスチック容器の底を濡れたペーパータオルで裏打ちして、加湿容器を作ります。スライドを容器に入れ、エンテロイド/ BMM塗抹標本を覆う溶液を乱さないように注意します。密封する容器に蓋を置き、4°Cで一晩平らに保管します。
    注意: スライドを乾かさないでください。乾燥を避けるために、容器が閉じていることを確認してください。
14. 続行する準備ができたら、カウンターのスライドをタップして、エンテロイド/ BMM塗抹標本から一次抗体とPBSを除去します。
15. スライドを染色ジャーに入れ、30 mLのPBSを充填するか、PBSがエンテロイド/BMM塗抹標本を覆うまで洗浄ステップを実行します。室温で3分間放置します。PBSを廃棄し、この手順をさらに2回繰り返して、合計3回の洗浄を行います。
16. 2つの異なる免疫蛍光チャネルに対して200 μLの二次抗体を調製し、各抗体はPBSで1:1000に希釈します( 材料の表を参照)。溶液を光から遠ざけてください。
17. 100 μLの二次抗体溶液を各エンテロイド/BMM塗抹標本にピペットで貼り付けます。それを暗闇に置き、RTで1時間放置します。
18. カウンターのスライドをタップして、二次抗体を除去します。手順3.15で概説した洗浄手順を繰り返し、すべての洗浄が暗闇で行われるようにします。
19. 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI付きフルオロシールド、 材料表を参照)封入剤を各エンテロイド/ BMM塗抹標本に一滴加え、カバーガラスを塗布して、両方の塗抹標本が適切に覆われていることを確認します。カバーガラスの下に気泡を閉じ込めないでください。顕微鏡で見る準備ができるまで、スライドを暗所に置いてください。
    注意: スライドをすぐにイメージングすると、最適な結果が得られます。ただし、スライドは4°Cの加湿容器に平らに保管し、DAPIの追加後最大1週間画像化することができます。

4. NEC実験の導入

1. AOエンテロイドが使用前に少なくとも72時間懸濁されていることを確認してください。
2. 各ウェルからのすべてのエンテロイド/培地懸濁液をマイクロ遠心チューブに静かにピペットで入れます。
   注:大量のウェルを処理する場合は、複数のウェルを1つの15 mLコニカルチューブにプールできます。このプロトコルでは、治療グループごとに最低3つのウェルが推奨されます。
3. 300 x g でRTで3分間遠心分離し、上清を除去します。
4. 1ウェルあたり500 μLの50%LWRN CM(最終濃度100 μg/mL LPS)に5 mg/mLのリポ多糖(LPS、 材料表を参照)10 μLを加えます。
5. 治療群として指定されたAOエンテロイドを50%LWRN + LPSに再懸濁し、500 μLの懸濁液を24ウェル超低アタッチメントプレートに分注します。未処理コントロールとして指定されたAOエンテロイドを、ウェルあたり500 μLの50%LWRN CMに再懸濁します。この懸濁液500 μLを別の24ウェル超低アポレーションプレートに分注します。
6. 製造元の指示に従って、1%O 2、5%_CO2、および94%N₂を含むモジュラーインキュベーターチャンバー(MIC)を介して、LPS処理AOエンテロイドに低酸素症を誘発します(材料の表を参照)。エンテロイドを低酸素症とLPSで24時間治療します。
7. 未処理およびLPS+低酸素処理培養物を、まだMICチャンバー内に、37°C、5%_CO2 インキュベーター中で24時間置く。

5. LYを利用した傍細胞透過性の測定

1. 各ウェルからエンテロイド/培地懸濁液をマイクロ遠心チューブに静かにピペットで入れます。DPBSと50%LRWN CMを37°Cの水浴中で温めます。
2. エンテロイド/培地懸濁液を300 x g でRTで3分間遠心分離します。
3. メディアを取り出します。エンテロイドを温かい500 μL DPBSで洗浄します。
4. 300 x g でRTで3分間遠心分離し、マイクロピペットで上清を取り除きます。
5. 手順5.3〜5.4をもう一度繰り返して、合計2回繰り返します。
6. 洗浄後、450 μLの温かい50%LWRN CMを追加します(ステップ1.3で調製)。
7. 50 μLの2.5 mg/mL LY(最終濃度は0.25 μg/μL、 材料表を参照)を各ウェルに加え、穏やかに旋回させて混合します。37°C、5%_CO2 インキュベーターに2時間入れます。
8. 各ウェルからエンテロイド/培地懸濁液をマイクロ遠心チューブに静かにピペットで入れます。
9. 300 x g でRTで3分間遠心分離し、上清を除去して腸内ペレットを残します。
10. エンテロイドを500μLの温かいDPBSで洗浄します。
11. 300 x g でRTで3分間遠心分離し、腸内ペレットを残して上清を除去します。
12. 手順5.10〜5.11をさらに3回繰り返して、合計4回の洗浄を行います。
13. 各ペレットを1,000 μLのコールドDPBSで再懸濁し、激しくピペットで上下させてエンテロイドを解離させます。
14. DPBSで希釈したLY標準曲線の標準物質を準備します(100 ng/mL; 50 ng/mL; 25 ng/mL; 12.5 ng/mL; 6.25 ng/mL; 3.13 ng/mL; 1.57 ng/mL; 0 ng/mL)。
15. 各サンプル150 μLを96ウェルプレート上で3連で1ウェルあたりピペットします。
16. 蛍光を読み取ることができるプレートリーダーで428 nmの励起ピークと536 nmの発光ピークの蛍光を測定します( 材料の表を参照)。統計ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、検量線を補間し、4パラメータ曲線を使用して濃度を計算します。

結果

AOコンフォメーション
50%LWRN培地に72時間懸濁したエンテロイドは、AOコンフォメーションを示します(図1)。これは、頂端タンパク質であるオクラヌラ-1(ZO-1)と基底外側タンパク質であるβ-カテニンの腸内全マウントを利用した免疫蛍光染色 によって 確認されました(図1)。AOエンテロイドは、エンテロイドの外側の頂端面にZO-1(?...

ディスカッション

腸透過性は複雑であり、上皮バリア機能を反映しています。腸管バリアは、経細胞および傍細胞輸送を媒介する上皮細胞の単層を含む¹⁴。傍細胞透過性は、上皮細胞¹⁴間の空間を封鎖するタイトジャンクションタンパク質に依存する。この傍細胞輸送には、分子が通過できる3つの異なる経路があります:細孔、漏れ、および無制限の¹⁵。細?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
[leu] 15-gastrin 1	Millipore Sigma	G9145-.1MG
100 µm sterile cell strainer	Corning	431752
100% LWRN conditioned media	Made in-house following Miyoshi et al.12
24-well tissue culture plate	Corning	3526
96-well black, clear bottom plate	Greiner Bio-One	655090
A-83-01	R&D Systems	2939/10
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000	Invitrogen	A-11034
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000	Invitrogen	A-11032
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific	15290026
Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200	Cell Signaling	#D6L1E
Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100	Cell Signaling	#14-2567-82
B-27 supplement minus Vitamin A	Thermo Fisher Scientific	17504-044
Barrier PAP pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
BMM (Matrigel)	Corning	CB-40230C
Cell Recovery Solution	Corning	354270
Dissecting scissors
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11-965-118
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	11320-082
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14-190-144
Epidermal Growth Factor (EGF)	Millipore Sigma	GF144
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	EDS-500G
EVOS m7000 Imaging system	Invitrogen	AMF7000
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-Products	100-525
Fluoroshield with DAPI	Millipore Sigma	F6057-20mL
Forceps
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	15-750-060
Glass coverslips
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061
GraphPad Prism 9	Dotmatics
Insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014
Lipopolysaccharide (LPS)	Millipore Sigma	L2630-25MG
Lucifer Yellow CH, Lithium Salt	Invitrogen	L453
Modular incubator chamber	Billups Rothenberg Inc.	MIC101
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES)	Thermo Fisher Scientific	15630-080
N-Acetylcysteine	Millipore Sigma	A9165-5G
Nicotinamide	Millipore Sigma	N0636-100G
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-148
Refrigerated swinging bucket centrifuge
Refrigerated tabletop microcentrifuge
RPMI 1640 Medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
SB202190	Millipore Sigma	S7067-5MG
SpectraMax iD3 microplate reader	Molecular devices
Tube Revolver Rotator	ThermoFisher Scientific	88881001
Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate	Corning	3473
Y-27632, ROCK inhibitor (RI)	Tocris	1254