تقنيات وممارسات زراعة الخلايا لتجنب التلوث بالفطريات والبكتيريا في مختبر زراعة الخلايا البحثية

Summary

يقدم هذا البروتوكول تقنيات وممارسات زراعة الخلايا الأساسية لاستخدامها في مختبر زراعة الخلايا البحثية لتجنب التلوث بالفطريات والبكتيريا. ضمن فئة البكتيريا ، سيتم التركيز بشكل خاص على منع تلوث الميكوبلازما.

Abstract

زراعة الخلايا هي مهارة دقيقة ضرورية لزراعة الخلايا البشرية والحيوانية والحشرية ، أو الأنسجة الأخرى ، في بيئة خاضعة للرقابة. الهدف من البروتوكول هو التأكيد على التقنيات الصحيحة المستخدمة في مختبر الأبحاث لمنع التلوث من الفطريات والبكتيريا. يتم التركيز بشكل خاص على تجنب تلوث الميكوبلازما ، وهو مصدر قلق كبير في غرفة زراعة الخلايا نظرا لصغر حجمها ومقاومتها لمعظم المضادات الحيوية المستخدمة في زراعة الخلايا. هذه التقنيات نفسها تضمن النمو المستمر والحفاظ على الخلايا السليمة. بالنسبة لمستخدمي زراعة الخلايا الجدد وذوي الخبرة على حد سواء ، من المهم الالتزام باستمرار بأفضل الممارسات هذه للتخفيف من مخاطر التلوث. مرة واحدة في السنة ، يجب على المختبرات مراجعة أفضل ممارسات زراعة الخلايا والمتابعة بمناقشة أو تدريب إضافي إذا لزم الأمر. إن اتخاذ إجراءات مبكرة لمنع التلوث في المقام الأول سيوفر الوقت والمال ، مقارنة بالتنظيف بعد حدوث التلوث. تحافظ أفضل الممارسات العالمية على صحة مزارع الخلايا ، وبالتالي تقليل الحاجة إلى إذابة الخلايا الجديدة باستمرار ، وشراء وسائط زراعة الخلايا باهظة الثمن ، وتقليل كمية تطهير الحاضنة ووقت التوقف عن العمل.

Introduction

زراعة الخلايا لها العديد من الاستخدامات في مختبر الأبحاث. منذ نشأة زراعة الخلايا في أوائل القرن 20 ، ساعدت خطوط الخلايا في تقدم العلوم. خطوط الخلايا لها العديد من المزايا. يمكن أن تساعد خطوط الخلايا المختلفة الباحثين في دراسة بيولوجيا الخلية ، أو إنتاج فيروس البقعي لمزيد من الدراسات ، أو إنتاج كميات كبيرة من البروتين ذي الأهمية ، على سبيل المثال لا الحصر¹. تشمل بعض الاستخدامات الإضافية دراسة نمو الأنسجة ، والمساعدة في تطوير اللقاح ، وأبحاث السموم ، ودراسة دور الجينات في الكائنات الحية السليمة والنماذج المريضة ، وإنتاج خطوط الخلايا الهجينة ^2,3. يمكن لخطوط الخلايا أيضا تمكين إنتاج الدواء³. تقنيات التعقيم المناسبة ضرورية عند العمل مع خطوط الخلايا ؛ تنطبق الممارسات والتقنيات الموضحة في هذه المخطوطة على مختبرات الأبحاث حيث يتم تنفيذ أعمال زراعة الخلايا. لا تتم مناقشة إعدادات المختبر الأخرى.

غالبا ما يكون التلوث هو الشاغل الرئيسي عند القيام بعمل زراعة الخلايا. في سياق هذه الورقة ، يشير التلوث عموما إلى الفطريات والبكتيريا. الهدف العام من الطريقة الموضحة في هذه الورقة هو وصف شامل لأفضل الممارسات لتجنب التلوث. يجب على جميع أعضاء المختبر الالتزام بهذه الممارسات عند العمل في غرفة زراعة الخلايا في مختبر الأبحاث. يجب أن تضمن المختبرات أن جميع العمال مشاركون نشطون في استخدام أفضل الممارسات هذه لمنع التلوث. ستساعد معرفة الممارسات والتقنيات الصحيحة على ضمان بقاء مزارع الخلايا قابلة للحياة وصحية وخالية من التلوث. يعتمد تطوير هذه التقنية على البحث في الأدبيات ، وسبع سنوات من الخبرة في العمل مع مزارع الخلايا ، والحاجة إلى طريقة يمكن لكل من المبتدئين والعاملين ذوي الخبرة في زراعة الخلايا الرجوع إليها على أساس سنوي.

هناك حاجة إلى تقنية واضحة وموحدة يجب أن تتبعها جميع مختبرات زراعة الخلايا البحثية. تناقش الكثير من الأدبيات حول تلوث زراعة الخلايا الكشف عن الميكوبلازما ، وتقنيات التعقيم ، ومصادر التلوث ، والقضاء على الملوثات ، والوقاية باستخدام المضادات الحيوية والاختبار المنتظم⁴،⁵،⁶،^7،8. في حين أن هذه المعلومات مفيدة ، لا توجد مقاطع فيديو موجودة في الأدبيات توضح تقنيات زراعة الخلايا المناسبة التي يجب على المرء اتباعها. تتمثل ميزة الممارسات المقدمة على التقنيات البديلة في التركيز على منع التلوث قبل حدوثه ، بدلا من اكتشاف الأخطاء وتصحيحها لاحقا. علاوة على ذلك ، فإن العرض الشامل لتقنيات التعقيم ، ومناقشة حول منع نمو الفطريات والبكتيريا ، والمعلومات المتعلقة بتدفق هواء خزانة السلامة الحيوية ذات قيمة لكل من العاملين المبتدئين وذوي الخبرة في زراعة الخلايا على حد سواء.

البكتيريا والفطريات هما النوعان الأكثر شيوعا من الملوثات. ضمن فئة البكتيريا ، تعد الميكوبلازما مصدر قلق كبير نظرا لصغر حجمها وقدرتها على التكاثر مع بقائها دون أن يلاحظها أحد. وهي كائنات حية ذاتية التكاثر ليس لها جدار خلوي صلب وتعتمد على الخلايا الحقيقية النواة لتنمو. لقد قللت من القدرات الأيضية ويمكن أن تتكاثر بشكل كبير بينما تظل غير معترف بها في الفحص البصري الروتيني لثقافات الخلايا والتحليل المجهري المنتظم ، على الرغم من أن المجهر الإلكتروني النافذ يمكنه اكتشاف الميكوبلازما ^9,10. علاوة على ذلك ، يمكنهم المرور عبر المرشحات الميكروبيولوجية¹⁰. يوفر وسط زراعة الخلايا الميكوبلازما بالمواد المغذية ، على الرغم من أن تكملة الوسائط بالمضادات الحيوية للأسف لا تؤثر على الميكوبلازما¹⁰. ينبغي للمرء أن يلاحظ أنه ، بشكل عام ، ليس من الضروري استكمال الوسائط بالمضادات الحيوية. يجب أن تكون التقنيات المناسبة كافية في إبعاد التلوث. لا تؤدي الإصابة بالميكوبلازما إلى موت الخلايا الفوري ، ولكنها تثير قلق الباحثين لأنها تؤثر على قابلية استنساخ البيانات وجودتها.

يجب على جميع موظفي المختبر الالتزام الصارم بممارسات زراعة الخلايا الجيدة. يجب اختبار الثقافات بحثا عن الميكوبلازما بعد شرائها حديثا ، أثناء زراعتها حاليا ، وقبل حفظها بالتبريد ، وعند إذابتها من النيتروجين السائل ^2,10. تتوفر اختبارات مختلفة في السوق باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) أو التلوين المناعي. ³ تشير الأدبيات إلى أن "العزلات البشرية تمثل نسبة كبيرة من ملوثات الميكوبلازما الموجودة في زراعة الخلايا"⁵. على الرغم من وصف أكثر من 200 نوع من الميكوبلازما ، إلا أن حوالي ستة منها تمثل معظم الإصابات. هذه الأنواع الستة هي M. arginini و M. fermentans و M. hominis و M. hyorhinis و M. orale و Acholeplasma laidlawii¹⁰. كما هو الحال مع أنواع التلوث الأخرى ، فإن الهواء والهباء الجوي يجلبانها إلى مزارع الخلايا⁵. يتردد صدى هذا في أوراق أخرى لأن "المشغل البشري يحتمل أن يكون أكبر خطر في المختبر"⁷. على الرغم من أن هذا يتم من خلال خطأ بشري ، إلا أنه يمكن القضاء على المخاطر إذا تم اتباع إجراء قياسي. لا يقتصر التساقط من الموظفين على تلوث الميكوبلازما فقط. عادة ما تصاب مزارع الخلايا في أحد المختبرات بنفس أنواع الميكوبلازما ، مما يشير إلى أن التلوث ينتشر من قارورة إلى أخرى بسبب تقنيات زراعة الخلايا غير الصحيحة¹⁰.

منع التلوث المتبادل هو أيضا سبب آخر لاتباع تقنيات زراعة الخلايا المناسبة. تجدر الإشارة إلى أن ما لا يقل عن 15٪ -18٪ من خطوط الخلايا في جميع أنحاء العالم قد تكون ملوثة أو تم تحديدها بشكل خاطئ^11،12. بالإضافة إلى اختبار خطوط الخلايا للتلوث بالميكوبلازما ، يجب أيضا اختبارها للتلوث المتبادل¹⁰. بالنسبة لخطوط الخلايا البشرية ، فإن مصادقة خط الخلية بواسطة تقنية غير مكلفة قائمة على الحمض النووي تسمى التنميط القصير للتكرار الترادفي (STR) هي المعيار المرجعي الدولي الحالي ، لأنها طريقة سهلة لتأكيد هوية خط الخلية²،¹⁰،^13،14. يمكن ل STR تحديد خطوط الخلايا ذات العلامات الخاطئة أو الملوثة ، ولكن لا يمكنها اكتشاف أصل الأنسجة غير الصحيح¹⁰،^13،14. يمكن أن تتعرض صحة بيانات البحث للخطر إذا تم تسمية خطوط الخلايا بشكل خاطئ أو تم تحديدها بشكل خاطئ أو ملوثة¹³. على غرار الأنواع الأخرى من التلوث ، يمكن أن يحدث التلوث المتبادل بسبب سوء التقنية التي تتسبب في انتشار الهباء الجوي ، أو الاتصال الخاطئ الذي يؤدي إلى دخول نوع الخلية الخطأ إلى قارورة ، أو استخدام نفس زجاجة الوسائط والكواشف بخطوط خلايا مختلفة¹⁰. لا ينبغي أن يحدث أي مشاركة لزجاجات الوسائط ؛ يمكن أن تسمح مشاركة زجاجة واحدة من الوسائط بين خطين خلويين مختلفين بخلط مجموعات الخلايا هذه ، مما يؤدي إلى استيلاء نوع الخلية الأسرع نموا على القارورة تماما. هذا الاستبدال غير ملحوظ ويؤدي إلى خطأ في التسمية والتعريف^{الخاطئ 2}. يمكن أيضا الخلط بين خط الخلية وخط آخر إذا تم الخلط بين الثقافات أثناء المناولة أو وضع العلامات^{على 10}. يجب إيلاء اهتمام دقيق للحفاظ على الكواشف والوسائط والقوارير منفصلة عن بعضها البعض. يجب أن يكون لكل عضو في المختبر زجاجات وسائط خاصة به ؛ يجب ألا تحدث مشاركة بين أعضاء المختبر. يجب شراء خطوط الخلايا نفسها من بنك خلوي مؤهل ومزود. يجب ألا تشارك المختبرات الخلايا. تشير الدراسات إلى أنه على الرغم من استخدام اختبارات STR والميكوبلازما بانتظام ، فقد استخدمت العديد من الأوراق البحثية في الأدبيات بالفعل خطوط خلايا خاطئة أو ملوثة¹⁵. إن غربلة البحث للعثور على هذه الأوراق الإشكالية وإبلاغ القراء بأثر رجعي بهذا الأمر أمر مرهق. الوقاية هي أفضل طريقة لضمان عدم حدوث هذه المشكلة في المقام الأول.

الإجراء البسيط لرش العناصر بنسبة 70٪ EtOH يمكن أن يقتل الكائنات الحية ؛ يعمل 70٪ EtOH عن طريق تغيير طبيعة البروتينات وإذابة الدهون في الكائنات الحية الأكثر تلويثا ، بما في ذلك البكتيريا والفطريات¹⁶. وقد أظهرت الدراسات أن 70 ٪ هو التركيز الأكثر فعالية. لا تتخثر البروتينات السطحية بسرعة مع 70٪ EtOH حتى تتمكن من دخول الخلية ، في حين أن الماء الذي يحتوي عليه ضروري لعملية تغيير طبيعة البروتينات. بسبب اختلاف تركيز الماء والكحول على جانبي جدار الخلية ، يدخل 70٪ EtOH الخلية لتشويه كل من البروتينات الأنزيمية والهيكلية. إذا لوحظ نمو العفن في قوارير ، فيجب تطهير الحاضنة بأكملها عن طريق رشها أولا بنسبة 70٪ EtOH ومسحها جافة ، تليها حضانة ليلية لمدة 16 ساعة عند 60 درجة مئوية¹⁷. هذا يقتل معظم العفن وأي بكتيريا.

الميزة الرئيسية لممارسات الوقاية على التقنيات البديلة للقضاء على التلوث بعد حدوثه هي أنه من خلال منع التلوث في وقت مبكر ، يمكن للعاملين في المختبرات التأكد من أن مزارع الخلايا الخاصة بهم صحية ولن تكون هناك تكاليف عالية مرتبطة بإزالة التلوث من الحاضنات أو التخلص من مزارع الخلايا. القضاء على ملوثات الميكوبلازما بعد ، على سبيل المثال ، ليس فعالا⁷. إن أخذ الوقت مبكرا لضمان تدريب موظفي المختبر بشكل صحيح ، وغرفة زراعة الخلايا قائمة بذاتها ، واستخدام إجراء قياسي سيوفر الوقت والمال.

Protocol

1. الاستعدادات

1. عام
   1. ارتداء معطف مختبر نظيف مخصص لارتدائه فقط في غرفة زراعة الخلايا وليس في أجزاء أخرى من المختبر.
      ملاحظة: لا يلزم أن يكون معطف المختبر معقما.
   2. ارتد قفازات جديدة لم تلمس أي أسطح أخرى. تأكد من أن القفازات مناسبة بإحكام. النتريل ، قفازات خالية من مسحوق هي الأفضل.
      ملاحظة: لا تحتاج القفازات إلى أن تكون معقمة.
   3. للتحضير للعمل ، قم برش القفازات وأكمام معطف المختبر والجزء الداخلي من خزانة السلامة البيولوجية بنسبة 70٪ EtOH. امسح سطح العمل واللوحة الزجاجية جافة بمنشفة ورقية خالية من النسالة.
      ملاحظة: استخدام 70٪ EtOH يقتل البكتيريا بأعلى كفاءة¹⁶. لا تحتاج المنشفة الورقية إلى أن تكون معقمة.
   4. احتفظ بحمامات المياه داخل غرفة زراعة الخلايا واستخدمها فقط لتدفئة وسائط الثقافة أو إذابة الخلايا. استنزاف وغسل الحمامات المائية مرة واحدة في الأسبوع ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة للتنظيف.
2. داخل خزانة السلامة البيولوجية
   1. الحد من عدد العناصر التي يتم إحضارها إلى الخزانة. لا تقاطع تدفق الهواء داخل خزانة السلامة البيولوجية عن طريق سد الشوايات الأمامية أو الخلفية.
      ملاحظة: انظر الشكل 1 للحصول على شرح لكيفية تدفق الهواء داخل الخزانة.
   2. رش جميع العناصر الموضوعة داخل الخزانة بنسبة 70٪ EtOH وامسحها حتى تجف. ابدأ برش الجزء العلوي من زجاجة الوسائط والعمل لأسفل. وبالمثل ، باستخدام منشفة ورقية نظيفة ، امسحها حتى تجف ، واعمل تدريجيا في طريقها إلى الأسفل. لا تعود نحو الغطاء.
   3. إذا كانت الخزانة كبيرة بما يكفي لاستيعاب الماصات المصلية ، فيمكن وضعها في الداخل ، وإلا يمكن تخزينها في وعاء مركب على السطح الخارجي للخزانة. تحقق من جانبي الماصة المغلفة بحثا عن ثقوب أو تمزق أو ثقوب في العبوة قبل الاستخدام. لا تمزق الغلاف. بدلا من ذلك ، قشر أطراف الغلاف برفق ، وأدخل الماصة المصلية في أداة مساعدة الماصة ، وقم بإزالة الغلاف بحركة سائلة واحدة.
   4. لا تحوم فوق زجاجات أو قوارير مفتوحة ؛ قم بالوصول إلى الزجاجات أو القوارير المفتوحة ، أو افتح العناصر فوق قمم العناصر المفتوحة بالفعل في خزانة السلامة البيولوجية.
      ملاحظة: يدفع تدفق الهواء داخل الخزانة لأسفل على سطح العمل ، لذلك قد يدخل أي تلوث موجود على الغلاف ، على سبيل المثال ، إلى مزارع الخلايا.
   5. لا تصب السوائل. بدلا من ذلك ، قم بإضافتها باستخدام ماصة مصلية. بعد استكمال الوسائط ، امزج المحتويات جيدا وقم ببدء الزجاجة. تأكد أيضا من تضمين ملصق لما تم استكمال الوسائط به.

2. العمل مع خطوط الخلايا الملتصقة

1. إذا كانت هناك حاجة إلى قارورة بلاستيكية ، قم برش الكيس بالكامل وضعه داخل الخزانة.
2. استخدم ماصات زجاجية معقمة أو ماصات بلاستيكية معقمة يمكن التخلص منها لشفط الوسائط أو محاليل الغسيل. قم بإزالة الغطاء المعدني بعناية من حاوية التخزين. اعزل ماصة زجاجية واحدة عن طريق هز الحاوية برفق بزاوية. عند الوصول إلى الحاوية ، تجنب لمس أي ماصات أخرى.
   ملاحظة: تعامل مع الماصة المختارة من طرف واحد فقط.
3. استبدل الأغطية الموجودة على الزجاجات بسرعة في أسرع وقت ممكن. ضع الأغطية على سطح العمل رأسا على عقب حتى لا تلمس الحافة سطح العمل. لا تمسك الغطاء من الأعلى أو الأسفل ؛ بدلا من ذلك ، المس القبعات من الجانبين.
4. عند شفط السوائل ، استخدم قارورة مصيدة فراغ تقع خارج الخزانة في حاوية ثانوية على الأرض.
   ملاحظة: لا ترمي أي نفايات سائلة في أكياس النفايات البيولوجية الخطرة لأن الأكياس سوف تتسرب. سيتم إنشاء النفايات أثناء العمل داخل الخزانة. سيؤدي تحريك اليدين داخل وخارج الخزانة في كثير من الأحيان إلى مقاطعة تدفق الهواء. اترك أي نفايات داخل الخزانة مؤقتا. ضعه على الجانب حتى لا يقطع العمل.
5. رش القفازات بسخاء بنسبة 70٪ EtOH في أي وقت تصبح فيه جافة. افرك يديك معا حتى لا تقطر القفازات مبللة.
6. إذا لامست ماصة مصلية عن طريق الخطأ شيئا ما في الخزانة ، فلا تتردد في التخلص منه. ابدأ من جديد باستخدام ماصة مصلية نظيفة بدلا من استخدام ماصة قد تكون ملوثة.

4. فحص وتخزين الخلايا

1. قبل وضع الخلايا في الحاضنة ، تحقق لترى كيف تبدو تحت المجهر. إذا تم تعليق الخلايا تماما ، فيجب ملاحظة الخلايا المفردة.
2. لا تتحدث أو تعطس أو تسعل أو تتنفس بشدة في الحاضنات. فتح وإغلاق أبواب الحاضنة بسرعة. قد يسمح ترك الأبواب مفتوحة لفترة أطول من اللازم للملوثات الموجودة في الهواء بدخول الحاضنات.
   ملاحظة: ارتداء قناع أثناء العمل في غرفة زراعة الخلايا يمكن أن يساعد لأن الميكوبلازما قد تكون موجودة في فم الإنسان. تجنب استخدام الهواتف المحمولة في غرفة الثقافة الخلوية ، حيث لا ينصح بالتحدث.
3. تأكد من إغلاق الأغطية الموجودة على جميع الزجاجات بإحكام قبل إزالة الزجاجات من الخزانة.
4. قم بتخزين وسائط زراعة الخلايا في الظلام عند 4 درجات مئوية عندما لا تكون قيد الاستخدام لأنها حساسة للضوء.
5. رش الجزء الداخلي من الخزانة بنسبة 70٪ EtOH مرة أخرى بعد اكتمال عمل زراعة الخلايا وامسح السطح حتى يجف بمنشفة ورقية. أفرغ أكياس نفايات النفايات البيولوجية. كرر هذه العملية واستبدل القفازات عند التبديل إلى خط خلية مختلف.

5. العمل مع خطوط خلايا التعليق

1. بالنسبة للخلايا المعلقة المزروعة في قوارير زجاجية ، تأكد من رش القفازات جيدا بنسبة 70٪ EtOH ، ثم المس ورق الألمنيوم بالقفازات المبللة ورش الجزء السفلي من القارورة فقط قبل وضعها داخل الخزانة.
2. عند أخذ عينة لعد الخلايا، أزل أنبوبا واحدا فقط حجمه 1.5 mL من الحاوية الخاصة به. لا تلمس أي أنابيب أخرى. ضع الغطاء رأسا على عقب على سطح العمل. لا تلمس الحافة الداخلية. تعامل معها بعناية من الجوانب واستبدلها بمجرد الانتهاء.
3. قم بإزالة قطعة رقائق الألومنيوم المطوية المزدوجة بعناية والتي تغطي عنق القارورة بالكامل. تعامل مع القارورة الزجاجية من الأسفل فقط - لا تلمسها من الرقبة - بمجرد إزالة الرقاقة. استخدم ماصة مصلية سعة 1 مل لأخذ عينة لعد الخلايا.
4. لا تدع الوسائط تقطر على جانب القوارير ؛ إذا حدث ذلك ، قم برش منشفة ورقية بنسبة 70٪ EtOH وقم بتنظيفه على الفور.
5. تأكد من إحكام ربط الأغطية ورقائق الألومنيوم قبل إزالة الزجاجات أو القوارير من خزانات السلامة البيولوجية.

6. حضانة الخلايا

1. استخدم حاضنات منفصلة لأنواع الخلايا المختلفة لمنع التلوث المتبادل لأنواع الخلايا المختلفة.

7. جمع النفايات السائلة

1. اجمع النفايات السائلة في دورق مصيدة مفرغة يقع خارج الخزانة على الأرض في حاوية ثانوية تحمل علامة "النفايات".
   ملاحظة: يتم توصيل الخرطوم بمرشح امتصاص الجسيمات عالي الكفاءة (HEPA) ، والذي يتم استبداله على أساس شهري.

8. تنظيف

1. قم بإزالة كيس النفايات البيولوجية وغسل القوارير الزجاجية في أسرع وقت ممكن. احتفظ ببروتوكول غسيل الزجاج بجوار الحوض. انظر الملف التكميلي 1 لبروتوكول الغسيل.
2. الأوتوكلاف الأواني الزجاجية ثقافة الخلية بدلا من إرسالها إلى مرفق غسيل الزجاج. احتفظ بها منفصلة عن الأواني الزجاجية في المنطقة الرئيسية من المختبر.
   ملاحظة: تترك خلايا SF-9 حافة من الخلايا الميتة على جانب القوارير إذا لم يتم تنظيف الزجاج جيدا. انظر الملف التكميلي 1 لبروتوكول الأوتوكلاف.

9. التنظيم

1. تنظيم غرفة زراعة الخلايا بحيث تكون جميع الإمدادات موجودة في منطقة واحدة ، وبالتالي تقليل الحاجة إلى مغادرة أعضاء المختبر للغرفة بحثا عن الإمدادات.
2. قم بتسمية أي زجاجات بلاستيكية تستخدم لحصاد الخلايا ويعاد استخدامها في زراعة الخلايا بعد ذلك على أنها "لاستخدام زراعة الخلايا فقط". استخدم زجاجات زراعة الخلايا المخصصة لنوع خلية واحد محدد. قم بتخزين الزجاجات في غرفة زراعة الخلايا لسهولة الوصول إليها.

10. تحديد تلوث البكتيريا والفطريات والميكوبلازما

ملاحظة: يمكن أن يؤدي عدم اتباع سير العمل أعلاه إلى تلوث البكتيريا والفطريات والميكوبلازما.

1. دائما قبل البدء في العمل ، لاحظ قوارير التعكر الثقيل ، والنمو الإضافي في شكل كرات غامضة ، وتراكمات كثيفة من الخلايا على الجانب ، وكلها مؤشرات على التلوث.
   ملاحظة: يمكن للعين ذات الخبرة معرفة الفرق بين التعكر الناجم عن التلوث الميكروبي مقابل الخلايا الفعلية. بينما تتسبب الخلايا في ظهور الوسائط الصافية عادة غائمة ، فإن التلوث البكتيري يسبب تعكرا شديدا باللون الأبيض.
   1. حدد بصريا تلوث العفن من خلال ملاحظة ظهور كرات مستديرة غامضة تطفو في الوسائط (انظر الشكل 2).
   2. حدد بصريا التلوث البكتيري إذا كانت الوسائط غائمة أو بيضاء أو مضطربة (انظر الشكل 2).
   3. تحديد تلوث الميكوبلازما عن طريق إجراء اختبار الميكوبلازما الشهري. يرشد أحد الاختبارات المستندة إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل المستخدمين إلى أخذ عينة 1.5 مل من الخلايا ، وإجراء عدد الخلايا باستخدام 10 ميكرولتر ، والتخفيف إلى 0.08 × 10⁶ خلايا / مل ، وتدوير الخلايا لأسفل ، وتحلل الخلايا باستخدام المخزن المؤقت الموجود في المجموعة ، وتدور مرة أخيرة. يتم تحضين المادة الطافية بمواد أولية تضخم مجموعة من أنواع الميكوبلازما. قم بتشغيل هلام الحمض النووي لتصور الأساور. لا توجد عصابات تعني أنه لم يتم تحديد الميكوبلازما.
      ملاحظة: يمكن أن يكون هذا الملوث الرئيسي موجودا في فم الإنسان. من الممارسات الجيدة اختبار تلوث الميكوبلازما في الخلايا بعد إذابتها وقبل استخدامها في التجارب. بعد ذلك ، راقب الخلايا بحثا عن تلوث الميكوبلازما مرة واحدة في الشهر. تقدم العديد من الشركات مجموعات اختبار الميكوبلازما. اختر واحدة مناسبة.

النتائج

إذا لم يتم اتباع تقنيات وممارسات زراعة الخلايا المناسبة الموضحة في هذه الورقة ، فقد يحدث تلوث بالفطريات والبكتيريا في مختبر زراعة الخلايا البحثي. يوضح الشكل 2 قوارير تحتوي على تلوث في كل من الثقافات المعلقة والملتصقة.

عند عدم اتباع تقنيات التعقيم ، قد يحدث ت...

Discussion

في حين أن التلوث هو أحد الاهتمامات الرئيسية عند القيام بأعمال زراعة الخلايا ، فإن الممارسات والتقنيات الموضحة في هذه المخطوطة ستساعد في التخفيف من المخاطر. تشمل الخطوات الحاسمة ارتداء معطف مختبر نظيف ، والذي يستخدم فقط في غرفة زراعة الخلايا ، واستخدام قفازات نظيفة وخالية من البودرة يتم ر...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 Media	ATCC	30-2006
Glass Baffled Flask	Pyrex	09-552-40
Glass Pipettes	Fisher	13-678-6B
Pipette Aid	Drummond	13-681-15A
Serological Pipette	Corning	07-200-573
T75 flask	Corning	07-202-004
Trypsin	Gibco	25-300-054
*Items may vary because this video is about general cell culture techniques