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要約

このプロトコルでは、翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)法と特定の細胞タイプでタグ付けされた核の単離(INTACT)法が、Cyp17a1-Creマウス系統に交配されたNuTRAPマウスモデルを使用して、細胞特異的卵巣トランスクリプトームとエピゲノムのペアインプロゲーション用に最適化されました。

要約

細胞型特異的なエピゲノムおよびトランスクリプトームの変化を評価することは、卵巣の老化を理解するための鍵です。この目的のために、翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)法の最適化と特定の細胞型でタグ付けされた核の単離(INTACT)法が、新しいトランスジェニックNuTRAPマウスモデルを使用した細胞特異的卵巣トランスクリプトームとエピゲノムのその後のペアインテロゲーションのために行われました。NuTRAP対立遺伝子の発現は、フロックスSTOPカセットの制御下にあり、プロモーター特異的Cre株を使用して特定の卵巣細胞型を標的とすることができます。最近の研究では、卵巣間質細胞が早期老化表現型の駆動に関与していることが示されているため、NuTRAP発現システムは、Cyp17a1-Creドライバーを使用して間質細胞を標的としました。NuTRAP構築物の誘導は卵巣間質線維芽細胞に特異的であり、シーケンシング研究に十分なDNAおよびRNAが単一の卵巣から得られた。ここで紹介するNuTRAPモデルと方法は、利用可能なCre株を持つ任意の卵巣細胞タイプの研究に使用できます。

概要

卵巣は体細胞老化の主要なプレーヤーであり1、特定の細胞集団からの明確な寄与があります。卵巣の細胞不均一性は、バルク、全卵巣アッセイからの分子結果を解釈することを困難にします。卵巣の老化における特定の細胞集団の役割を理解することは、高齢女性の生殖能力と健康低下の原因となる分子ドライバーを特定するための鍵です。従来、特定の卵巣細胞タイプのマルチオミクス評価は、レーザーマイクロダイセクション2、シングルセルアプローチ3、またはセルソーティング4などの技術によって達成されていました。しかし、マイクロダイセクションは費用がかかり、実行が困難な場合があり、細胞の選別は細胞の表現型プロファイルを変化させる可能性があります5。

卵巣細胞型特異的なエピゲノムおよびトランスクリプトミクスプロファイルを評価するための新しいアプローチは、核タグ付けおよび翻訳リボソームアフィニティー精製(NuTRAP)マウスモデルを使用します。NuTRAPモデルでは、アフィニティー精製法(翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)および特定の細胞タイプでタグ付けされた核の単離(INTACT)6)を使用することで、細胞ソーティングを必要とせずに細胞種特異的核酸を単離できます。NuTRAP対立遺伝子の発現は、フロックスSTOPカセットの制御下にあり、プロモーター特異的Cre株を使用して特定の卵巣細胞型を標的とすることができます。NuTRAPマウスを細胞型特異的Creラインと交差させることにより、STOPカセットを除去すると、リボソーム複合体のeGFPタグ付けと核のビオチン/mCherryタグ付けがCre依存的に行われます6。次に、TRAPおよびINTACT技術を使用して、目的の細胞型からmRNAおよび核DNAを分離し、トランスクリプトームおよびエピゲノム解析に進むことができます。

NuTRAPモデルは、脂肪組織6、脳組織7、8、9、網膜10などのさまざまな組織で使用されており、全組織ホモジネートでは検出されない可能性のある細胞型特異的なエピゲノムおよびトランスクリプトームの変化を明らかにしています。従来の細胞選別技術に対するNuTRAPアプローチの利点には、1)生体外活性化アーティファクトの防止8、2)特殊な機器(すなわち、細胞選別機)の必要性の最小化、および3)細胞タイプ特異的分析のスループットの向上とコストの削減が含まれます。さらに、1匹のマウスから細胞種特異的なDNAとRNAを単離できるため、統計的検出力を高めるペア分析が可能になります。最近の研究では、卵巣間質細胞が早期老化表現型11,12,13の駆動に関与していることが示されているため、Cyp17a1-Creドライバーを使用してNuTRAP発現系を間質細胞とテカ細胞に標的化しました。ここでは、NuTRAP構築物の誘導が卵巣間質細胞とテカ細胞に特異的であり、シーケンシング研究に十分なDNAとRNAが単一の卵巣から得られることを実証します。ここで紹介するNuTRAPモデルと方法は、利用可能なCre株を持つあらゆる卵巣細胞タイプの研究に使用できます。

細胞型特異的卵巣NuTRAPマウス株の作製のために、核タグおよび翻訳リボソームアフィニティー精製(NuTRAP)対立遺伝子は、BirA、ビオチンリガーゼ認識ペプチド(BLRP)タグ付きmCherry/mRANGAP1、およびeGFP/L10aの発現を制御するフロックスSTOPコドンを有する。細胞型特異的Creラインと交差させると、NuTRAPカセットの発現は核タンパク質mRANGAP1をビオチン/mCherryで標識し、リボソームタンパク質L10aをeGFPでCre依存的に標識します。これにより、細胞選別を必要とせずに、特定の細胞タイプから核およびmRNAを単離することができます。NuTRAPフロックス/フロックス は、卵巣細胞タイプに関連する細胞タイプ特異的Creと組み合わせて、これを評価することができます。

プロトコル

すべての動物の手順は、オクラホマ医学研究財団(OMRF)の施設内動物管理および使用委員会によって承認されました。親マウスはジャクソン研究所(メイン州バーハーバー)から購入し、OMRFで14時間/ 10時間の明暗サイクル(午前6:00に点灯)でHEPAバリア環境でSPF条件下で飼育および飼育されました。

注:このデモンストレーションでは、Cyp17iCre+/-(株#028547、ジャクソン研究所)のオスとNuTRAPのメス(株#029899、ジャクソン研究所)のペアを使用します。所望のCyp17-NuTRAP子孫(Cyp17iCre+/−;NuTRAPflox/WT)は、卵巣間質細胞においてCyp17a1プロモーターの制御下でNuTRAP対立遺伝子を発現する。この原稿作成には、4ヶ月齢の雌のCyp17-NuTRAPマウス(n=4)を用いた。Cyp17iCreおよびNuTRAP導入遺伝子の遺伝を確認するためのジェノタイピング、および1)ジェネリックCre、2)Cyp17iCre、および3)NuTRAPフロックスのPCR検出のために、マウスイヤーパンチサンプルからDNAを抽出しました。

1.マウス卵巣解離

  1. 動物の世話のガイドラインと施設の承認に従ってマウス安楽死を行い、続いて卵巣を採取します。
  2. 卵巣を解剖して、卵巣組織に付着している可能性のある脂肪組織または卵管の一部を取り除き、卵巣をバッファー付きのチューブに入れます。すぐにTRAPまたはインタクトテクニックに進みます。
    注:このプロトコルは、凍結組織での使用に最適化されていません。各手法に同じマウスの1つの卵巣を使用することは、将来の統計分析に推奨されます。

2.特定の卵巣細胞型からの核の分離

  1. バッファー調製
    1. 核精製バッファー(NPB):100 mLのNPBを調製するには、2 mLの1 M HEPES(最終濃度:20 mM HEPES)、0.8 mLの5 M NaCl(40 mM NaCl)、4.5 mLの2 M KCl(90 mM KCl)、0.4 mLの0.5 M EDTA(2 mM EDTA)、0.1 mLの0.5 M EGTA(0.5 mM EGTA)、 92.2 mLのヌクレアーゼフリー水。核分離当日に1xプロテアーゼ阻害剤を補給します。
      注:NPBは、プロテアーゼ阻害剤なしで事前に調製することができ、4°Cで最大3週間持続します。
    2. 核溶解バッファー(完全):核分離当日に1xプロテアーゼ阻害剤を核溶解バッファーに補充します。
  2. 核懸濁液の作成
    注意: 特に明記されていない限り、サンプルは常に氷上に維持する必要があります。
    1. Cyp17-NuTRAPマウス(または他の関連するCre-NuTRAP)から500 μLの核溶解バッファー(完全)で1つの卵巣を採取します。自己開放マイクロハサミを使用して、バッファー内の卵巣を8つの部分に切り刻みます。
    2. ワイドボアピペットチップを使用して、ミンチ卵巣と500 μLの溶解バッファーを氷上のガラス製Dounceホモジナイザーに移します。緩い乳棒Aで卵巣を10x-20xホモジナイズし、400 μLの溶解バッファーをDounceホモジナイザーに加え、乳棒Aを洗浄します。
    3. タイトな乳棒B 10x-20xで卵巣を均質化します。1,000 μLの溶解バッファーを加え、乳棒Bを洗浄し、ホモジネート(1.9 mL)を2 mLの丸底チューブに移します。
    4. 200 x g で4°Cで1.5分間遠心分離し、解離していない組織と血管を除去します14。上清には核が含まれています。解離していない組織のペレットを捨てる。
    5. 30 μmのセルストレーナーを100 μLの溶解バッファーで事前に濡らした後、上清をセルストレーナーを通して15 mLのコニカルチューブにろ過します。次に、核含有混合物を2mLの丸底チューブに移します。
    6. サンプルを500 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。ペレットは核を含む。
    7. 核ペレットを250 μLの氷冷溶解バッファーに再懸濁し、中速から高速で短時間ボルテックスします。1.5 mLの溶解バッファーを加えて、容量を1.75 mLまで上げます。穏やかに混合し、核懸濁液を氷上で5分間休ませます。
    8. 500 x g で4°Cで5分間遠心分離することにより、核をペレット化します。 核ペレットを乱すことなく上清を慎重に廃棄する。ペレットを200 μLの氷冷保存バッファーに再懸濁し、短時間ボルテックスして核ペレットを完全に再懸濁します。
    9. 再懸濁したペレット(20 μL)の10%を下流分析用の投入核サンプルとして確保します。
    10. 再懸濁した核ペレットを取り、氷冷したNPBで容量を2.0 mLに補います。INTACTアフィニティベースの精製法を使用して標識核を分離します。
  3. 特定の細胞タイプでタグ付けされた核の単離(INTACT)
    1. バイアル中のストレプトアビジンビーズを中速で30秒間ボルテックスし、完全に再懸濁されていることを確認します。各サンプルの再懸濁ビーズ30 μLを2 mLの丸底チューブ(1本のチューブで最大10サンプルのビーズを洗浄可能)に加え、1 mLのNPBを加え、ピペッティングでよく再懸濁します。
    2. チューブを磁気ラックに1分間置き、ビーズを分離します。上清を廃棄し、チューブを磁石から取り外します。洗浄した磁気ビーズを1 mLのNPBに再懸濁します。
    3. 洗浄手順を繰り返して、合計3回の洗浄を行います。最終洗浄後、ビーズをNPBの初期容量(サンプルあたり30 μL)に再懸濁します。
    4. 洗浄したビーズ30 μLをステップ2.2.10の2 mL核懸濁液に加えます。ビーズと核の混合物をピペッティングし、チューブを静かに反転させて、十分に再懸濁します。
    5. チューブを冷蔵室または冷蔵庫の回転ミキサーに低速で30分間置きます。同じ条件でビーズなしで入力サンプルをインキュベートします。
    6. 核懸濁液とビーズを入れたチューブを磁石の上に置き、ストレプトアビジンビーズ(正画分)に結合したビオチン化核を核の負分画から分離します。ビーズを磁石上で3分間分離させます。
    7. 上清を取り除き、陰性画分を新しい2.0 mLチューブに渡し、氷上で保存します。ポジティブフラクションチューブごとに、チューブを磁石から取り外し、内容物を1 mLのNPBに再懸濁します。
    8. チューブを磁石の上に1分間置き、上清を捨てます。チューブを磁石から取り外し、洗浄したビーズと核の混合物を1 mLのNPBに再懸濁します。
    9. 手順2.3.8を繰り返して、合計3回の洗浄を行います。3回の洗浄が完了したら、陽性画分のビーズ-核混合物を30 μLのNPBに再懸濁します。
    10. 各負分画チューブについて、ステップ2.3.7の核懸濁液を500 x g で4°Cで7分間遠心分離します。 上清を注意深く吸引して廃棄します。ネガティブフラクション核ペレットを30 μLのNPBに再懸濁します。
    11. インプットからの核(ステップ2.2.9)、負の画分(ステップ2.3.10)、および正の分画(ステップ2.3.9)を、核DNAまたはRNAを単離する準備ができるまで-80°Cの冷凍庫に保存します。
      注:インプットとして無傷の核を必要とするプロトコル(すなわち、トランスポザーゼアクセス可能なクロマチン、クロマチン免疫沈降のアッセイ)のために核を凍結しないでください。

3. 特定の卵巣細胞型からのmRNAの単離

  1. バッファーの準備
    1. TRAPバッファーベース:78.8 mLのRNaseフリー水、5 mLの1 M Tris-HCl(最終濃度:50 mM Tris [pH 7.5])、5 mLの2 M KCl(100 mM KCl)、1.2 mLの1 M MgCl 2(12 mM MgCl2)、および10 mLの10%NP-40(1%NP-40)を組み合わせて、100 mLのTRAPバッファーベースを調製します。4°Cで最長1ヶ月間保管してください。
    2. 高塩緩衝塩基:68.8 mLのRNaseフリー水、5 mLの1 M Tris-HCl(最終濃度:50 mM Tris [pH 7.5])、15 mLの2 M KCl(300 mM KCl)、1.2 mLの1M MgCl 2(12 mM MgCl2)、および10 mLの10%NP-40(1%NP-40)を組み合わせて、100 mLの高塩緩衝塩基を調製します。4°Cで最長1ヶ月間保管してください。
    3. TRAPホモジナイゼーションバッファー(完全):組織採取日にサンプルあたり1.5 mLを調製します。10 mLのTRAPバッファーベース(ステップ3.1.1から)と10 μLの100 mg/mLシクロヘキシミド(最終濃度:100 μg/mLシクロヘキシミド)、10 mgのヘパリンナトリウム(1 mg/mLヘパリンナトリウム)、20 μLの0.5 M DTT(1 mM DTT)、50 μLの40 U/μL RNase阻害剤(200 U/mL RNase阻害剤)を組み合わせて、10 mLのTRAPホモジナイゼーションバッファーを調製します。 200 μLの0.1 Mスペルミジン(2 mMスペルミジン)、および1つのEDTAフリープロテアーゼ阻害剤錠剤(1x)。
    4. 低塩分洗浄バッファー(完全):組織採取当日にサンプルあたり1.5mLを作ります。10 mLの低塩洗浄バッファーを作るには、10 mLのTRAPバッファーベース(ステップ3.1.1から)を10 μLの100 mg/mLシクロヘキシミド(100 μg/mLシクロヘキシミド)および20 μLの0.5 M DTT(1 mM DTT)と組み合わせます。
    5. 高塩分洗浄バッファー(完全):TRAP分離の2日目にサンプルあたり1.5 mLを作ります。10 mLの高塩洗浄バッファーを作るには、10 mLの高塩バッファーベース(ステップ3.1.2から)を10 μLの100 mg/mLシクロヘキシミドおよび20 μLの0.5 M DTTと組み合わせます。
  2. 翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)の実行
    1. Cyp17-NuTRAPマウス(または他の関連するCre-NuTRAP)から他の卵巣を採取し、100 μLの氷冷TRAPホモジナイゼーションバッファーを含む1.5 mL RNaseフリーチューブに入れます(ステップ3.1.3から)。自己開放マイクロハサミを使用して、バッファー内の卵巣を8つの部分に切り刻みます。
    2. ワイドボアチップを使用して、卵巣と100 μLのホモジナイズバッファーをガラス製Dounceホモジナイザーに移します。緩い乳棒Aで10x-20xホモジナイズし、400 μLのTRAPホモジナイズバッファーを加え、乳棒Aを洗浄します。
    3. ホモジネートを2 mLの丸底チューブに移します。追加の1 mLのTRAPホモジナイゼーションバッファーでDounceホモジナイザーを洗浄し、洗浄したボリュームを2 mLの丸底チューブに移します。
    4. ホモジネートを12,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 透明の上清を新しい2 mLの丸底チューブに移します。ペレットを廃棄します。
    5. 透明にしたホモジネート100 μLを新しい2 mLの丸底チューブに移し、氷上でインプットとして保存します。
    6. 透明化したホモジネートの残り(ステップ3.2.4から)を抗GFP抗体(5 μg/mL)とともに、エンドオーバーエンドで回転させながら4°Cで1時間インキュベートします。同じ条件で入力サンプルをインキュベートします。
    7. インキュベーションの最後の15分間で、次のステップ(3.2.8-3.2.11)を使用して、低塩洗浄バッファーでプロテインG磁気ビーズを洗浄します。
    8. プロテインG磁気ビーズのバイアルを30秒間ボルテックスし、完全に再懸濁します。各サンプルのプロテインG磁気ビーズ50 μL(1本のチューブで最大10サンプルを洗浄可能)を2 mLの丸底チューブに移します。
    9. 500 μLの減塩洗浄バッファーをビーズに加え、ピペットで軽く混ぜます。チューブを磁気スタンドに1分間置き、チューブの側面に対してビーズを収集します。上清を取り除いて廃棄する。
    10. チューブを磁気スタンドから取り外し、1 mLの減塩洗浄バッファーをチューブに追加します。ピペットでやさしく混ぜます。チューブを磁気スタンドに1分間置き、チューブの側面に対してビーズを収集します。上清を取り除いて廃棄する。
    11. 手順3.2.10を繰り返して、合計3回の洗浄を行います。最終洗浄後、チューブを磁気ラックから取り出し、ビーズを低塩洗浄バッファーの初期容量(サンプルあたり50 μL)に再懸濁します。
    12. 再懸濁した洗浄ビーズ(50 μL)を抗原サンプル/抗体混合物に移し、エンドオーバーエンドミキサーで回転させながら4°Cで一晩インキュベートします。入力サンプルを4°Cで一晩回転させてインキュベートし、同等の条件を維持します。
    13. 一晩インキュベーションした後、ローテーターからチューブを取り外し、磁気スタンドを使用して上清(陰性画分)からターゲットリボソーム/ RNA(陽性画分)を含む磁気ビーズを2.5〜3分間分離します。陰性画分を吸引し、新しい2 mLの丸底チューブに入れ、陽性画分を処理しながら氷上に置きます。
    14. 500 μLの高塩分洗浄バッファー(ステップ3.1.5から)をポジティブ画分を含むチューブに加え、穏やかにピペットで混合します。氷上に1分間維持された磁気スタンドにチューブを置き、ビーズを分離します。上清を廃棄し、チューブを磁石から取り外します。
    15. 手順3.2.14を繰り返して、合計3回の洗浄を行います。最終洗浄後、3.5 μLの2-メルカプトエタノール(BME)を添加した350 μLのRNA溶解バッファーにビーズを再懸濁します。チューブを室温でインキュベートし、デジタルシェーカーで900rpmで10分間混合します。
    16. ターゲットリボソーム/RNAを含む溶液からビーズを磁気スタンドで室温で1分間分離します。溶出した陽性画分(上清)を新鮮な1.5 mLチューブに集め、350 μLの100%エタノールを加えます。反転して混ぜます。RNA単離に進みます。
    17. オプション:インプットサンプル(ステップ3.2.5)およびネガティブフラクション(ステップ3.2.13)からRNAを単離するには、100 μLの入力フラクションとネガティブフラクションを新しい1.5 mLチューブに移します。3.5 μLのBMEを添加した350 μLのRNA溶解バッファーを各サンプルに加えます。反転して混ぜます。各チューブに250 μLの100%エタノールを加え、反転させて混合します。RNA単離に進みます。
  3. RNA単離
    1. 700 μLのポジティブフラクション、およびオプションでインプットフラクションおよび/またはネガティブフラクションをRNAスピンカラムに移します。製造元の指示に従って、スピンカラムからRNAを分離します。

結果

TRAPプロトコルとINTACTプロトコルの回路図を図1に示します。ここでは、卵巣間質/テカ細胞に対するCyp17-NuTRAPマウスモデルの特異性は、免疫蛍光イメージングおよびTRAP単離されたRNAからのRNA-Seqによって実証されています。まず、卵巣におけるeGFPシグナルの免疫蛍光イメージングと、theca細胞および間質細胞へのeGFPシグナルの局在化を行った。簡単に説明すると、5μm切片...

ディスカッション

NuTRAPマウスモデル6は、利用可能なCreドライバーを使用して任意の細胞タイプに適応できる、特定の細胞タイプからのトランスクリプトームとエピゲノムのペアインベリングのための強力なトランスジェニック標識アプローチです。ここでは、卵巣細胞と間質細胞を標的とするCyp17-NuTRAPマウスモデルの特異性を示します。Cyp17-NuTRAPモデルは、卵巣の老化、癌、および疾患に関...

開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、国立衛生研究所(NIH)(R01AG070035、R01AG069742、T32AG052363)、ブライトフォーカス財団(M2020207)、および長老派健康財団からの助成金によって支援されました。この作業は、米国(US)のMERIT賞I01BX003906および共有機器評価プログラム(ShEEP)賞ISIBX004797によっても部分的にサポートされました。退役軍人省、生物医学研究所研究開発サービス。著者らはまた、臨床ゲノミクスセンター(OMRF)とイメージングコアファシリティ(OMRF)の支援と機器の使用に感謝したいと思います。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 M SpermidineSigma-Aldrich05292-1ML-F
1 M MgCl2Thermo ScientificAM9530G
10% NP-40Thermo Scientific85124
100 mg/mL CycloheximideSigma-AldrichC4859-1ML
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148
30 µm cell strainer Miltenyi Biotec130-098-458
All Prep DNA/RNA Mini KitQiagen80204
anti-GFP antibodyAbcamAb290For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP)
Buffer RLTQiagen79216RNA Lysis Buffer in protocol
cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tabletRoche11836170001For TRAP Homogenization Buffer
Cyp17iCre mouse modelThe Jackson Laboratory28547B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J
DynaMag-2 magnetInvitrogen12321D
Genotyping PrimersIDTCustomGeneric Cre - Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339
      Cyp17iCre - Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663
      NuTRAP - Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626
Halt Protease Inhibitor cocktail (100X)Thermo Scientific1861278For NPB Buffer
M-280 Streptavidin Dynabeads Invitrogen11205D2.8 µm bead diameter
MixMateEppendorf5353000529
Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ PrepSigma-AldrichNuc101Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer
1 M HEPESGibco15630-080
5 M NaClThermo ScientificAM9760G
2M KClThermo ScientificAM9640G
0.5 M EDTAThermo ScientificAM9260G
0.5 M EGTAFisher Scientific50-255-956
NuTRAP mouse modelThe Jackson Laboratory29899B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J
Pierce DTT No-Weigh FormatThermo ScientificA39255
Protein G DynabeadsThermoFisher10004DFor TRAP
RNaseOUTInvitrogen10777019
Sodium HeparinFisher ScientificBP2425
Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5Invitrogen15567-027
VWR Tube RotatorFisher ScientificNC9854190

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