Esrar sativasından Glandüler Kapitat Saplı ve Sapsız Trikomların Susuz İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Özet

Esrar sativa'dan glandüler kapitat saplı ve sapsız trikomların uygun ve yüksek verimli izolasyonu ve zenginleştirilmesi için bir protokol sunulmaktadır. Protokol, sadece sıvı azot, kuru buz ve naylon elekler kullanılarak trikomların kuru, tamponsuz ekstraksiyonuna dayanır ve RNA ekstraksiyonu ve transkriptomik analiz için uygundur.

Özet

Bu yazıda, Cannabis sativa'dan glandüler kapitat saplı ve sapsız trikomların uygun ve yüksek verimli izolasyonu ve zenginleştirilmesi için bir protokol sunulmaktadır. Kannabinoid ve uçucu terpen metabolizması için biyosentetik yollar öncelikle Esrar trikomlarında lokalize edilir ve izole trikomlar transkriptom analizi için faydalıdır. Transkriptomik karakterizasyon için glandüler trikomların izole edilmesine yönelik mevcut protokoller sakıncalıdır ve tehlikeye atılmış trikom kafaları ve nispeten düşük miktarda izole trikom sağlar. Ayrıca, RNA yıkımını önlemek için pahalı cihazlara ve protein inhibitörleri içeren izolasyon ortamına güvenirler. Bu protokol, sırasıyla C. sativa olgun dişi salkımından ve fan yapraklarından büyük miktarda izole glandüler kapitat saplı ve sapsız trikom elde etmek için üç bireysel modifikasyonun birleştirilmesini önermektedir. İlk modifikasyon, trikomların mikro eleklerden geçişini kolaylaştırmak için geleneksel izolasyon ortamı yerine sıvı azotun ikame edilmesini içerir. İkinci modifikasyon, trikomları bitki kaynağından ayırmak için kuru buz kullanmayı içerir. Üçüncü modifikasyon, bitki materyalinin azalan gözenek boyutlarına sahip beş mikro elek içinden art arda geçirilmesini içerir. Mikroskobik görüntüleme, izolasyon tekniğinin her iki trikom tipi için etkinliğini göstermiştir. Ek olarak, izole trikomlardan ekstrakte edilen RNA'nın kalitesi, aşağı akış transkriptomik analizi için uygundu.

Giriş

Glandüler trikomlar, birçok ikincil metabolit¹ içeren bitkilerde bulunan ve yeni biyosentetik genlerin ve enzimlerin değerli bir bankasını temsil eden saç benzeri yapılardır². Esrarda, önemli ikincil metabolitlerin, kanabinoidler³ ve terpenler^4'ün biyosentezi, trikomlarda lokalizedir. Trikomların hem tıbbi hem de rekreasyonel kullanımlar için Esrar kalitesini belirlemedeki rolü göz önüne alındığında, trikom gen ekspresyonunun incelenmesi ilgi çekicidir. Trikoma özgü genlerin ekspresyonunu karakterize etmek için, önce ilgilenilen trikomlar izole edilmelidir. Trichome izolasyon protokolleri ilk olarak 1992 gibi erken bir tarihte tanımlanmıştır⁵ ve en son gelişmeleri yakın zamanda gözden geçirilmiştir². Genel olarak, transkriptomik karakterizasyon için glandüler trikomların ekstraksiyonu için protokoller iki ayrı sıralı adıma ayrılabilir. İlk adım, trikomların bitki dokusundan tamamen fiziksel olarak ayrılmasını içerir. Bu adım, kuru buz⁵, ticari aparat ^6,7 ile cam boncuklar^, bitki materyalinin bir ağ elek^8'e karşı öğütülmesi veya bitki dokusunun bir izolasyon tamponu^9'da vortekslenmesi ile gerçekleştirilebilir. İkinci adım, ilgilenilen trikomların mikroskobik bitki kalıntılarından ve / veya diğer trikom türlerinden daha rafine bir şekilde ayrılmasını içerir. Bu adım, yoğunluk gradyanı santrifüjleme^8,10 veya^{çeşitli boyutlarda} elekler ^7,9 kullanılarak gerçekleştirilebilir. İşlenmiş dokulardaki RNA'nın bozunma ajanlarına karşı aşırı duyarlılığı nedeniyle, bu iki ardışık adım genellikle buz gibi soğuk izolasyon ortamında, genellikle protein inhibitörlerinin varlığında gerçekleştirilir⁴.

Geleneksel trikom izolasyon protokolleri, buz gibi soğuk sıcaklıklara ek olarak, verimli bir ekstraksiyon prosedürü sağlamak için büyük miktarda izolasyon ortamı gerektirir. Bu bileşenlerin birleşimi, yüksek verimi engelleyen zorlu ve zaman alıcı bir yalıtım süreciyle sonuçlanır. Bu nedenle, basit, kullanıcı dostu bir alternatif trikom izolasyon protokolü sunmak, trikom karakterizasyonu ile ilişkili çeşitli yönler için faydalı olacaktır. Bu makale, geleneksel protokollerden çeşitli unsurları birleştirerek ve entegre ederek, saplı ve sapsız glandüler capitate trikomlarını Esrar sativasından izole etmek için alternatif bir protokol sunmayı amaçlamaktadır. Bu elementler arasında kuru buz⁵, trikomların gözenek boyutları ^7,9 azalan birkaç mikro elek içinden geçirilmesi ve izolasyon ortamı⁸ için sıvı azotun (LN) ikame edilmesi yer almaktadır.

Mevcut trikom izolasyon protokolünün yeniliği, geleneksel protokollerle karşılaştırıldığında, çeşitli şekillerde ortaya çıkmaktadır. Bu protokol, tehlikeli bileşenler gerektirmediğinden kullanışlıdır. Prosedür laboratuvarda minimum önlemle gerçekleştirilebilir ve yüksek verimi kolaylaştırır. Standart sıvı izolasyon ortamının yerine LN'nin ikame edilmesi, izolasyon prosesi boyunca trikomların bütünlüğünü sağlayarak sonraki transkriptomik analizlere olanak tanır. LN ve kuru buzun süblimasyonu üzerine, izole edilmiş trikomlar zararlı artıklardan arındırılmış olarak bırakılır. Ayrıca, LN'nin oda sıcaklığında süblimasyon eğilimi, protokol boyunca cömert kullanımına izin verir. Buna karşılık, büyük miktarlarda geleneksel izolasyon ortamının kullanılması, taşınmasında pratik zorluklar yaratır. Son olarak, protokol disk hücresinin glandüler trikomun kalan kırılgan kafa yapısından ayrılmasını azaltır ve kafa boşluğu içeriğinin tutulmasını sağlar.

Bu protokol, C. sativa glandüler capitate trikomlarının izole edilmesinin teknik uygulamasına yardımcı olmak için tasarlanmış ayrıntılı bir adım adım tarzda sunulmaktadır. Protokol, aşağı akış moleküler analizi için uygun olan yüksek konsantrasyon ve saflığa sahip izole trikomlarla sonuçlanan yönetilebilir bir iş akışı sağlar.

Protokol

NOT: Bu çalışmada kullanılan bitki materyali, başka bir yerde açıklandığı gibi İsrail'in Volcani Merkezi'nde yetiştirilen dört C. sativa ARO-Volcani suşundan (CS-11, CS-12, CS-13 ve CS-14) oluşmaktadır. Glandüler kapitat saplı trikomlar olgun çiçeklenme salkımından izole edildi ve glandüler kapitat sapsız trikomlar, olgun çiçekli olmayan ana bitkilerden büyük fan yapraklarından izole edildi. Tüm bitki materyali taze olarak toplandı ve hemen -80 ° C'de saklandı.

DİKKAT: Protokol boyunca kuru buz ve LN kullanılır. Bu maddeler son derece tehlikelidir. İzole trikomlar, kapalı tüplere yerleştirildiğinde tehlikeli gaz basıncı oluşturabilecek kuru buz parçacıkları içerebilir; Bu nedenle, tüm kapaklar iğneyle delinmelidir. Son derece düşük sıcaklıklarda kullanım için koruyucu gözlüklerin, uygun laboratuvar kıyafetlerinin ve eldivenlerin kullanılması şiddetle tavsiye edilir.

1. Trikomların bitki materyalinden ilk ayrılması için kurulum

1. Kuru bir buz bloğunu 5 L'lik plastik bir kapta bir çekiç ve sert düz bir nesne kullanarak küçük ince pullar halinde ezin.
2. İnce kuru buz pullarını (5 mm'den küçük) eleyerek eleyin Kırılmamış kuru buzdan büyük bir süzgeçle (5 mm'den küçük gözenekler aracılığıyla ) başka bir 5 L plastik kaba koyun. Kuru buz pullarının yaklaşık 200^cm3'ünü (200 mL işareti) dik 1 L'lik cam bir beher içine dökün.
3. Ezilmiş kuru buzun ilk tabakasına 10 g'a kadar dondurulmuş C. sativa salkımını (bundan böyle bitki materyali olarak adlandırılır) ekleyin ve 200^cm3'lük ince ezilmiş kuru buz tabakası ile örtün.
4. 1 L cam kabın açıklığını iki ila üç kat 1 mm ekran kapısı cibinliği ile örtün ve cam kabın dış taraflarına lastik bantlarla sabitleyin (Şekil 1).
5. LN'yi, izole trikomların toplanacağı büyük bir yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kaba dökün (bakınız Malzeme Tablosu).
6. Un elek ağını aşağıdan örtmek için un eleği/elek süzgecine 350 μm'lik bir ağ yerleştirin (Şekil 2). Çıkarılabilir plastik halkalı bir un eleği varsa, 350 μm ağı, un eleğinin ağının altına sabitlenecek şekilde yerleştirin. Değilse, 350 μm ağı un eleğinin çevresine lastik bantlarla sabitleyin.
7. Un eleğini LN ile doldurulmuş büyük yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kabın üzerine yerleştirin (Şekil 3). Yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kabın dışındaki elenmiş kütlenin kaybını en aza indirmek için kabın genişliğinin un eleğininkini aştığından emin olun.

2. Trikomların bitki materyalinden ayrılması

1. 1 L bardağı, açıklığı un eleğine doğru aşağı bakacak şekilde, büyük bir tuz çalkalayıcı kullanıyormuş gibi çalkalayın (Şekil 4).
2. Un eleği üzerinde biriken ezilmiş kuru buzun ve bitki materyalinin elenmesini sağlamak için her 2-3 dakikada bir 1 L cam kabı bir kenara koyun.
3. Aşağıdaki yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kapta bitki malzemesinin LN'ye geçişini kolaylaştırmak için un eleğini yatay olarak eleyin.
4. Paslanmaz çelik kaba LN ekleyin ve seviyeleri düştüğünde 1 L cam beher için ezilmiş kuru buz ekleyin. Un eleği üzerindeki bitki materyali tükendiğinde, cam beherdeki kullanılmış bitki materyalini ilave 10 g taze bitki materyali ile doldurun. İkmal genellikle iki defadan fazla tekrarlanmak zorunda değildir.
5. Yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kapta yeterli miktarda zenginleştirilmiş trikom toplanana kadar 2.1-2.4 arasındaki adımları tekrarlayın. Genel olarak, RNA ekstraksiyonu ve transkriptom analizi için 20 g taze bitki materyali yeterlidir.
6. LN'ye batırılmış paslanmaz çelik kabın dibinde beyaz toz benzeri bir madde (bitki artıkları, glandüler trikomlar ve ezilmiş kuru buzdan oluşan) olduğunu doğrulayın. Mikroskobik bir gözlem, yeterli miktarda trikomun toplanıp toplanmadığını belirlemeye yardımcı olacaktır; Ancak, bu adım protokolün akışını engelleyebilir. Genellikle, çoğu izolasyon için 10-20 g ilk bitki materyali yeterlidir; Bununla birlikte, bitkilerin trikom yoğunluğunda farklılıklar olabilir.
   NOT: Bu noktadan itibaren, deneme duraklatılabilir ve daha sonra yeniden başlatılabilir. Kısa bir süre duraklatılırsa, trikomların suya batırılmış kalması için yeterli miktarda LN eklenmelidir. Alternatif olarak, trikomlar, adım 5'te açıklandığı gibi, daha sonra kullanılmak üzere 3 aya kadar -80 ° C'de toplanabilir ve saklanabilir.

3. Glandüler capitate trikomların (saplı ve sapsız) soğanlı ve sistolikik trikomlar ve döküntüler gibi diğer trikom tiplerinden ayrılması

1. Temiz küçük yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik bir kaba az miktarda LN ekleyin.
2. 20 cm x 20 cm'lik bir katlama elde etmek için 150 μm ağ boyutunda 40 cm x 40 cm mikro eleği iki kez katlayın ve açın. Koni benzeri bir şekle benzediğinden emin olun (Şekil 5).
3. Ağ konisini yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kabın kenarına bir veya iki mandalla sabitleyin, böylece koninin açılan kısmı dik olur ve sivri kısmı kısmen LN'ye batırılır.
4. LN'yi ve adım 2.6'daki beyaz toz benzeri maddeyi yavaşça mikro elek konisine dökün.
5. Kalan bitki materyallerini toplamak ve ilk kaptan 150 μm ağ konisine aktarmak için yavaşça geniş bir fırça uygulayın.
6. İlk kaba daha fazla LN ekleyin ve tüm bitki materyali mikro elek konisine aktarılana kadar fırçalama hareketini tekrarlayın.
7. Mandalı kabın kapağından dikkatlice ayırın ve mikro elek konisini açın, böylece trikomlar açılan mikro eleğin ortasına yerleştirilecektir. Mikro eleğin dört köşesini de bir arada tutun, böylece trikomları içeren orta kısım LN'ye batırılmış halde kalır (Şekil 6).
8. Mikro eleğin dört köşesini de tutarken, mikro eleği LN'ye bir çay poşeti demliyormuş gibi çelik kaba hafifçe daldırın ve sallayın. Bu daldırma/sallama (dikey ve yatay) hareketine 1 dakika devam edin. İzolasyon kalitesi ve miktarı arasında bir denge vardır. Daha uzun daldırma hareketleri daha fazla miktarda trikom ile sonuçlanabilir, ancak izolasyon dereceleri daha zayıf olabilir. Genel olarak, 1 dakika hem kalite hem de miktar için yeterli olarak önerilir.
   NOT: Bu eleme hareketi protokolün en kritik kısmıdır ve buna göre yürütülmelidir.
9. İsteğe bağlı: Mikro eleğin ortasına sarılmış elenmemiş bitki artıklarını ve daha büyük trikomları (hala LN'ye batırılmış) 13 mL veya 50 mL'lik bir test tüpüne alın ve ileride kullanmak üzere -80 ° C'de saklayın.
   DİKKAT: Basınçlı gazın birikmesini önlemek için (kuru buz ve LN kalıntılarından), test tüpünün kapağındaki bir deliği sterilize edilmiş bir iğne ile delin. Kapak, basınç düştüğünde, genellikle 24 saat sonra değiştirilebilir.

4. Trikomların gözenek boyutu küçülen mikro eleklerden geçirilmesi

1. Küçük yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kabın altındaki LN'ye batırılmış elenmiş trikomları, 3. adımda sunulduğu gibi, gözenek boyutları azalan (105 μm, 80 μm, 65 μm ve 50 μm) mikro eleklerden sırayla aktarın.

5. İstenilen trikomların toplanması

1. LN'ye batırılmış ve önceden soğutulmuş (LN'de) bir kaşık kullanarak 50 μm mikro eleğe sarılmış istenen trikomları çıkarın. Onları temiz bir tabağa yerleştirin.
   NOT: Bu son izolasyon aşamasında, istenilen trikomlar elekten toplanır.
2. Toz benzeri trikomları, önceden soğutulmuş bir spatula veya tüpe yerleştirilen bir scoopula aracılığıyla etiketli önceden soğutulmuş 1,5 mL'lik bir tüpe hızlı bir şekilde aktarın (Şekil 7). Daha ileri çalışmalar için tüpleri hemen -80 ° C'de saklayın.
   NOT: Tüm yalıtım protokolünü gösteren şematik bir iş akışı şeması Şekil 8'de verilmiştir.

6. Saflaştırılmış trikomların gözlem ve analizi

1. Önceden soğutulmuş (LN yoluyla ) bir spatula kullanarak mikroskop slaydına az miktarda (10 mg) izole trikom yerleştirin. Bir damla su ekleyin ve lekelenmeden doğrudan hafif bir mikroskopta gözlemleyin. Genel izolasyon ve kontaminasyon derecesini düşük (10x) ve yüksek (40x) büyütmeler kullanarak değerlendirin. Zenginleştirme, Şekil 9'da gösterildiği gibi, trikom dışı dokuya göre trikomların göreceli miktarı ile görsel olarak tahmin edilir.
2. 50 mg izole C. sativa glandüler kapitat saplı ve sapsız trikomlardan RNA ekstraksiyonu ve kalite analizi yapın.
   NOT: RNA ekstraksiyonu için poli-A tabanlı bir mRNA saflaştırma stratejisi kullanan ticari bir ekstraksiyon kiti (bakınız Malzeme Tablosu) kullanılmıştır.
   1. Lizis çözeltisinde 50 mg izole trikomu yeniden askıya alın, 30 s boyunca vorteks, 5 dakika boyunca 35 kHz'de buz gibi soğuk bir ultrasonik temizleme ünitesinde sonikleştirin ve mRNA'yı üreticinin protokolüne göre numunelerden çıkarın (bkz.
   2. Trikomlardan ekstrakte edilen RNA'nın bütünlüğünü tahmin etmek için, RNA konsantrasyonunu, toplam miktarı ve RNA bütünlük sayısı (RIN) değerlerini bir çip üzerinde laboratuvar sistemi kullanarak belirleyin (bkz.
   3. Trikom fraksiyonlarının RNAseq analizini yapın (isteğe bağlı). RNAseq analizi ve sıralı okumaların biyoinformatik analizleri standart dış kaynak kullanımı hizmetleri ile gerçekleştirilebilir

Sonuçlar

Geleneksel trikom izolasyon protokollerine kıyasla bu protokolde yer alan ana modifikasyon, standart izolasyon ortamının LN ile değiştirilmesidir. LN'yi bir izolasyon ortamı olarak kullanmak, rahat bir iş akışı sağlar, çünkü numuneler LN'ye batırıldığı sürece, metabolik bozulmanın meydana gelmesi muhtemel değildir. Ayrıca, protokol geleneksel trikom izolasyon ortamında kullanılan tehlikeli bileşenlerden (yani, aurintrikarboksilik asit ve β-merkaptoetanol) kaçındığından, iş kimyasal bir ba...

Tartışmalar

Mevcut trikom izolasyon protokolleriyle karşılaştırıldığında, mevcut protokolde iki ana değişiklik açıklanmaktadır. Bunlar, trikomların ilk adımda kuru buz kullanılarak bitki malzemesinden ayrılmasını ve yaygın olarak kullanılan sıvı tampon ortamının yerine LN'nin kullanılmasını içerir. C. sativa trikom saflaştırması için ilk modifikasyon, trikomları sardunya pedicellerinden ayırmak için ezilmiş kuru buz kullanımını tanıtan daha önceki bir protokole dayanmaktadır

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip	Agilent, Germany	Reorder number 5067-1513	Lab-on-a-chip system
Transsonic-310	Elma, Germany	D-78224	Ultrasonic cleaning unit
TruSeq RNA Sample Prep Kit v2	Illumina, USA	RS-122-2001	Sample preperation for RNA sequencing library
Spectrum Plant Total RNA Kit	SIGMA-ALDRICH, USA	STRN50-1KT	Plant Total RNA Kit
Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter)	Sinun Tech, Israel	r0350n350210	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0150n360465	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0105n320718	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0080n370465	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0065n340715	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0080n370465	Nylon screen aperture
Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen)
Suitable gloves for handling low temperatures
Safety goggles
1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm)
Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm
1 L glass beaker
1 block of dry ice (0.5-1 kg)
Hammer and hard flat object
Two 5 L plastic containers
Rubber bands
Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference
Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container
Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula
Clean plate
Several clothespins
Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle
Two containers of liquid nitrogen
1 cm wide painting brush