Abordagem Cirúrgica, Desafios e Resoluções para o Transplante de Útero em Ratas

Resumo

O presente protocolo descreve todas as etapas essenciais para o sucesso do transplante uterino (TxU) em ratas. O modelo em ratos mostrou-se adequado para promover a implementação clínica de UTx; no entanto, a UTx de ratos é um procedimento altamente complexo que requer instruções cuidadosas.

Resumo

O transplante uterino (UTx) é uma nova abordagem para o tratamento de mulheres com infertilidade absoluta do fator uterino (AUFI). Estima-se que 3%-5% das mulheres sofram de AUFI. Essas mulheres foram privadas da opção de ter filhos até o advento da UTx. A aplicação clínica de UTx foi impulsionada por estudos experimentais em animais, e a primeira UTx bem-sucedida foi alcançada em ratos. Dadas suas características fisiológicas, imunológicas, genéticas e reprodutivas, os ratos são um sistema modelo adequado para tais transplantes. Em particular, seu curto período de gestação é uma clara vantagem, já que o desfecho usual da UTx experimental é a gravidez bem-sucedida com nascido vivo. O maior desafio para modelos de ratos continua sendo a anatomia pequena, que requer habilidades microcirúrgicas avançadas e experiência. Embora a UTx tenha levado à gravidez na clínica, o procedimento não está estabelecido e requer otimização experimental contínua. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado, incluindo a solução de problemas essencial para UTx de ratos, o que deve tornar todo o procedimento mais fácil de entender para aqueles sem experiência neste tipo de microcirurgia.

Introdução

O transplante uterino (UTx) é um novo tratamento para a infertilidade absoluta do fator uterino (AUFI). O IAAU resulta de uma ausência (congênita ou adquirida) ou malformação do útero e afeta 3%-5% das mulheres em todo o mundo¹. Razões éticas, legais ou religiosas descartam a adoção ou barriga de aluguel para muitas mulheres que têm o desejo de maternidade, mas sofrem de AUFI². Para essas mulheres, a UTx continua sendo a única opção para começar sua própria família. A UTx tem sido aplicada na clínica, embora com sucesso misto; O procedimento é tecnicamente desafiador e requer aprimoramento constante para seu estabelecimento clínico.

Em 2014, o primeiro transplante de útero de uma doadora viva (DL) – resultando em gravidez bem-sucedida – foi realizado pelo pioneiro grupo sueco de Brännström³. O primeiro parto após Tx de doador falecido (DD) foi relatado em 2016 no Brasil⁴. Até 2021, mais de 80 UTxs foram realizadas em todo o mundo, porém com uma taxa de sucesso de cerca de 50% e com enxertos provenientes de DL para a maioria¹.

Apesar de não salvar vidas, o UTx é um procedimento cada vez mais popular para satisfazer os desejos da própria progênie. Dessa forma, a demanda por enxertos está aumentando, colocando a doação de DD em um foco futuro. No entanto, a doação DD é complicada devido a exposições isquêmicas consideravelmente mais longas ao frio (e, no caso de morte cardíaca, também quente), elevando os riscos de disfunção e rejeição do enxerto ^5,6. A técnica cirúrgica, a compatibilidade exigente e a imunossupressão associada permanecem questões críticas em relação aos resultados da^TxU7.

Para gerenciar os riscos acima na clínica, modelos animais apropriados para a exploração de isquemia e imunossupressão são necessários. O desfecho clinicamente mais relevante para modelos animais continua sendo o nascimento bem-sucedido; até o momento, gestações após UTx experimental foram alcançadas em camundongos, ratos, ovelhas, coelhos e macacos cynomolgus⁸. Enquanto animais maiores são predestinados a adquirir e otimizar técnicas cirúrgicas, os roedores apresentam a nítida vantagem de curtos períodos de gestação. Portanto, os modelos de roedores são superiores em considerações práticas, financeiras e éticas⁹. No entanto, o principal desafio da UTx em camundongos é a anatomia pequena, com a cirurgia altamente exigente ligada à baixa reprodutibilidade da UTx^{murina 10}. Por outro lado, as ratas são cirurgicamente mais acessíveis e mantêm as vantagens de tempos de gestação curtos. Como tal, o rato tornou-se o modelo de escolha para UTx⁹. Wranning e col. introduziram o modelo de UTx ortotópica em ratos em 2008 e, usando esse modelo, o primeiro nascido vivo após UTx e acasalamento natural foi relatado^11,12,13. Estudos subsequentes tiveram contribuições críticas para a implementação da TxU em humanos⁹.

No entanto, a Tx permanece desafiadora em ratos, e apenas alguns grupos ainda dominam essa técnica cirúrgica. Um obstáculo relevante para a disseminação da UTx de ratos entre os pesquisadores é a falta de uma descrição precisa dos passos microcirúrgicos individuais, das armadilhas e das medidas de acordo para a solução de^problemas14. Este protocolo visa fornecer um guia detalhado para este procedimento microcirúrgico de alta complexidade para facilitar a implementação deste modelo animal em pesquisas futuras.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados seguindo os Regulamentos Animais Federais da Suíça e aprovados pelo Escritório Veterinário de Zurique (n° 225/2019), garantindo o cuidado humano. Ratas virgens Lewis (peso corporal de 170-200 g) e ratas virgens Brown Norway (170-200 g) foram utilizadas como doadoras/receptoras de útero, enquanto ratos Lewis machos (300-320 g) foram utilizados para acasalamento. Os ratos tinham idade entre 12 e 15 meses. Os animais foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais) e alojados em condições controladas e ambiente enriquecido, com livre acesso à água e ração padrão.

1. Recuperação do útero

OBS: Para detalhes sobre o procedimento, favor consultar os relatórios publicados anteriormente^12,13,15.

1. Induzir anestesia com isoflurano e oxigênio dentro de um recipiente de Plexiglas fechado (14 cm x 25 cm x 13 cm) por 1-2 min (5 vol% de isoflurano em O₂).
   1. Administrar buprenorfina por via subcutânea (0,05 mg/kg) e bupivacaína (0,5%, 8 mg/kg) por via subcutânea na região da incisão abdominal planejada 30 minutos antes da cirurgia.
   2. Faça a barba de toda a pele abdominal do rato com um barbeador elétrico.
   3. Use fitas para manter o animal fixado em uma placa de aquecimento durante a cirurgia. Aplique pomada ocular em ambos os olhos.
   4. Manter a anestesia durante o procedimento com isoflurano 2-4 vol% em oxigênio por administração contínua através de um pequeno cone nasal.
   5. Monitorar a profundidade anestésica por parâmetros clínicos sem ferramentas especializadas (frequência respiratória de ~70-120/min - uma queda lenta de 50% é aceitável durante a anestesia; verificar a profundidade anestésica com pinça dos dedos; cor das mucosas deve ser rosa, não azul ou cinza)¹⁶ e ajustar a concentração de isoflurano de acordo.
      NOTA: Opcional: o monitoramento frequente da respiração durante a cirurgia é viável com a ajuda de um assistente.
   6. Confirme a profundidade do anestésico realizando uma pinça do dedo do pé.
   7. Limpe a pele abdominal em movimento circular com três swabs alternados de uma solução antisséptica e álcool a 70%. Deixe secar.
   8. Coloque um pano estéril (ver Tabela de Materiais) com uma janela abdominal sobre o animal.
2. Realizar laparotomia mediana.
   1. Abra o abdome através de uma incisão longa de 6-8 cm na linha média, começando 0,5 cm abaixo do xifesterno em direção ao hipogástrio. Use um bisturi nº 10 para a incisão da pele e uma pequena tesoura afiada para a incisão da linha alba. Não danifique o fígado ou a bexiga.
   2. Mova os intestinos para fora da cavidade abdominal usando cotonetes, cubra-os suavemente com uma gaze umedecida com soro fisiológico estéril e proteja-os com um saco plástico estéril para melhor isolamento.
   3. Insira afastadores ou clipes (ver Tabela de Materiais) nas pastas da parede abdominal esquerda e direita para manter o músculo peritoneal de lado e o abdome aberto, para obter acesso e visibilidade ideais do útero e vasos associados. Fixe os clipes/afastadores com fitas.
   4. Aplicar soro fisiológico pré-aquecido para manter a área cirúrgica e os intestinos úmidos e evitar o ressecamento das vísceras.
3. Retirar o corno uterino direito com a cavidade uterina comum e o colo do útero, além de pedículos vasculares, incluindo os vasos uterinos direitos, internos e ilíacos comuns.
   1. Ligate (4/0 poliglactina; ver Tabela de Materiais), cauterizar e cortar o corno uterino esquerdo adjacente à ramificação da cavidade uterina comum.
   2. Remova o excesso de gordura ao redor do útero e da vagina.
      NOTA: Mantenha a gordura ao redor do sistema vascular uterino.
   3. Dissecar a bexiga em sua fixação ao colo do útero com cauterização de todos os vasos vesicais de drenagem e alimentação. Durante a cauterização, mantenha uma distância adequada entre o colo do útero e a vagina para evitar a cauterização desnecessária dessas duas estruturas. Caso contrário, o risco de necrose do enxerto aumenta.
      NOTA: A maioria das manipulações cirúrgicas deve afetar a bexiga. Retrair ou puxar a bexiga caudalmente com uma pinça vascular (ver Tabela de Materiais) para obter uma melhor visão da escavação vesicouterina.
   4. Cauterizar e cortar os vasos uterinos descendentes ao nível do ureter o mais distal possível ao colo uterino.
      NOTA: Mantenha a microcirculação ao redor da vagina e do colo do útero o máximo possível durante a divisão.
   5. Separe a porção cervical/vaginal do futuro enxerto da fixação retal e dos ligamentos paravaginal e paracervical.
      NOTA: Evitar qualquer cauterização na vagina do enxerto.
   6. Dissecar cuidadosamente a vagina através de diatermia em torno de 2-3 mm caudal do colo do útero.
      NOTA: Nenhuma vilosidade (colo do útero) é visível dentro do lúmen vaginal.
   7. Localizar a artéria e a veia uterinas em suas origens. Ligate (poliamida 8/0; ver Tabela de Materiais), cauterizar e cortar os vasos glúteos e todos os vasos caudais dos vasos uterinos.
      NOTA: A ligadura direta da veia ilíaca comum caudal à veia uterina geralmente é possível.
   8. Por dissecção romba, libere os vasos ilíacos comuns uns dos outros, da bifurcação da aorta e da veia cava até a divisão dos vasos uterinos.
      NOTA: Pode-se obter melhor acesso cirúrgico à área removendo um ou dois linfonodos adjacentes.
   9. Excisar o corno uterino direito a 3 mm da tuba uterina após cauterização do pedículo útero-ovariano no mesmo nível. Isso permite a anastomose do corno uterino do enxerto com a parte superior do corno uterino receptor.
   10. Colocar ligaduras (poliamida 8/0) diretamente ao redor da artéria e veia ilíaca comum direita, proximal às bifurcações aórtica e cava. Faça uma pequena incisão (0,5-1 mm) na artéria ilíaca comum direita adjacente à bifurcação e insira uma agulha 30 G dobrada e embotada ou uma agulha reta 25 G embotada no lúmen (para rubor). Prenda-o com uma ligadura (poliamida 6/0).
       NOTA: Uma outra opção é a fixação adicional com uma braçadeira de buldogue para evitar o deslocamento da agulha e/ou vaso.
   11. Dissecar a veia ilíaca comum caudalmente da ligadura na veia ilíaca comum direita para permitir a saída durante o flushing.
4. Lave o enxerto seguindo os passos abaixo.
   1. Lave o útero manualmente usando seringas de 3 mL com aproximadamente 9 mL de solução fria de Ringer (RHX: Ringer suplementado com 50 UI/mL de heparina e 0,4 mg/mL de xilazina) a um fluxo de 6 mL/min. Lavar novamente com 6 ml de solução de preservação de órgãos suplementada com heparina (50 UI/ml) e xilazina (0,4 mg/ml) (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Evite alta pressão de lavagem e garanta a colocação adequada da agulha.
   2. Remova o transplante quando o tecido uterino estiver pálido. Cortar a artéria ilíaca comum caudalmente da ligadura na bifurcação da aorta abdominal.
5. Colocar o transplante em solução refrigerada de preservação de órgãos (4 °C) para preparação e armazenamento da mesa traseira antes do transplante.
6. Após a retirada do enxerto, o animal foi sacrificado, primeiro com o ajuste de isoflurano ao máximo e, em seguida, induzindo-se pneumotórax bilateral seguido de exsanguinação¹⁷.

2. Transplante de útero singênico

OBS: Para detalhes sobre o procedimento, favor consultar os relatórios publicados anteriormente^12,13,15.

1. Induzir a anestesia e preparar o animal conforme mencionado no passo 1.1.
   1. Administrar analgesia eficaz (conforme descrito no passo 1.1.1) e 200 UI/kg de heparina de alto peso molecular 30 minutos antes da cirurgia.
2. Realizar laparotomia mediana.
   1. Abra o abdome através de uma incisão mediana de 6-8 cm de comprimento começando 0,5 cm abaixo do xifesterno em direção ao hipogástrio. Use um bisturi nº 10 para a incisão da pele e uma pequena tesoura afiada para a incisão da linha alba. Não danifique o fígado e a bexiga.
   2. Mova os intestinos delgados para fora da cavidade abdominal usando cotonetes, envolva-os com uma gaze estéril umedecida e cubra-os com um saco plástico estéril para melhor isolamento.
   3. Insira afastadores ou clipes nas pastas da parede abdominal esquerda e direita para manter o músculo peritoneal de lado e o abdome aberto, para obter o acesso e a visibilidade ideais do útero e dos vasos associados. Fixe os clipes/afastadores com fitas.
   4. Aplicar soro fisiológico pré-aquecido para manter a área cirúrgica e os intestinos úmidos e evitar o ressecamento das vísceras.
3. Realizar histerectomia com dissecção e mobilização do terço superior da vagina a partir do reto e da bexiga.
   1. Cauterizar a microvasculatura ao redor do útero, colo do útero e vagina. Corte e separe o útero das estruturas circundantes próximas ao órgão para proteger a microcirculação do sinistro uterino.
   2. Remova o tecido adiposo dos arredores.
   3. Amputar o corno esquerdo por cauterização. Do lado direito, preservar um segmento de 7-8 mm da parte superior do útero para posterior anastomose ao enxerto uterino.
4. Realizar transplante de útero.
   1. Mobilizar e separar os vasos ilíacos comuns direitos, desde a origem dos vasos uterinos até a bifurcação aorto/cava.
   2. Posicione o enxerto na cavidade abdominal. Embrulhe o enxerto em uma gaze embebida em solução fria de preservação de órgãos.
      OBS: O enxerto precisa ser mantido frio durante a anastomose.
   3. Colocar pinças vasculares atraumáticas na veia ilíaca comum direita de cada lado, enquadrando o local da anastomose futura.
      NOTA: Abaixe a anestesia para 1-1,5 vol% de isoflurano para se adaptar à diminuição súbita da pré-carga cardíaca e à hipotensão resultante.
   4. Corte uma fenda ligeiramente maior do que a abertura da veia do enxerto na veia ilíaca comum.
   5. Posicione a veia do enxerto.
   6. Coloque uma sutura de permanência (poliamida 10/0; ver Tabela de Materiais) em cada canto da fenda na veia ilíaca comum direita.
      OBS: Mantenha o nó de sutura no canto caudal solto para melhor ajuste e evitar efeitos de bolsa-corda.
   7. Lave regularmente a área da anastomose com RHX resfriado durante o procedimento para evitar tromboses.
   8. Anastomosar um lado da veia do enxerto à veia do receptor com seis a oito alças de sutura contínua (Figura 1).
      OBS: Iniciar com a sutura de estaca cranial (poliamida 10/0) e anastomosar primeiramente a parte de entrada dos vasos.
   9. Anastomose o outro lado do vaso da mesma maneira, desta vez começando por fora.
   10. Amarrar um nó na sutura de estaca cranial e, em seguida, um na sutura de suspensão caudal (poliamida 10/0), após terminar as anastomoses em ambos os lados.
       NOTA: Aperte as suturas contínuas apenas o quanto necessário para evitar efeitos de corda de bolsa.
   11. Colocar pinças vasculares atraumáticas na artéria ilíaca comum direita de cada lado, enquadrando o local da anastomose futura.
   12. Realizar a anastomose arterial (artéria ilíaca comum direita [AICD] através de 8-10 alças utilizando pontos interrompidos (poliamida 10/0).
       OBS: As suturas interrompidas são mais fáceis de controlar do que as contínuas (opcional com a técnica "boca de peixe")¹⁸. A lavagem constante da área da anastomose com RHX resfriado durante o procedimento ajuda a prevenir tromboses. Ao utilizar suturas contínuas, realizar esta etapa análoga à anastomose venosa.
5. Realizar reperfusão do enxerto.
   1. Quando ambos os locais de anastomose parecerem pérvios e qualquer sangramento for interrompido, solte as pinças vasculares nos vasos do enxerto (Figura 2).
   2. Inspecione o enxerto em busca de sinais de reperfusão, como vermelhidão, enchimento da veia ou pulsação na artéria do enxerto.
   3. Conectar o manguito vaginal do transplante à abóbada vaginal da receptora usando seis a sete pontos intraluminais (6/0 poliglactina) interrompidos.
      OBS: Iniciar com uma única sutura na posição 12 horas primeiro, e colocar as próximas nas posições 10 e 1 hora. As duas suturas nas posições 9 e 3 horas devem ser amarradas após as suturas na primeira fileira^19,20.
   4. Anastomosar o enxerto do corno uterino término-a-terminal ao segmento uterino cranial remanescente do útero receptor usando cinco a sete suturas interrompidas (poliamida 7/0).
      OBS: Não costurar através do lúmen.
6. Fechar o abdome com uma sutura contínua. Utilizar poliglactina 4/0 para sutura da camada muscular e poliamida 6/0 ou clipes da ferida cirúrgica para a pele.
7. Deixe o animal se recuperar em uma gaiola aquecida assim que o transplante for concluído. Permanecer com o animal até que ele tenha recuperado a capacidade de decúbito esternal e manter alojamento único até sua recuperação completa. Fornecer tratamento de analgesia psotopertaive administrando buprenorfina (0,05 mg/kg) por via subcutânea e AINE adequado, porém não antes de 4-8 horas após a primeira dose de anestesia. Fornecer continuamente buprenorfina através de água potável (1 mg/kg, via oral, 5 mL de buprenorfina em 160 mL de água potável (0,3 mg/mL)) por três dias após a cirurgia.
8. A sutura da pele é removida 10-14 dias após a certeza.

Resultados

Resultados de dois grupos de ratos são apresentados. A Tx foi realizada antes (grupo 1, n = 8) e após (grupo 2, n = 8) ajuste do protocolo (Tabela 1) para demonstrar os efeitos de nossas modificações (consulte a Discussão para uma explicação de nossas modificações)^12,15,21.

O resultado da UTx de ratos está associado a três fases principais. A primeira fase ...

Discussão

O protocolo aqui apresentado oferece instruções detalhadas para a abordagem cirúrgica por trás do transplante de útero em ratas. O protocolo foi otimizado para aumentar as chances de nascidos vivos após TxU e subsequente acasalamento. O protocolo original foi retomado do grupo de Brännström12,13, inspirado no trabalho em camundongos de Akouri et ^al.10, e modificado com base nas experiências dos autores nos últimos anos. Como tal,...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angled to Side Scissor 5 mm	F.S.T	15008-08
Big Paper Clip	No specific		Used as retractor
Blunt Bend Needle G30	Unimed S.A.
Bupivacain 0.5%	Sintetica
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Temgesic
Dosiernadel G25	H.SIGRIST& PARTNER AG
Dumont #5SF Forceps	F.S.T	11252-00
Ethilon 10/0	Ethicon	2810G
Ethilon 6/0	Ethicon	667H
Ethilon 7/0	Ethicon	EH7446H
Ethilon 8/0	Ethicon	2808G
Femal Brown Norway Rats (150-170 g)	Janvier
Femal Lewis Rats (150-170 g)	Charles River Deutschland
Fine Scissors - Sharp	F.S.T	14060-09	Any other small scissor works too
Halsey Micro Needle Holder	F.S.T	12500-12	Any other small needholder works too
Heparin Natrium 25000 I.E./ 5 mL	B. Braun
Institute Georges Lopez Perfusion Solution (IGL)	Institute Georges Lopez		Organ preservation solution
Male Lewis Rats (300-320 g)	Charles River Deutschland
Micro Serrefines 13 mm	F.S.T	18055-04
Micro Serrefines 16 mm gebogen	F.S.T	18055-06
Micro-Serrefine Clamp Applicator with Lock	F.S.T	18056-14
Mölnlyncke Op Towel	Mölnlyncke	800300	Sterile drape
NaCl 0.9%	B.Braun
Octenisept	Schülke
Paper Tape	Tesa		For fixing the animal
Philips Avent Schneller Flaschenwärmer SCF358/02	Philips	12824216
Ringerfundin	B.Braun
Rompun 2%	Bayer		Xylazine
Round Handled Needle Holders	F.S.T	12075-12
Round Handled Needle Holders	F.S.T	12075-12
S&T Vessel Dilating Forceps - Angled 45°	F.S.T	00276-13
Sacryl Naht	KRUUSE	152575
Scapel No 10	Swann Morton	201
Small Histo-Container			Any small histo-container works fine-for coldstorage of the graft
Small Plastik Bags			Any transparant plastic bags are fine
Steril Cotton swab	Lohmann-Rauscher		Any steril cotton swab is fine
Sterile Gauze	Lohmann-Rauscher		Any steril gauze is fine
Straight Scissor 8mm	F.S.T	15024-10
Surgical microscope – SZX9	Olympus	OLY-SZX9-B
Sutter Non Stick GLISS 0.4 mm	Sutter	78 01 69 SLS
Suture Tying Forceps	F.S.T	00272-13
ThermoLux warming mat	ThermoLux
Tissue Forceps for Skin			Any tissue forceps are fine
Vesseldilatator Forceps	F.S.T	00125-11
Vicryl  plus 4/0	Ethicon	VCP292H