Method Article
Пролапс тазовых органов поражает миллионы женщин во всем мире, и все же некоторые распространенные хирургические вмешательства имеют частоту неудач до 40%. Отсутствие стандартных моделей на животных для исследования этого состояния препятствует прогрессу. Мы предлагаем следующий протокол в качестве модели для подвешивания маточно-крестцовой связки и испытаний на растяжение in vivo .
Пролапс тазовых органов (POP) является распространенным заболеванием тазового дна (PFD), которое может значительно повлиять на качество жизни женщины. Примерно 10-20% женщин проходят операцию по восстановлению тазового дна для лечения пролапса в Соединенных Штатах. Только в Соединенных Штатах дела PFD приводят к общим ежегодным расходам в размере 26,3 миллиарда долларов. Это многофакторное состояние оказывает негативное влияние на качество жизни, и все же варианты лечения в недавнем прошлом только сократились. Одним из распространенных хирургических вариантов является суспензия маточно-крестцовой связки (USLS), которая обычно выполняется путем прикрепления свода влагалища к маточно-крестцовой связке в тазу. Эта операция имеет меньшую частоту осложнений по сравнению с операциями с аугментацией сетки, но отличается относительно высокой частотой отказов до 40%. Учитывая отсутствие стандартных моделей на животных для изучения дисфункции тазового дна, существует острая клиническая потребность в инновациях в этой области с акцентом на разработку экономически эффективных и доступных моделей животных. В этой рукописи мы описываем крысиную модель USLS, включающую полную гистерэктомию с последующей фиксацией оставшегося свода влагалища к маточно-крестцовой связке. Цель этой модели состоит в том, чтобы имитировать процедуру, выполняемую на женщинах, чтобы иметь возможность использовать модель для последующего исследования репаративных стратегий, которые улучшают механическую целостность прикрепления связок. Важно отметить, что мы также описываем разработку процедуры испытания на растяжение in situ для характеристики целостности интерфейса в выбранные моменты времени после хирургического вмешательства. В целом, эта модель станет полезным инструментом для будущих исследований, в которых изучаются варианты лечения восстановления СОЗ с помощью USLS.
Пролапс тазовых органов (POP) является распространенным заболеванием тазового дна, поражающим миллионы женщин во всем мире и способным существенно повлиять на многие аспекты жизни женщины, особенно в возрасте1 года. Примечательно, что примерно 13% женщин в Соединенных Штатах подвергнутся хирургическому вмешательству по поводу пролапса или недержания мочи2. Состояние, наиболее распространенное после беременности и родов, пролапс характеризуется опущением органов малого таза, преимущественно различных отделов влагалища и/или матки, за пределы их нормального положения в брюшной полости. Это приводит к надоедливым симптомам выпуклости влагалища или давления, кишечника, мочевого пузыря и сексуальной дисфункции, а также к общему снижению качества жизни. Другие факторы риска развития СОЗ включают ожирение, употребление табака, хронический кашель и запоры3.
У здоровых женщин органы тазового дна поддерживаются мышцами-леваторами ани, маточно-крестцовыми связками (УЗЛ), кардинальными связками, соединительнотканными прикреплениями к боковой стенке таза и дистальными структурами тела промежности 4,5. USL являются одними из наиболее важных апикальных поддерживающих структур как для матки, так и для апикального влагалища и, таким образом, часто используются при хирургической коррекции POP (рис. 1). Структурная поддержка USL проистекает из плотной коллагеновой соединительной ткани в крестцовой области, которая переходит в плотно упакованные гладкие мышцы. Из-за этого композиционного градиента USL переплетается с мускулатурой матки и влагалища, обеспечивая прочную поддержку органов малого таза 6,7. В суспензии маточно-крестцовых связок (USLS) USL прикрепляются к своду влагалища после гистерэктомии, восстанавливая влагалище и окружающие структуры в их анатомическом положении в брюшном отделении. Однако, независимо от трансвагинального или лапароскопического пути, процедура USLS страдает от относительно высокой частоты неудач до 40% в некоторых исследованиях 8,9. Частота рецидивов надоедливых симптомов выпуклости влагалища через 5 лет после восстановления пролапса апикального компартмента, такого как USL, составила примерно 40% в большом многоцентровом рандомизированном контролируемом исследовании9. В том же исследовании повторное лечение рецидивирующего пролапса через 5 лет составило примерно 10%. Механизм такой высокой частоты отказов не изучался, но восстановление влагалища и окружающих структур в их анатомическом положении требует наложения швов в плотную коллагеновую область USL10,11, а не в область гладких мышц. Таким образом, высокая частота неудач может быть связана с механическим и композиционным несоответствием хирургически сформированного интерфейса влагалища-USL по сравнению с полной интеграцией, наблюдаемой в нативном прикреплении шейки матки и USL.
Экономический эффект от лечения этих расстройств также заметен: в США ежегодно тратится около 300 миллионов долларов на амбулаторнуюпомощь12 и более 1 миллиарда долларов ежегодно расходуется на прямые расходы на хирургические процедуры13. Несмотря на огромные экономические ресурсы, выделяемые на лечение этих состояний, осложнения, возникающие в результате многих операций по поводу пролапса, остаются обескураживающими. Например, восстановление апикального пролапса на основе полипропиленовой сетки, такое как сакрокольпопексия, обеспечивает более высокие показатели успеха по сравнению с восстановлением нативных тканей14, но за счет потенциальных осложнений, таких как обнажение сетки или эрозия. Только в период с 2008 по 2010 год FDA получило около 3000 жалоб, связанных с осложнениями сетки. Кульминацией этого стал приказ FDA о прекращении производства и продажи всех трансвагинально размещенных сетчатых продуктов для СОЗ в апреле 2019года 15. Таким образом, существует сильная клиническая потребность в материалах, отличных от полипропилена, и моделях, с помощью которых их можно тестировать, которые могут усилить восстановление пролапса нативных тканей и повысить показатели успеха по сравнению с традиционными методами с наложением швов в одиночку.
С момента объявления FDA в 2019 году большинство тазовых хирургов прекратили использовать трансвагинально размещенную сетку для восстановления пролапса, что побудило исследователей искать новые подходы к тканевой инженерии для усиления восстановления нативных тканей16,17,18, таких как мезенхимальные стромальные клетки (МСК)9,20 . В связи с этим смещением акцента существует острая необходимость в уточнении моделей животных, которые могут помочь в разработке новых материалов; Задача в этом процессе состоит в том, чтобы сбалансировать клиническую значимость с затратами. С этой целью фундаментальная наука и клинические исследователи, изучающие пролапс тазовых органов, до сих пор использовали несколько моделей на животных, включая крыс, мышей, кроликов, овец, свиней и нечеловекообразных приматов19. Процесс определения оптимальной модели животных является сложным, поскольку люди двуногие, не имеют хвоста и имеют травматический процесс рождения по сравнению с другими видами млекопитающих20. Свиньи21 были использованы для моделирования роботизированной сакрокольпопексии, в то время как овцы использовались для моделирования восстановления вагинального пролапса22. Эти модели на животных, хотя и клинически значимы, ограничены в осуществимости стоимостью и обслуживанием. Нечеловекообразные приматы использовались для изучения патогенеза пролапса; Беличьи обезьяны, в частности, являются одним из немногих видов, кроме людей, у которых может развиться спонтанный пролапс, что делает их одной из наиболее актуальных моделей животных20. Нечеловеческие приматы также использовались для изучения гинекологических хирургических процедур, таких как сакрокольпопексия23 и трансплантация матки24. Как и в случае с овцами и свиньями, основным ограничением нечеловеческих приматов как животной модели пролапса является стоимость содержания, ухода и содержания19.
Хотя таз грызунов ориентирован горизонтально с гораздо меньшим соотношением размеров головы к родовому каналу по сравнению с людьми19, крысы подходят для исследований хирургии USLS на мелких животных, поскольку они имеют аналогичную анатомию USL, клеточность, гистологическую архитектуру и состав матрицы по сравнению с человеческим USL25. Кроме того, они выгодны с точки зрения обслуживания и посадки. Несмотря на эти полезные свойства, нет опубликованных сообщений о крысиной модели восстановления USLS. Таким образом, цель состоит в том, чтобы описать протокол гистерэктомии и USLS у многородящей крысы Льюиса. Этот протокол будет полезен для исследователей, которые стремятся изучить патофизиологию и хирургические компоненты СОЗ с использованием этой доступной модели животных.
Рисунок 1: Опущение тазовых органов. (А) Нормальная ориентация органов в брюшной полости и (Б) резкое снищение органа при пролапсе. После гистерэктомии (C) суспензия маточно-крестцовой связки восстанавливает влагалище и окружающие структуры в их правильном анатомическом положении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Следуйте всем рекомендациям Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC), получив одобрение на все процедуры с животными перед началом. Требования к технике асептической хирургии можно найти в Руководстве26 и Правилах защиты животных27. Исследование было одобрено Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Вирджинии по протоколу No 4332-11-20. Получают повторнородящих (два помета) самки заводчиков. Крысы должны быть размещены в парном виварии, аккредитованном Американской ассоциацией по аккредитации ухода за лабораторными животными, и обеспечены кормом и водой ad libitum. Животные в этом исследовании были крысами Льюиса, полученными из Чарльз-Ривер, и были в возрасте от 4 до 6 месяцев, чтобы удовлетворить потребность в двух пометах. Животные содержались в 12-часовом цикле свет-темнота.
1. Коррекция пролапса тазовых органов с помощью подвески маточно-крестцовой связки
Рисунок 2: Подготовка животных к операции в реальном времени. Удаление шерсти с области, окружающей место разреза, необходимо для правильной асептической техники. Области, показанные на панелях (А) и (В), являются ориентировочными. Исследователи должны удалить достаточное количество волос, чтобы стерильные инструменты не соприкасались с волосами во время операции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Сохранение яичников. Рога матки обычно не видны при первом открытии брюшной полости, как показано в (А). После того, как рог обнаружен и проследите, чтобы найти (B) яичник и яйцевод, где они соединяются с рогом, верхнюю часть рога можно зажать, а рог отделить, чтобы начать гистерэктомию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Удаление рогов матки. Гистерэктомия у крысы включает (А) оба рога матки (В), зажатые в маточно-цервикальном соединении, и (В) иссеченные. Свод влагалища от каждого рога остается с (D) шейной/маточной культей (стрелка), соединяющей их. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Суспензия маточно-крестцовой связки. (А) Ориентация маточно-крестцовых связок по отношению к созданным структурам свода влагалища. При наложении швов для восстановления подвески маточно-крестцовой связки (USLS) (B) швы захватывают маточно-крестцовую связку, а затем проходят как через переднюю, так и через заднюю стороны влагалищной манжеты. (C) Закрепленный на маточно-крестцовой связке, свод влагалища теперь поднят головой к крестцу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
2. Одноосное испытание на растяжение
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемая испытательная система и программное обеспечение эксплуатировались в соответствии с рекомендациями производителя по калибровке и тестированию. Все испытания проводились при температуре 22 °C.
Рисунок 6: Подготовка образца к испытанию на одноосное растяжение. (А) Открытые контрольные USL до (B) пупочная лента продевается за тканью. (C) соединение USL-свода влагалища после полного растворения швов с (B) пупочной лентой, продетой за тканью при подготовке к испытанию на растяжение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Система механических испытаний . (A) Испытательная система в режиме испытания на растяжение, используемая с (B) держателем для 3D-печати и (C) захватом образца, напечатанным на 3D-принтере, в комплекте с текстурированной полосой для улучшения сцепления. Конфигурация деталей показана на панели (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Настройка испытания на растяжение . (A) Образец находится по центру под рукояткой и держателем. (B) Животное и ткани, окружающие образец, удерживаются в неподвижном состоянии до начала испытания на растяжение. Как показано на врезке, закрепление окружающей ткани необходимо для изоляции интересующей ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Пример вывода и анализа данных испытаний на растяжение. (А) Кривая нагрузки-смещения для контрольного образца с последующим (B) анализ напряженной деформации и (C) наклон уравнения подгонки линейной кривой, показывающий касательный модуль в МПа. (D-F) показывает тот же процесс для образца USLS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Хирургическая целесообразность и наложение маточно-крестцового шва
Ни у одного из животных не было интраоперационных осложнений, связанных с гистерэктомией или подвешиванием маточно-крестцовой связки. Во время удаления рогов матки наблюдалось минимальное кровотечение, при условии, что соседняя сосудистая сеть была пережата перед удалением. Ограниченное кровотечение позволило хорошо визуализировать маточно-крестцовые связки для наложения швов и предотвратило интраоперационное повреждение кишечника, прямой кишки, мочеточника или мочевого пузыря. После наложения швов новообразованное соединение USL-влагалищного свода предотвращало движение культи шейки матки / матки, как показано на рисунке 5C. В течение первых трех послеоперационных дней животных проверяли ежедневно, а затем раз в две недели до конца эксперимента. При введении опиоидов и анальгетиков НПВП с пролонгированным высвобождением во время операции дополнительные анальгетики оказались ненужными. Основываясь на нашем опыте с 16 операциями на животных (n = 8 как для контрольной группы, так и для группы USLS), следует ожидать снижения веса в первую неделю после операции со средней потерей веса на 5,7 ± 1,4% от веса в день операции. Как и ожидалось, крысы медленно набирали вес в течение последующих 23 недель, со средним увеличением веса на 15,1 ± 4,5% в ходе эксперимента.
Механические испытания ремонта УСЛС
Для демонстрации функциональности ремонта USLS были проведены одноосные испытания на растяжение. После эвтаназии животного в выбранный послеоперационный момент, 24 недели в этом исследовании, хирургическая область должна быть тщательно рассечена, чтобы визуализировать соединение USL-влагалищного свода, как показано на рисунке 6A. По сравнению с другими методологиями тестирования USL крыс вместе с другими поддерживающими структурами и органами малого таза29,42, описанный здесь метод является первым, в котором USL крыс тестируется изолированным образом. Пупочная лента, используемая в этом исследовании, была стратегически выбрана из-за ее гибкости, поскольку податливость ленты позволяла свести к минимуму разрушение ткани во время подготовки к испытанию на растяжение. Поэтому данные о смещении нагрузки должны быть скорректированы с учетом небольшого растяжения, вносимого пуповинной лентой. На рисунке 9 приведен пример данных, полученных в результате испытаний на растяжение, а на рисунке 9А приведен пример типичного графика напряжений-деформаций. Рекомендуется сообщать данные о напряженно-деформированном состоянии, поскольку эта информация нормализована и не зависит от размера образцов34 и может быть лучше сопоставлена между исследованиями. Для интактной маточно-крестцовой связки мы сообщаем о структурных свойствах, таких как предельная нагрузка (2,9 ± 0,5 Н) и жесткость (0,4 ± 0,1 Н/мм), а также нормализованные свойства материала, такие как предельное напряжение (2,1 ± 0,4 МПа), предельная деформация (1,6 ± 0,5) и модуль касательной (4,0 ± 1,1 МПа). В одноосных тестах, проведенных на репродуктивных органах крыс и всех их поддерживающих тканевых соединениях Moalli et al., они сообщили о предельной нагрузке при отказе (13,2 ± 1,1 Н) и жесткости (2,9 ± 0,9 Н/мм) выше, чем у изолированного USL29. В работе, проделанной Moalli et al. и другой литературе34,35, упоминается высокая вариабельность между испытуемыми образцами, как показано в представленных здесь данных. Для восстановления подвески маточно-крестцовой связки мы обнаружили, что все свойства конструкционного материала (жесткость 0,33 ± 0,13 Н/мм; предельная нагрузка 2,6 ± 1,3 Н) и нормализованные свойства материала (предельное напряжение 1,8 ± 0,7 МПа; предельная деформация 1,3 ± 0,3; модуль касательной 3,0 ± 0,9 МПа) ниже, чем у родного USL.
Протокол примечателен рядом преимуществ. Насколько нам известно, это первое опубликованное описание USLS в модели крысы, которое предоставит будущим исследователям воспроизводимые шаги для выполнения этой процедуры в исследовательских условиях. Во-вторых, мы включили новый протокол для испытаний на растяжение нативного и хирургического интерфейса USL. Протокол испытаний на растяжение может быть использован в аналогичных исследованиях, в которых исследуются новые подходы к тканевой инженерии для усиления восстановления нативных тканей, таких как USLS. Кроме того, сама модель крысы полезна для изучения заболеваний тазового дна из-за простоты обращения / посадки, короткого срока службы и экономической эффективности по сравнению с более крупными моделями животных. Ограничения протокола включают невозможность оценить одно из основных осложнений USLS, перегиб мочеточника. Несмотря на это, в этом исследовании у нас не было случаев предполагаемого повреждения мочеточника. Еще одно соображение заключается в том, что горизонтальная ориентация таза, отношение головы маленького плода к родовому каналу и отсутствие спонтанного пролапса в модели крысы ограничивают некоторую применимость результатов к людям. Тем не менее, использование повторнородящих крыс является сильной стороной этого исследования, поскольку это является ведущим фактором риска развития СОЗ3.
Создание успешного протокола гистерэктомии и USLS у крыс Льюиса станет полезным инструментом для будущих исследователей, исследующих хирургические компоненты СОЗ, сводя к минимуму вариабельность при тестировании механического поведения USL. Хирургические модели на животных полезны тем, что они позволяют исследователям разрабатывать клинически значимые эксперименты, которые контролируют паритет, массу тела, болезни ипитание34, одновременно снижая этический риск первоначального исследования на людях. Кроме того, стандартизированные модели для СОЗ позволяют исследователям обходить ограничения сбора тканей человека. В частности, методы испытаний на растяжение, описанные в настоящем протоколе, обеспечат согласованность между исследованиями. Предыдущие модели грызунов проверяли механические свойства всей тазовой области, включая шейку матки, влагалище и множественные опорные связки таза 29,42. Описанные здесь методы позволяют измерять USL таким образом, чтобы поддерживать естественные спинальные и шейные прикрепления. Следует отметить, что методы испытаний на растяжение оценивают не только USL, но и USL в сочетании с его введением в крестец и шейку матки. Это сильная сторона исследования, поскольку оно отражает обычные силы in situ, которым подвергается связка. Мы признаем, что механическое поведение изолированной связки было бы другим, если бы она была протестирована ex vivo без ее собственных прикреплений. Это особенно верно, поскольку структуры крыс невелики и ограничивают возможность сбора образца, подходящего для тестирования ex vivo. USL действительно испытывают нагрузку в нескольких направлениях in situ, поэтому одноосный характер теста является ограничением, но использование этого метода позволяет проводить значимые сравнения между предыдущими исследованиями механики USLкрыс 29,42. Хотя в настоящее время не существует общепринятого стандартного протокола механических испытаний, эта модель станет полезным инструментом для будущих исследований в области тканевой инженерии в этой области.
Несколько этапов, описанных в этом протоколе, имеют решающее значение для здоровья и благополучия животных, а также для воспроизводимости операции USLS и последующих испытаний на растяжение. Во-первых, важно получить как анальгетик, так и противовоспалительные препараты, описанные как один только анальгетик, который оказался недостаточным для лечения боли. Профилактический антибиотик снижает риск инфекции в области хирургического вмешательства и является стандартом лечения в хирургии человека. Что касается хирургической процедуры USLS, предотвращение повреждения яичников и минимизация кровопотери имеют важное значение для успешной операции. Этапы 1.3.3 и 1.3.4 описывают отделение верхней части рога матки от соседнего яичника; Следует позаботиться о том, чтобы сохранить это рассечение на стороне рога матки, чтобы предотвратить нарушение работы нежных сосудов вокруг яичника, что может привести к чрезмерному кровотечению. Следует отметить, что другие исследователи показали, что функция яичников сохраняется после удаления рогов матки43. Более того, если яичники будут нарушены или удалены, общая архитектура коллагеновой фибриллы будет нарушена, что изменит механические свойства ее тканей44,45. После того, как рог матки безопасно отделен от яичника, существует четкая плоскость рассечения, позволяющая изолировать рог матки от окружающих жировых пакетов и сосудистой сети. Несмотря на четкую плоскость рассечения, ножки вдоль рога матки перед пересечением следует закрепить зажимом микроножницами. В отличие от хирургической практики у людей, мы обнаружили, что перевязка швов ножки гистерэктомии не нужна, так как зажим ножки перед пересечением обеспечивает адекватный гемостаз. На шаге 1.3.6 протокола описан этот тщательный процесс минимизации кровопотери. Во время гистерэктомии следует проявлять большую осторожность при идентификации мочеточников, как указано на этапах 1.3.6 и 1.3.8. Понимание анатомической близости мочеточника имеет решающее значение, поскольку одним из наиболее распространенных осложнений, связанных с USL у людей, является повреждение мочеточника46.
В заключение мы представляем новый протокол для выполнения гистерэктомии, суспензии маточно-крестцовой связки и испытания USL на растяжение на крысиной модели. Мы ожидаем, что наши результаты помогут будущим исследователям фундаментальной науки, предоставив четкое, воспроизводимое описание этих процедур и, таким образом, позволят продвинуть исследования пролапса тазовых органов.
Авторам раскрывать нечего.
Мы благодарим профессора Сильвию Блемкер за использование ее Instron и профессора Джорджа Христа за использование его хирургического пространства, а также держателя и рукоятки, напечатанных на 3D-принтере. Эта работа была поддержана Партнерством трансляционных исследований UVA-Coulter и Министерством обороны США (W81XWH-19-1-0157).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alcohol prep pad | BD | 326895 | |
Artificial Tear Ointment | American Health Service Sales Corp | PH-PARALUBE-O | |
Bluehill software | Instron | Bluehill 3 | |
Cavicide 1 disinfectant | Fisher Scientific | 22 998 800 | |
Compression platean | Instron | 2501-163 | |
Cotton swabs | Puritan Medical | 806-WC | |
Gauze Sponge, 8-Ply | VWR | 95038-728 | |
Mosquito Forceps | Medline Industries | MMDS1222115 | |
Needle Holder | Medline Industries | DYND04045 | |
Operating Scissors, 5½", Sharp | American Health Service Sales Corp | 4-222 | |
Opioid Analgesic (Buprenorphine XR) | Fidelis Animal Health | Ethiqa XR | 0.65 mg/kg SC Q72 |
NSAID Analgesic (Meloxicam SR) | Wildlife Pharmaceuticals, LLC | Meloxicam SR | 1 mg/kg SC q72 |
PDS II, 3-0 Polydioxanone Suture, SH-1 | Ethicon | Z316H | |
PDS II, 5-0 P olydioxanone Suture, RB-1 | Ethicon | Z303H | |
Retractor | Medline Industries | MDS1862107 | |
Scalpel Blade Stainless Surgical #10 | Miltex | 4-310 | |
Scalpel Handle | Medline Industries | MDS15210 | |
Scissor, Micro, Curved, 4.5" | Westcott | MDS0910311 | |
Single Column Universal Testing System | Instron | 5943 S3873 | 1 kN force capacity, 10 N load cell |
Sterile Natural Rubber Latex Gloves | Accutech | 91225075 | |
Suture,Vicryl,6-0,P-3 | Ethicon | J492G | |
Tape,Umbilical,Cotton,1/8X18" | Ethicon | U10T | |
Tension and Compression Load Cell | Instron | 2530-10N | 10N load cell (1 kgf, 2 lbf) |
Veterinary surgical adhesive (skin glue) | Covetrus | 31477 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены