Modello animale di zebrafish per lo studio delle reazioni allergiche in risposta alle biomolecole della saliva delle zecche

Riepilogo

Qui, il pesce zebra (Danio rerio) viene utilizzato come modello per studiare le reazioni allergiche e le risposte immunitarie correlate alla sindrome alfa-Gal (AGS) valutando le reazioni allergiche alla saliva delle zecche e al consumo di carne di mammifero.

Abstract

Le zecche sono vettori di artropodi che causano malattie per trasmissione di agenti patogeni e le cui punture potrebbero essere correlate a reazioni allergiche che hanno un impatto sulla salute umana in tutto il mondo. In alcuni individui, alti livelli di anticorpi immunoglobuline E contro il glicano Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) sono stati indotti da punture di zecca. Le reazioni anafilattiche mediate da glicoproteine e glicolipidi contenenti il glicano α-Gal, presente nella saliva delle zecche, sono correlate alla sindrome alfa-Gal (AGS) o all'allergia alla carne di mammifero. Il pesce zebra (Danio rerio) è diventato un modello di vertebrati ampiamente utilizzato per lo studio di diverse patologie. In questo studio, il pesce zebra è stato utilizzato come modello per lo studio delle reazioni allergiche in risposta al consumo di carne di α-Gal e di mammifero perché, come gli esseri umani, non sintetizzano questo glicano. A tale scopo, sono stati valutati i modelli comportamentali e le reazioni allergiche di tipo anafilattico emorragico in risposta alla saliva della zecca Ixodes ricinus e al consumo di carne di mammifero. Questo approccio sperimentale consente di ottenere dati validi che supportano il modello animale zebrafish per lo studio delle allergie trasmesse dalle zecche incluso AGS.

Introduzione

Le zecche sono vettori di agenti patogeni che causano malattie e sono anche la causa di reazioni allergiche, che influenzano la salute degli esseri umani e degli animali in tutto il mondo ^1,2. Durante l'alimentazione delle zecche, le biomolecole nella saliva delle zecche, in particolare proteine e lipidi, facilitano l'alimentazione di questi ectoparassiti, evitando le difese dell'ospite³. Alcune biomolecole di saliva con glicani Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) modificano la produzione di alti livelli di anticorpi anti-α-Gal IgE dopo la puntura di zecca, solo in alcuni individui, che è noto come sindrome α-Gal (AGS)⁴. Questa è una malattia associata all'allergia IgE-mediata che può causare anafilassi alle punture di zecca, consumo di carne di mammifero non primate e alcuni farmaci come cetuximab⁵. Le reazioni a α-Gal sono spesso gravi e talvolta possono essere fatali 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

Il α-Gal si trova in tutti i mammiferi ad eccezione delle scimmie del Vecchio Mondo, delle scimmie e degli esseri umani che non hanno la capacità di sintetizzare α-Gal¹³. Tuttavia, agenti patogeni come batteri e protozoi esprimono questo glicano sulla loro superficie, che può indurre la produzione di elevate quantità di anticorpi anti-α-Gal IgM/IgG e può essere un meccanismo protettivo contro questi patogeni^16,17. Tuttavia, la produzione di anticorpi anti-α-Gal aumenta il rischio di sviluppare allergie anti-α-Gal mediate da IgE ^7,13. Gli anticorpi anti-α-Gal naturali prodotti nell'uomo, principalmente dei sottotipi IgM/IgG, potrebbero essere associati a questa modificazione presente nei batteri del microbiota intestinale¹⁶. L'AGS può essere una diagnosi clinica impegnativa, poiché il principale metodo diagnostico al momento si basa su una storia clinica di reazioni allergiche ritardate, in particolare associate ad allergie alimentari (cioè prurito, orticaria localizzata o angioedema ricorrente ad anafilassi, orticaria e sintomi gastrointestinali) e la misurazione dei livelli di anticorpi anti-α-Gal IgE⁹. I risultati attuali suggeriscono che le punture di zecca costituiscono uno dei principali rischi nella comparsa di AGS 18,19, un aumento di 20 volte o più dei livelli di IgE a α-Gal a seguito di una puntura di zecca 19, una storia di punture di zecca in pazienti con AGS^20,21,22, l'esistenza di anticorpi reattivi agli antigeni delle zecche nei pazienti AGS ^19, e che le IgE anti-α-Gal sono fortemente correlate ai livelli di IgE anti-zecca^19,23, ma sono necessari ulteriori studi per valutare quali biomolecole sono effettivamente coinvolte.

Inoltre, un altro scenario possibile sono i pazienti che presentano forti reazioni allergiche alle punture di zecca e alti livelli di anticorpi anti-α-Gal IgE, ma sono tolleranti al consumo di carne di mammifero¹². Pertanto, l'allergia alla carne di mammifero potrebbe essere un particolare tipo di allergia correlata al morso di zecca. Le principali specie di zecche associate all'AGS includono Amblyomma americanum (USA), Amblyomma sculptum (Brasile), Amblyomma testudinarium e Haemaphysalis longicornis (Giappone), Ixodes holocyclus (Australia) e Ixodes ricinus (il principale vettore della borreliosi di Lyme in Europa)^11,24.

L'unico modello che è stato utilizzato per valutare la produzione di IgE correlata alle punture di zecca è il modello murino geneticamente modificato con il gene per topi α-1,3-galattosiltransferasi knocked out (α-Gal KO)^25,26 perché, come altri mammiferi^, i topi esprimono anche α-Gal su proteine e lipidi e non producono IgE in α-Gal. Tuttavia, il pesce zebra (Danio rerio) è un modello utile per la ricerca biomedica applicata ai mammiferi perché condivide molte somiglianze anatomiche con i mammiferi e, come gli umani, non è anche in grado di sintetizzare α-Gal. Poiché α-Gal non è prodotto naturalmente nel pesce zebra, è un modello economico, facile da manipolare e consente un'elevata dimensione del campione per lo studio delle reazioni allergiche correlate al α-Gal.

In questo studio, il pesce zebra viene utilizzato come organismo modello per caratterizzare e descrivere le reazioni allergiche locali, i modelli comportamentali e i meccanismi molecolari associati alla risposta alla sensibilizzazione percutanea alla saliva delle zecche^26,27 e al successivo consumo di carne di mammifero. A tale scopo, i pesci vengono esposti alla saliva delle zecche mediante iniezione intradermica e quindi vengono nutriti con mangimi per cani, che contengono prodotti derivati dalla carne di mammifero adatti all'uso animale che contengono α-Gal²⁷, quindi vengono valutate eventuali reazioni allergiche correlate. Questo metodo può essere applicato allo studio di altre biomolecole correlate ai processi allergici, in particolare quelli correlati all'AGS.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato etico per la sperimentazione animale dell'Università di Castilla La Mancha nell'ambito dello studio "Valutazione della risposta immunitaria al vaccino M. bovis inattivato e sfida con M. marinum nel numero di modello del pesce zebra PR-2017-05-12".

Le zecche sono state ottenute dalla colonia di laboratorio, dove campioni rappresentativi di zecche nella colonia sono stati testati mediante PCR per i patogeni comuni delle zecche per confermare l'assenza di agenti patogeni e mantenuti presso l'Istituto di Parassitologia, Centro di biologia dell'Accademia ceca delle scienze (IP BC CAS), Repubblica ceca.Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la legge sulla protezione degli animali della Repubblica ceca n. 246/1992 Sb (approvazione etica n. 34/2018).

1. Trattamento zebrafish

NOTA: Lo studio è progettato per valutare le reazioni allergiche e la risposta immunitaria nel pesce zebra trattato con saliva di zecca in risposta al consumo di carne di mammifero.

1. Trattare il pesce (come spiegato nella sezione 4) con saliva di zecca, commerciale Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) (vedere Tabella dei materiali), usato come controllo positivo, con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) come controllo negativo. Il pesce zebra adulto è distribuito casualmente in tre gruppi equilibrati dal punto di vista del genere (Figura 1).
   NOTA: Qualsiasi altro composto desiderato correlato all'AGS può essere valutato utilizzando questo modello.

2. Estrazione della saliva della zecca Ixodes ricinus

1. Utilizzare zecche femminili semi-ingorgate prive di agenti patogeni alimentate per 6-7 giorni su porcellini d'India.
2. Trattare la zecca con 5 μL di una soluzione al 2% (p.c./vol) di pilocarpina cloridrato in PBS (vedere Tabella dei materiali) a pH 7,4 nell'emocele usando una siringa da 50 μL con un ago da 0,33 mm come descritto in precedenza²⁸ per indurre la produzione di saliva delle zecche.
   NOTA: le zecche vengono gestite con una pinza; Fai attenzione a non applicare troppa forza quando li afferri.
3. Raccogliere la saliva utilizzando una punta da 10 μL montata su una micropipetta.
   1. Introdurre la punta all'interno dell'ipostoma zecca con attenzione.
   2. Tenere la saliva in un tubo da 1,5 ml di ghiaccio, metterla in pool e conservarla a -80 °C come descritto in precedenza²⁷.
4. Determinare la concentrazione di proteine della saliva, per stabilire la quantità di proteine da iniettare nel pesce come negli studi precedenti²⁷ utilizzando un kit di analisi delle proteine BCA (vedere la tabella dei materiali) seguendo le raccomandazioni del produttore.

3. Mantenimento del pesce zebra

1. Mantenere il pesce zebra in un sistema di flusso d'acqua a 27 °C con un ciclo luce/buio di 14 h/10 h (Figura 2).
2. Nutrire il pesce due volte al giorno alle 9:30 e alle 13:30 con mangime secco per pesci (50-70 μg / pesce) fino al giorno 2.
3. Nutrire il pesce due volte al giorno alle 9:30 e alle 13:30 con mangime secco per cani (50-70 μg/pesce) dal giorno 2 dopo l'iniezione di trattamento fino alla fine dell'esperimento

4. Iniezione di zebrafish

1. Seleziona 10 pesci per gruppo con un rapporto simile di femmine / maschi e peso simile.
   NOTA: Il gruppo 1 contiene pesci iniettati con PBS, il gruppo 2 contiene pesci iniettati con saliva di zecca e il gruppo 3 contiene pesci iniettati con α-Gal.
2. Anestetizzare brevemente il pesce mediante immersione in tricaina metansolfonato allo 0,02% (MS-222) (Filmato 1).
   NOTA: I pesci correttamente anestetizzati mostrano una respirazione normale e nessun nuoto, mentre potrebbero essere posizionati sul fondo del serbatoio dell'acqua o galleggianti. Ogni pesce deve essere anestetizzato individualmente per evitare possibili danni fisiologici.
3. Cattura il pesce anestetizzato usando una rete da pesca.
4. Posizionare il pesce sul suo mezzo lato usando una pinza o le mani con attenzione, su una spugna bagnata, con la pinna caudale sul lato destro per iniettare i composti nella stessa direzione per controllare le lesioni.
5. Iniettare gruppi di pesci per via intradermica, come negli studi precedenti²⁶, nel muscolo a 5 mm dalla pinna caudale e con un angolo di 45° rispetto al corpo del pesce (Filmato 2). Usare il trattamento appropriato ai giorni 0, 3 e 8 come descritto in precedenza 27 con una siringa da 100 μL dotata di un ago da 1 cm, 29 G con 1 μL (con 9 μg/μL di proteine) di saliva I. ricinus in 10 μL di PBS (saliva da zecche), 5 μg di α-Gal in 10 μL di PBS (α-Gal)²⁷,  e 10 μL di PBS (Figura 3).
   NOTA: La manipolazione deve essere effettuata rapidamente e con attenzione per evitare danni fisici all'animale.
   Altre biomolecole nella saliva delle zecche possono essere valutate seguendo questo protocollo.
6. Rimettere il pesce trattato in un acquario d'acqua dolce senza anestesia per il recupero.
   NOTA: Tutti i pesci dello stesso gruppo possono essere collocati nello stesso serbatoio dell'acqua per il recupero.

5. Alimentazione del pesce zebra

1. Schiacciare il cibo per cani con un mortaio e un pestello.
2. Alimentare 50-70 μg/pesce due volte al giorno alle 9:30 e alle 13:30 con mangime secco per pesci fino al giorno 2.
3. Alimentare 50-70 μg/pesce due volte al giorno alle 9:30 e alle 13:30 con purè di mangime per cani dal giorno 2 dopo l'iniezione di trattamento fino alla fine dell'esperimento il giorno 8.
   NOTA: Se devono essere valutati marcatori di immunità o titoli anticorpali agli anticorpi α-Gal o IgE in risposta ai trattamenti o al mangime durante le diverse inoculazioni, l'alimentazione sarebbe necessaria fino alla fine dell'esperimento.

6. Valutazione delle reazioni allergiche, delle lesioni e del comportamento nel pesce zebra

1. Esaminare il tipo emorragico di reazioni allergiche (arrossamento della pelle, scolorimento ed emorragia) utilizzando una lente d'ingrandimento o uno stereomicroscopio per l'accuratezza e indicare la posizione del loro aspetto sul pesce seguendo la categorizzazione inclusa nella Tabella 1 (Figura 4A).
   NOTA: Le reazioni allergiche presentate nella Figura 4 sono apparse dopo l'iniezione di saliva di zecca e il consumo di mangimi contenenti carne rossa. Pertanto, le reazioni descritte sono il tipo di reazioni associate all'AGS, poiché reazioni simili compaiono nel contesto clinico.
   1. Osservare se appare qualche reazione dopo i trattamenti e durante la somministrazione di cibo due volte al giorno mentre i pesci sono nel serbatoio dell'acqua.
2. Esaminare il comportamento dei pesci valutando i cambiamenti²⁷ nei modelli di nuoto (mobilità, velocità, stare immobili sul fondo del serbatoio dell'acqua e nuotare a zigzag) seguendo la categorizzazione inclusa nella Tabella 1.
3. Valutare la mortalità accumulata, riportando il numero di pesci morti, compresa l'ora/giorno della morte (Figura 4B).
   NOTA: Tutti i parametri vengono valutati subito dopo il trattamento o dopo il cambio di mangime e seguiti quotidianamente fino alla fine dell'esperimento il giorno 8 categorizzando le variabili qualitative (Tabella 1). Come raccomandazione, questa valutazione dovrebbe essere condotta da un professionista con conoscenze sul pesce zebra per considerare i cambiamenti comportamentali in base al loro background e all'esperienza di lavoro con questo modello animale.
4. Calcola il numero di zebrafish al giorno con reazioni allergiche segnalate, comportamento anormale e cambiamenti alimentari in ciascun gruppo e confronta tra i gruppi con un test ANOVA unidirezionale.

7. Raccolta dei campioni

1. Eutanasia il pesce per immersione in 0,04% MS-222 il giorno 8.
   NOTA: Raccogliere anche i campioni dai pesci che muoiono per reazioni allergiche durante il processo.
2. Fissare il pesce su un piatto di paraffina con spilli.
3. Raccogliere il siero dai vasi sanguigni branchiali 29 del pesce immediatamente dopo l'eutanasia, quando le branchie sono ancora irrigate con sangue, usando una siringa da 0,5 ml dotata di un ago da 1 cm e²⁹ G. Conservare in un tubo da 1,5 mL a -20 °C fino all'uso (Filmato 3).
4. Tagliare il pesce sagittalmente con una lama di bisturi e valutare le lesioni interne (lesioni emorragiche o granulomi)^27,30 se compaiono.
   NOTA: Le lesioni non compaiono necessariamente, ma devono essere registrate se lo fanno.
5. Raccogliere l'intestino (Filmato 4) e il rene (Filmato 5) da ciascun pesce in provette vuote separate da 1,5 ml, come descritto in precedenza³¹, e conservarle a -80 C (Figura 4C).
6. Estrarre l'RNA totale dai campioni di intestino e rene del pesce zebra utilizzando un kit di purificazione dell'RNA (vedi Tabella dei materiali).
7. Analizzare l'espressione di geni correlati alla risposta immunitaria come precedentemente descritto^30,32 (vedere Tabella 2 per le sequenze di primer) nel pesce zebra^, eseguendo una reazione quantitativa a catena della trascrizione-polimerasi inversa (RT-qPCR) utilizzando una miscela di trascrizione inversa per RT-qPCR (vedere Tabella dei materiali), secondo le istruzioni del produttore. Normalizzare i valori di mRNA cT rispetto a D. rerio GAPDH e confrontare tra gruppi (pesci trattati con saliva, α-Gal e gruppi trattati con PBS) utilizzando un test t di Student con varianza disuguale.
8. Determinare i titoli anticorpali IgM che riconoscono α-Gal nel pesce zebra nei campioni di siero mediante ELISA come descritto in precedenza^27,30. Registrare i titoli anticorpali come valori _{O.D.450 nm}, utilizzando un lettore di piastre, e confrontare tra i gruppi (pesci trattati con saliva, α-Gal e i gruppi trattati con PBS) utilizzando un test t di Student con varianza disuguale.
   NOTA: La determinazione dei titoli anticorpali IgM e l'analisi genica di espressione sono facoltative e condotte solo se sono richieste informazioni immunologiche. RT-qPCR mix è un kit di sintesi del cDNA di primo filamento per l'analisi dell'espressione genica utilizzando qPCR in tempo reale.

Risultati

Il protocollo qui presentato si basa su diversi aspetti degli esperimenti precedentemente pubblicati ^27,30 e sui risultati eseguiti nel nostro laboratorio dove viene stabilito e validato il modello del pesce zebra per lo studio dell'AGS e della risposta immunitaria al α-Gal perché sia l'uomo che il pesce zebra non sintetizzano questa molecola¹³. Questo modello consente la caratterizzazione e la valutazione di una varietà di reazioni all...

Discussione

Il pesce zebra è un modello economico e facile da maneggiare che è stato anche uno strumento molto fattibile per lo studio dei meccanismi molecolari della risposta immunitaria, delle malattie patogene, dei nuovi test farmacologici, della vaccinazione e della protezione contro le infezioni^33,34,35. Lo studio sul comportamento del pesce zebra è utile poiché studi precedenti hanno scoperto che alcune specie di pesci rimangono i...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube	VWR	525-0990
All Prep DNA/RNA	Qiagen	80284
Aquatics facilities
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Disection set	VWR	631-1279
Dog Food - Red Classic	Acana
ELISA plates-96 well	Thermo Fisher Scientific	10547781
Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal)	Dextra	NGP0203
iScript Reverse Transcription Supermix	Supermix	1708840
Microliter syringes	Hamilton	7638-01
Plate reader	any
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417-50TAB
pilocarpine hydrochloride	Sigma	P6503
Pipette tip P10	VWR	613-0364
Pipette tip P1000	VWR	613-0359
Premium food tropical fish	DAPC
Sponge Animal Holder			Made from scrap foam
Stereomicroscope	any
Thermal Cycler Real-Time PCR	any
Tricaine methanesulphonate (MS-222)	Sigma	E10521