Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonunun Fare Modellerinde Retinal Pigmentli Epitel Patolojilerini Değerlendirme ve Ölçme Protokolü

Özet

Fare modelleri, retinal pigmentli epitelin (RPE) biyolojisini araştırmak için yararlı araçlar olabilir. Farelerin bir dizi RPE patolojisi geliştirebileceği tespit edilmiştir. Burada, ışık, iletim elektronu ve konfokal mikroskopi kullanarak farelerde RPE patolojilerini aydınlatmak ve ölçmek için bir fenotipleme protokolü tarif ediyoruz.

Özet

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), yaşlanan popülasyonlarda zayıflatıcı bir retina hastalığıdır. Retinal pigmente epitel (RPE) disfonksiyonunun YBMD'de önemli bir patobiyolojik olay olduğuna inanılmaktadır. RPE disfonksiyonuna yol açan mekanizmaları anlamak için, fare modelleri araştırmacılar tarafından kullanılabilir. Önceki çalışmalarla, farelerin, bazıları AMD tanısı alan bireylerin gözlerinde gözlenen RPE patolojileri geliştirebileceği tespit edilmiştir. Burada, farelerde RPE patolojilerini değerlendirmek için bir fenotipleme protokolü tanımlanmaktadır. Bu protokol, ışık mikroskobu ve transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak retinal kesitlerin hazırlanmasını ve değerlendirilmesini ve ayrıca konfokal mikroskopi ile RPE düz montajlarının hazırlanmasını ve değerlendirilmesini içerir. Bu tekniklerle gözlemlenen yaygın murin RPE patolojileri türlerini ve bunları istatistiksel testler için tarafsız yöntemlerle ölçmenin yollarını detaylandırıyoruz. Kavram kanıtı olarak, bu RPE fenotipleme protokolünü, transmembran protein 135'i (Tmem135) aşırı eksprese eden farelerde ve yaşlı vahşi tip C57BL / 6J farelerde gözlenen RPE patolojilerini ölçmek için kullanıyoruz. Bu protokolün temel amacı, AMD'nin fare modellerini kullanan bilim adamları için standart RPE fenotipleme yöntemlerini tarafsız nicel değerlendirmelerle sunmaktır.

Giriş

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), 55 yaşın üzerindeki popülasyonları etkileyen yaygın bir körleme hastalığıdır¹. Birçok araştırmacı, retinal pigmentli epitel (RPE) içindeki disfonksiyonun AMD^2'de erken ve önemli bir patobiyolojik olay olduğuna inanmaktadır. RPE, komşu fotoreseptörlerin ve koroidal kan damarlarının homeostazını korumakla görevli polarize hücrelerin tek katmanlıdır³. RPE içindeki hastalıkla ilişkili mekanizmaları araştırmak için, hücre kültürü modelleri ^4,5 ve fareler ^6,7,8 dahil olmak üzere çeşitli modeller mevcuttur. Yakın tarihli bir rapor, RPE hücre kültürü modelleri⁴ için standartlaştırılmış protokolleri ve kalite kontrol kriterlerini tanımlamıştır, ancak hiçbir rapor fare modellerinde RPE'nin fenotiplemesini standartlaştırmaya çalışmamıştır. Aslında, AMD'nin fare modelleri üzerine yapılan birçok yayın, RPE'nin tam bir tanımından veya içlerindeki RPE patolojilerinin nicelleştirilmesinden yoksundur. Bu protokolün genel amacı, AMD fare modellerini kullanan bilim adamları için standart RPE fenotipleme yöntemlerini tarafsız nicel değerlendirmelerle sunmaktır.

Önceki yayınlar, üç görüntüleme tekniği ile farelerde çeşitli RPE patolojilerinin varlığına dikkat çekmiştir. Örneğin, ışık mikroskobu, araştırmacıların murin retinasının brüt morfolojisini görmelerini (Şekil 1A) ve RPE incelmesi, vakuolizasyon ve göç gibi RPE patolojilerini tespit etmelerini sağlar. Bir AMD fare modelindeki RPE inceltmesi, RPE yüksekliğindeki ilgili kontrollerden sapma ile örneklendirilir (Şekil 1B). RPE vakuolizasyonu iki ayrı kategoriye ayrılabilir: mikrovakuolizasyon (Şekil 1C) ve makrovakuolizasyon (Şekil 1D). RPE mikrovakuolizasyonu, RPE'de toplam yüksekliğini etkilemeyen vakuollerin varlığı ile özetlenirken, makrovakuolizasyon, fotoreseptörlerin dış segmentlerine çıkıntı yapan vakuollerin varlığı ile gösterilir. RPE migrasyonu, retinal bir kesitte RPE tek katmanının üzerindeki pigmentin fokal agregası ile ayırt edilir (Şekil 1E). AMD donör gözlerindeki göçmen RPE hücrelerinin, farklılaşma kümesi 68 (CD68)9 gibi immünoreaktivite gösterdikleri ve RPE enkazını veya transdiferansiyasyon⁹ geçiren RPE'yi yutan bağışıklık hücrelerini temsil edebileceği unutulmamalıdır. İletim elektron mikroskobu adı verilen başka bir görüntüleme tekniği, araştırmacıların RPE'nin ve bazal zarının ultrayapısını görselleştirmelerine izin verebilir (Şekil 2A). Bu teknik, bazal laminer tortu (BLamD) olarak bilinen farelerde baskın sub-RPE birikintisini tanımlayabilir (Şekil 2B)¹⁰. Son olarak, konfokal mikroskopi, RPE düz montajlarını görüntüleyerek RPE hücrelerinin yapısını ortaya çıkarabilir (Şekil 3A). Bu yöntem, RPE dismorfisini, RPE'nin klasik petek şeklinden sapmasını ortaya çıkarabilir (Şekil 3B). Ayrıca RPE multinükleasyonunu, bir RPE hücresi içinde üç veya daha fazla çekirdeğin varlığını tespit edebilir (Şekil 3C). Mevcut AMD fare modellerinde bulunan RPE patolojilerinin bir özeti için, araştırmacıları literatürden bu incelemelere yönlendiriyoruz ^6,7.

AMD'yi inceleyen araştırmacılar, fenotipleme protokolünden önce RPE patolojilerini araştırmak için fare kullanmanın avantaj ve dezavantajlarının farkında olmalıdır. Fareler, nispeten kısa ömürleri ve maliyet etkinliklerinin yanı sıra genetik ve farmakolojik manipüle edilebilirlikleri nedeniyle avantajlıdır. Fareler ayrıca AMD donör gözlerinde^gözlenen RPE göçü, dismorfi ve çoklu çekirdeklenme dahil olmak üzere RPE dejeneratif değişiklikler sergiler 11,12,13,14,15,16,17; bu, benzer mekanizmaların farelerde ve insanlarda bu RPE patolojilerinin gelişiminin altında yatabileceğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, fare çalışmalarının insan AMD'sine çevrilebilirliğini sınırlayan önemli farklılıklar vardır. İlk olarak, farelerde AMD'de tercihen etkilenen görme keskinliği için gerekli olan insan retinasının anatomik olarak farklı bir bölgesi olan bir makula yoktur. İkincisi, farelerde RPE incelmesi ve vakuolizasyon gibi bazı RPE patolojileri tipik olarak AMD donör gözlerinde görülmez¹⁸. Üçüncüsü, fareler AMD patolojisinin ayırt edici bir özelliği olan drusen geliştirmezler¹⁹. Drusen, RPE bazal lamina ile Bruch zarının (BrM) iç kollajenöz tabakası arasında oluşan çok az bazal membran proteinine sahip lipit ve protein içeren birikintilerdir19. Drusen, farelerde ortak alt RPE birikintisi olan BLamD'den hem bileşimlerinde hem de anatomik konumlarında farklılık gösterir. BLamD'ler, BrM'nin RPE bazal laminası ile RPE^20'nin bazal kıvrımları arasında oluşan yaşa ve strese bağlı hücre dışı matriks ile zenginleştirilmiş anormalliklerdir. İlginç bir şekilde, BLamD'ler hem farelerde hem de insanlarda benzer bir protein bileşimine ve görünümüne sahiptir ^6,10,21. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, BLamD'lerin AMD'nin sonraki aşamalarına ilerlemesini etkileyerek AMD'nin patobiyolojisinde hareket edebileceğini düşündürmektedir^18,22; Bu nedenle, bu birikintiler fare retinasında hastalıklı RPE'yi temsil edebilir. Bu faydalar ve sınırlamalar hakkında bilgi sahibi olmak, fare çalışmalarından elde edilen sonuçları AMD'ye çevirmek isteyen araştırmacılar için kritik öneme sahiptir.

Bu protokolde, RPE patolojilerini görselleştirmek için gözleri ışığa, iletim elektronuna ve konfokal mikroskopiye hazırlama yöntemlerini tartışıyoruz. Ayrıca, istatistiksel testler için RPE patolojilerinin tarafsız bir şekilde nasıl ölçüleceğini de açıklıyoruz. Kavramın kanıtı olarak, transmembran protein 135- (Tmem135) aşırı eksprese eden farelerde ve yaşlı vahşi tip (WT) C57BL / 6J farelerde gözlenen yapısal RPE patolojilerini araştırmak için RPE fenotipleme protokolünü kullanıyoruz. Özetle, AMD fare modellerinde RPE'yi karakterize etmek için fenotipleme metodolojisini tanımlamayı amaçlıyoruz, çünkü şu anda standart protokoller mevcut değildir. AMD fare modellerinde de etkilenen fotoreseptörlerin veya koroidin patolojilerini incelemek ve ölçmek isteyen araştırmacılar, bu protokolü çalışmaları için yararlı bulamayabilirler.

Protokol

Hayvan denekleri içeren tüm prosedürler, Wisconsin-Madison Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır ve Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) Beyanı ile uyumludur.

1. Fare RPE'sinin ışık mikroskobu ile değerlendirilmesi

1. Bir cam şişede oda sıcaklığında (RT) son konsantrasyonu% 2 paraformaldehit ve% 2 glutaraldehit içeren fiksatif bir tampon yapın.
   NOT: Bu protokol, fare başına en fazla 14 mL fiksatif arabellek gerektirir.
   DİKKAT: Paraformaldehit ve glutaraldehit tehlikeli maddelerdir. Lütfen bu maddelerle çalışırken standart çalışma prosedürlerini izleyin.
2. Bir duman davlumbazında kardiyak perfüzyon için emici bir alt ped üzerinde bir yerçekimi beslemeli perfüzyon sistemi hazırlayın (Ek Şekil 1A).
   1. Fiksatif tamponun 40 mL'sini perfüzyon sisteminin şırınga haznesine yerleştirin (Ek Şekil 1B).
   2. Tamponun boru hattından akmasına izin vermek için valfi boru hattına paralel olana kadar çevirin (Ek Şekil 1C). Tüm hava kabarcıkları hattan çıkarılana kadar çizgiyi tamponla yıkayın.
   3. Tamponun boru hattına akmasını durdurmak için valfi boru hattına dik olana kadar çevirin (Ek Şekil 1D).
      NOT: Perfüzyon sistemi artık kullanıma hazırdır.
3. Fareyi bir karbondioksit (CO 2) odasına yerleştirerek ötenazi yapın ve CO_2'nin dakikada oda hacminin% 30'luk bir akış hızında odaya akmasına izin verin. Fare nefes almayı bıraktığında, CO_2'nin odaya en az 1 dakika akmasına izin verin. Sonraki adıma geçmeden önce farenin öldüğünü doğrulayın.
   NOT: Farmakolojik ajanların enjeksiyonu yoluyla ötenazi, bu protokolde CO₂ inhalasyonuna alternatif olarak kullanılabilir.
4. Ötanazi farede kardiyak perfüzyon yapın.
   1. Fareyi, karnı yukarı bakacak şekilde perfüzyon sisteminin yakınındaki sığ bir tepsiye aktarın. Karnına% 70 etanol (EtOH) püskürtün.
   2. Karın boşluğunu açığa çıkarmak için dört insizyon yapın (Ek Şekil 2A).
      1. Göğüs kafesinin hemen altındaki farenin en uzak sol tarafındaki deri ve karın duvarından kavisli makas ve forseps kullanarak 5 cm daha düşük bir kesim oluşturun.
      2. Alt kesimin tepesinden başlayan farenin derisinden ve karın duvarından 3 cm'lik bir medial kesim yapmaya devam edin.
      3. Medialin sonunda, göğüs kafesinin hemen altındaki farenin en uzak sağ tarafındaki deri ve karın duvarından 5 cm daha aşağı kesim yapın.
      4. Kavisli forsepslerle abdominal deri flebini çıkarmak için 3 cm'lik başka bir medial kesi yapın.
   3. Kalbi açığa çıkarmak için diyaframı ve sternumu kesin (Ek Şekil 2B).
      NOT: Kalbin, atardamarların ve damarların tıkanmasından kaçınmaya dikkat edin. Bunları çentiklemek verimsiz bir kardiyak perfüzyona yol açacaktır.
   4. Gösterge iğnesini kalbin sol ventrikülüne yerleştirin. Vanayı boru hattına paralel olana kadar çevirin. Kanın ve fiksatifin kalpten çıkmasına izin vermek için sağ atriyumu kavisli makasla kesin (Ek Şekil 2C).
   5. 10 mL fiksatif tamponun fareye en az 1-2 dakika boyunca veya karaciğer soluk renkli hale gelene ve sağ atriyumdan kan akmayana kadar nüfuz etmesine izin verin. Perfüzyon tamamlandıktan sonra, tamponun akışını durdurmak için valfi boru hattına dik olana kadar çevirin.
5. Kardiyak perfüzyondan sonra gözleri fareden enükleat.
   1. Fareyi sığ tepsiden çıkarın ve fareyi bir duman başlığındaki emici alt pedin üzerine yerleştirin. Farenin kafasını, sol gözü deneyciye bakacak ve sağ göz görüş alanı dışında kalacak şekilde yönlendirin. Gözün üst tarafına bir doku işaretleme boyası ile açıklama ekleyin.
   2. Gözün göz yuvasından çıkıntısına neden olmak için başparmak ve işaret parmağınızla göz yuvasının etrafına hafifçe bastırın (Ek Şekil 3A).
   3. Kavisli makas alın ve bıçakla göz yuvasından 30° açıyla tutun. Kavisli makasla göz çevresini 30° açıyla kesmeye devam edin (Ek Şekil 3B).
      NOT: Göz küresinin bütünlüğünü korumak için göz yuvasından fazla dokunun kesilmesi uygundur.
   4. Göz küresini kavisli forseps ile kafadan çıkarın ve emici bir alt pedin üzerine yerleştirin. Korneayı 11 numaralı neşter bıçağı ile birleştirin ve kavisli forsepsli gözü 2 mL fiksatif tampona sahip 2 mL'lik bir mikrotüpe yerleştirin. Sol gözü belirtmek için 2 mL'lik mikrotüpü fare kimliği ve 'sol' ile etiketleyin.
      NOT: Korneadaki çentik, fiksatifin daha iyi korumak için göze kolayca nüfuz etmesini sağlar.
   5. Sağ göz için 1.5.1-1.5.4 arasındaki adımları tekrarlayın.
6. Gözlerin, dakikada 75 dönüş (rpm) hızında, 4 ° Santigrat (C) odadaki bir çalkalayıcıda gece boyunca fiksatif tamponda inkübe olmasına izin verin.
7. Fiksatif tamponu 2 mL 1x fosfat tampon salin (PBS) ile değiştirin. Gözleri RT ve 75 rpm'de bir çalkalayıcıda 10 dakika boyunca 1x PBS'de inkübe edin. Bu adımı iki kez yineleyin.
8. Arka segmentleri oluşturmak için gözleri temizleyin ve disseke edin.
   NOT: Arka segment, nöral retina, RPE, koroid ve sklera ile kornea, iris ve lens ile fare göz küresidir.
   1. Gözü diseksiyon mikroskobu altında 1x PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin (Ek Şekil 4A).
   2. Herhangi bir yağ ve kası ince uçlu forsepslerle göz küresinden yavaşça kaldırın. Göz küresi düzgün bir mavimsi-siyah renge sahip olana kadar yağ ve kası mikro disseke edici makasla göz küresine paralel yönde dikkatlice kesin (Ek Şekil 4B).
      NOT: Göz küresine zarar verdiği için dik yönde kesmeyin. Ayrıca, doku işaretleme boyası işleme sırasında çıkarsa, göz küresinin üst tarafına derhal yeniden açıklama ekleyin.
   3. İnce uçlu forsepsleri kornea delinme bölgesine yerleştirin. Kornea ve irisi göz küresinden çıkarmak için delinme bölgesinden başlayarak korneanın çevresini mikro diseksiyon makası ile kesin (Ek Şekil 4C).
   4. İnce uçlu forseps alın ve arka segmenti elde etmek için lensi göz küresinden yavaşça çıkarın (Ek Şekil 4D).
   5. Arka segmenti 2 mL 1x PBS ile 2 mL'lik bir mikrotüpe geri yerleştirin. Arka segmenti 4 °C'lik bir buzdolabında saklayın.
      NOT: Arka segmentler, daha fazla işlem yapılmadan önce haftalarca 4 ° C'de 1x PBS'de kalabilir.
9. Gözleri çalışmadaki diğer farelerden hazırlamak için 1.3-1.8 adımlarını tekrarlayın.
10. Bölümleme için her farenin arka segmentlerinden birini işleyin ve parafine yerleştirin. Arka segmentin üst tarafının üstte olduğundan emin olun.
    NOT: Yazarlar bu görevleri yerine getirmek için Wisconsin-Madison Üniversitesi (UW) Patolojide Translasyonel Araştırma Girişimleri (TRIP) laboratuvarına güvenmektedir. İşte benzer bir parafin işleme ve gömme yöntemi kullanılarak yayınlanan protokoller^23,24.
11. Optik sinir kafasını içeren 5 μm kalınlığında bir retina bölümünün yanı sıra birbirinden 250 μm uzaklıkta dört ek 5 μm kalınlığında retinal bölüm elde etmek için her parafin bloğunu kırpın ve kesinleştirin. Slaytları fare kimliği ve seri bölüm numarasıyla (örneğin, 1, 2, 3, 4 veya 5) etiketleyin. Slaytları bir slayt kutusunda saklayın.
    NOT: Yazarlar parafin kesitlemedeki hizmetleri için UW TRIP laboratuvarına güvenmektedir. İşte benzer parafin kesitleme yöntemi^25,26 kullanılarak yayınlanan protokoller.
12. Retina kesitleri içeren slaytları hematoksilin ve eozin (H&E) ile lekeleyin. H&E boyama protokolü Ek Şekil 5'te bulunabilir.
    NOT: H&E boyama prosedürünün tüm adımları bir duman davlumbazında tamamlanmalıdır.
13. H&E boyalı retina kesitlerinin dikişli görüntülerini, 20x büyütmede bir ışık mikroskobu kullanarak bir ölçek çubuğuyla toplayın.
14. Her numune için optik sinir kafasını içeren retinal görüntülerdeki RPE kalınlığını ölçün.
    1. Fiji ImageJ programını indirin ve açın. Optik sinir kafasını içeren tüm dikişli retinal görüntüleri Fiji ImageJ görev çubuğuna sürükleyin. Görüntü ölçeğinin piksel cinsinden değil, μm cinsinden kalibre edildiğini doğrulayın.
       NOT: Görüntü ölçeği, Fiji ImageJ programında retinal bir görüntü içeren pencerenin sol üst köşesinde bulunur. Ölçek piksel cinsinden ayarlanmışsa, pikselleri μm'ye dönüştürmek için lütfen Fiji ImageJ programının kullanım kılavuzuna bakın.
    2. Her görüntüde her 300 μm aralığında, optik sinir başının kenarından retinanın sonuna (ora serrata) kadar işaretleyin. Fiji ImageJ görev çubuğundaki Düz simgesine tıklayın. Optik sinir kafasının kenarından 300 μm uzunluğundaki ora serrata'ya doğru bir çizgiyi tıklayın ve sürükleyin. Fiji ImageJ görev çubuğundaki Boya Fırçası aracına tıklayın ve işaretlemek için 300 μm satırın sonuna tıklayın.
    3. İşaretlenen her aralıkta RPE kalınlığını ölçün. Fiji ImageJ görev çubuğundaki Düz simgesine tıklayın. RPE'nin üstünden altına bir çizgiyi tıklatıp sürükleyin (Ek Şekil 6). RPE kalınlığını elde etmek için Fiji ImageJ menü çubuğundaki Analiz > Ölç'e tıklayın.
    4. RPE kalınlık ölçümlerini bir elektronik tabloya aktarın ve ölçümleri içeren sütunu fare tanımlamasıyla etiketleyin. Ek bir sütunu 'İşaretli Aralık' ile etiketleyin ve optik sinir değerlerinden uzaklığı girin (örneğin, 300, 600, 900, vb.)
       NOT: İlk ölçülen aralık optik sinirden 300 μm uzaklığa, ikinci ölçülen aralık 600 μm uzağa karşılık gelir, vb.
15. Her örnek için retina görüntülerine dayanarak RPE patoloji insidans oranlarını ölçün.
    1. Fiji ImageJ programını açın.
    2. Fiji ImageJ programında Hücre Sayacı uygulamasını açın. Fiji ImageJ menü çubuğundaki > Hücre Sayacını Analiz > Eklentiler'e tıklayın. Retinal bir görüntüyü Fiji ImageJ görev çubuğuna sürükleyin ve Hücre Sayacı penceresinde Başlat'a tıklayın.
    3. Hücre Sayacı uygulamasını kullanarak retina kesiti başına RPE patolojilerinin sayısını sayın. Sayaçlar altında Tip 1'e tıklayın ve ardından görüntüdeki tüm mikrovakuolizasyon olaylarına tıklayın. Sayaçlar altında Tür 2'ye tıklayın ve ardından görüntüdeki tüm makrovakuolizasyon olaylarına tıklayın. Sayaçlar altında Tip 3'e tıklayın ve ardından görüntüdeki tüm bireysel geçiş olaylarına tıklayın.
    4. RPE patolojilerinin numaralarını bir elektronik tabloya aktarın. Satırları mikrovakuolizasyon, makrovakuolizasyon veya migrasyon ile ve sütunu fare kimliği ile etiketleyin.
    5. Numunenin diğer görüntüleri için 1.15.2-1.15.4 arasındaki adımları yineleyin. Örnek başına RPE patolojilerinin ortalamasını alın ve elektronik tablodaki örnek için her RPE patolojisinin insidans oranını hesaplamak için beşe bölün.
16. Çalışmadaki gruplar arasında anlamlı farklılıklar olup olmadığını belirlemek için her aralıkta RPE kalınlıkları ve RPE patoloji insidans oranları üzerinde istatistiksel analiz yapın.

2. Fare RPE'sinin transmisyon elektron mikroskobu ile değerlendirilmesi

1. 1.5-1.9. basamaklardan sonra ortaya çıkan diğer arka segmentleri üstün işaret boyunca ikiye bölün ve tıraş bıçağı ile iki bölüme ayırın. Kesitli arka segmentlerin üst tarafını doku işaretleme boyası ile yeniden açıklamalayın. Kesitli arka segmentleri, 2 mL 1x PBS ve fare tanımlaması içeren yeni 2 mL mikrotüplere ayırın.
   NOT: Farenin arka segmenti tek parça halinde işlenemeyecek kadar büyüktür ve iletim elektron mikroskobu işlemi için ikiye bölünmelidir.
2. Dokuları 2 mL 0.1 M kakodilat tamponu, pH 7.2 ile durulayın. Tezgah üstü RT'de 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Bu adımı iki kez daha yineleyin.
3. 0,1 M kakodilat tamponunu, 0,1 M kakodilat tamponunda seyreltilmiş 2 mL %2 ozmiyum tetroksit (OsO₄) ile değiştirin. Duman davlumbazında RT'de 1,5 saat inkübe edin.
   DİKKAT: OsO₄ zehirli bir maddedir. OsO₄ ile çalışırken lütfen standart çalışma prosedürlerini izleyin.
4. Dokuları 2 mL 0.1 M kakodilat tamponu ile duman davlumbazında RT'de 10 dakika durulayın. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
5. Duman davlumbazındaki RT'de% 50 ila% 100 arasında değişen kademeli EtOH seyreltmeleri ile dokuları dehidrate edin. Dehidrasyon prosedürü için bir protokol Ek Şekil 7'de bulunabilir.
6. Dokulardan% 100 EtOH çıkarın ve dokulara 2 mL propilen oksit ekleyin. RT'de duman davlumbazında 15 dakika boyunca inkübe edin. Propilen oksidi dokulardan çıkarın ve dokulara 2 mL taze propilen oksit ekleyin. RT'de duman davlumbazında 15 dakika boyunca inkübe edin.
   DİKKAT: Propilen oksit toksik bir maddedir. Lütfen propilen oksit ile çalışırken standart çalışma prosedürlerini izleyin.
7. Propilen oksiti dokulardan çıkarın ve dokulara 2 mL'lik 1: 1 propilen oksit ve reçine karışımı ekleyin. RT'deki duman davlumbazında bir gece boyunca vakum altında bırakın.
   DİKKAT: Reçine insanlar için tehlikeli bir maddedir. Reçine ile çalışırken lütfen laboratuvarın standart çalışma prosedürlerine uyun.
8. Dokulardaki 1: 1 propilen oksit ve reçine karışımını 2 mL saf reçine ile değiştirin. RT'deki duman davlumbazında bir gece boyunca vakum altında bırakın.
9. Dokuları reçineye gömün. Kaleme fare kimliği olan bir etiket ve kalıba bir damla reçine yerleştirin. Dokuyu reçine damlasına yerleştirin. Kalıbı reçine ile doldurun ve duman davlumbazında RT'de 1 saat boyunca vakum altına yerleştirin.
10. Etiketleri ve numuneleri ince uçlu forsepslerle, arka vizör adaptörü bölümünün arka tarafı üstte olacak şekilde yeniden konumlandırın. Kalıbı gece boyunca 65 °C'de duman davlumbazındaki bir fırında bırakın.
11. Kalıpları fırından çıkarın. Kalıpların tezgah üstünde RT'ye soğumasını bekleyin. Blokları kalıplardan çıkarın.
    NOT: Bloklar artık kırpmaya hazırdır.
12. Bir yamuk oluşturmak için reçine bloklarını bir tıraş bıçağı ile şekillendirin. Optik sinir kafası görünene kadar reçine bloklarını bir mikrotom kullanarak kesin. Reçine bloklarından 0,5 μm kalınlığında yarı ince kesitler kesmek için bir elmas bıçak kullanmaya devam edin.
    NOT: İşte mikrotom kesitleme²⁷ ile ilgili yayınlanmış bir protokol. İstenirse, numunenin bütünlüğünü değerlendirmek için reçine bloklarından 0,5 μm kalınlığında yarı ince kesitler toplanabilir ve boyanabilir.
13. Bir ultramikrotom kullanarak her kesilmiş bloktan 70 nm kalınlığında ultra ince bir bölüm kesin. 400 örgülü ince çubuklu bakır ızgara üzerinde 70 nm kalınlığında ultra ince bir bölüm toplayın. Izgarayı bir ızgara depolama kutusuna yerleştirin ve yuvayı fare tanımlamasıyla etiketleyin.
    NOT: İşte ultramikrotom kesitleme²⁸ ile ilgili yayınlanmış bir protokol.
14. Izgaraları 5 dakika boyunca% 2 uranil asetat ile ve daha sonra duman davlumbazındaki RT'de 5 dakika boyunca% 3.5 kurşun sitrat çözeltisi ile lekeleyin.
    DİKKAT: Uranil asetat ve kurşun sitrat tehlikeli maddelerdir. Lütfen bu maddelerle çalışırken standart çalışma prosedürlerini izleyin.
15. Bakır ızgaranın ızgara çizgilerinin RPE ve BrM ile kesiştiği 15.000x büyütmede bir iletim elektron mikroskobu kullanarak her numune için görüntüler elde edin.
    NOT: Bölüm başına en az 20 ila 35 resim ve örnek başına 40 ila 70 resim olmalıdır.
16. Çalışmadaki örnekler için görüntülerdeki BLamD yüksekliklerini ölçün.
    1. Fiji ImageJ programını açın. Örnek bölümdeki tüm görüntüleri Fiji ImageJ görev çubuğuna sürükleyin. Görüntülerin piksel cinsinden değil, μm cinsinden kalibre edildiğinden emin olun.
    2. Görüntülerdeki BLamD yüksekliğini ölçün. Fiji ImageJ görev çubuğundaki Düz simgesine tıklayın. BrM'nin elastik laminasından bir çizgiyi tıklayın ve görüntüdeki en yüksek tortunun üstüne sürükleyin (Ek Şekil 8). Görüntüdeki BLamD yüksekliğini elde etmek için Fiji ImageJ menü çubuğunda Analiz > Ölçü'yü tıklatın.
       NOT: Görüntüde BLamD yoksa, BrM'nin elastik laminasından RPE'nin bazal laminasına bir çizgi çizin.
    3. BLamD yüksekliklerini bir elektronik tabloya ve fare kimliğiyle etikete aktarın.
17. Elektronik tabloda genotip başına BLamD yüksekliklerinin kümülatif frekanslarını ve fare başına BLamD yüksekliklerinin ortalamalarını hesaplayın. Çalışmadaki gruplar arasında anlamlı farklılıklar olup olmadığını belirlemek için BLamD yüksekliklerinin ortalamaları üzerinde istatistiksel analiz yapın.

3. Fare RPE'sinin konfokal mikroskopi ile değerlendirilmesi

1. Farelerden gözleri toplayın. Fareleri adım 1.3'te açıklanan prosedüre göre ötenazi yapın. Adım 1.5'i kullanarak gözleri enükleatın. Kavisli forseps kullanarak gözleri, 2 mL 1x PBS ve fare tanımlaması ile 2 mL'lik bir mikrotüpe yerleştirin.
   NOT: Fotoreseptörlerin ve RPE apikal süreçlerinin sayısallaştırılması, konfokal mikroskopi yoluyla RPE'nin daha iyi görselleştirilmesine izin verdiğinden, fareleri karanlık adapte etmeyin.
2. Fare arka vizör kapakları oluşturmak için fare gözlerini hemen temizleyin ve disseke edin.
   NOT: Arka vizör adaptörü, nöral retina içermediği için arka segmentten farklıdır.
   1. Gözü diseksiyon mikroskobu altında 1x PBS içeren bir Petri kabına aktarın (Ek Şekil 9A).
   2. Adım 1.8.2'de (Ek Şekil 9B) açıklandığı gibi göz küresindeki yağ ve kasları çıkarın.
   3. Göz küresinin korneasını 11 numaralı neşter bıçağı ile birleştirin. Kornea ve irisi adım 1.8.3'te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi çıkarın (Ek Şekil 9C).
   4. İnce uçlu forsepslerle lensi dışarı çekin. İki ince uçlu forseps alın ve nöral retinayı posterior segmentten yavaşça ayırın.
   5. Arka vizör adaptöründen çıkarmak için optik sinir başındaki nöral retinayı dikkatlice kesin (Ek Şekil 9D).
   6. Arka vizör adaptörünü, fare tanımlamalı 500 μL 1x PBS içeren yeni bir 2 mL mikrotüpe yerleştirin.
3. Arka vizör kapaklarını metanol (MeOH) ile sabitleyin (Ek Şekil 10).
   NOT: Adım 3.3'ün tamamlanması yaklaşık 2 saat 40 dakika sürer.
   1. Dokulara 500 μL MeOH ekleyin. RT'de 5 dakika boyunca 75 rpm'de bir çalkalayıcıda inkübe edin.
   2. 500 μL çözeltiyi dokulardan çıkarın ve 500 μL MeOH ekleyin. RT'de 5 dakika boyunca 75 rpm'de bir çalkalayıcıda 5 dakika boyunca inkübe edin.
   3. Tüm çözeltiyi dokulardan çıkarın ve 500 μL MeOH ekleyin. RT'de en az 2 saat boyunca 75 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
      NOT: Adım 3.3.3'e alternatif olarak, arka vizör adaptörü MeOH'da 4 °C'lik bir odada 75 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca inkübe edilebilir.
   4. Dokulara 500 μL 1x PBS ekleyin. RT'de 5 dakika boyunca 75 rpm'de bir çalkalayıcıda inkübe edin.
   5. 500 μL çözeltiyi dokulardan çıkarın ve 500 μL 1x PBS ekleyin. RT'de 5 dakika boyunca 75 rpm'de bir çalkalayıcıda inkübe edin.
   6. Tüm çözeltiyi dokulardan çıkarın ve 500 μL 1x PBS ile değiştirin.
      NOT: Mendiller MeOH tarafından tamamen sabitlenir ve en az 1 ay boyunca 4 °C'lik bir buzdolabında saklanabilir.
4. RPE'nin sıkı bağlantılarını ve çekirdeklerini görselleştirmek için arka vizörlerin immünofloresan boyamasını yapın (Ek Şekil 11).
   1. 500 μL 1x PBS'yi numunelerden çıkarın ve 1x PBS çözeltisine 100 μL seyreltilmiş% 10 normal eşek serumu ekleyin. RT'de 30 dakika boyunca 75 rpm'de bir çalkalayıcıda inkübe edin.
   2. Seyreltilmiş% 10 normal eşek serumu çözeltisini numunelerden çıkarın ve 1x PBS'de bir tavşan poliklonal anti-Zonula Occludens-1 (ZO-1) antikorunun 1:50 seyreltilmesinin 100 μL'sini ekleyin. Numuneleri 4 ° C'lik bir odaya aktarın ve 75 rpm'de bir çalkalayıcıda gece boyunca inkübe edin.
   3. Antikor seyreltmesini numunelerden çıkarın ve 2 mL 1x PBS ekleyin. RT'de 10 dakika boyunca 75 rpm'de bir çalkalayıcıda inkübe edin.
   4. 1x PBS'yi örneklerden çıkarın. Numunelere, 488 florofor konjuge etiketli bir eşek anti-tavşan IgG antikorunun 1:250 seyreltilmesinin 100 μL'sini ve 1x PBS'de 4',6-Diamidin-2'-fenilindol dihidroklorürün (DAPI) 1:250 seyreltilmesini ekleyin. Numuneleri alüminyum folyo ile örtün ve RT'de 2 saat boyunca 75 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
      NOT: Fotobeyazlatmayı önlemek için numuneler tamamen alüminyum folyo ile kaplanmalıdır.
   5. Antikor ve DAPI seyreltmelerini numunelerden çıkarın. Numunelere 2 mL 1x PBS ekleyin, alüminyum folyo ile tekrar örtün ve RT'de 10 dakika boyunca 75 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
      NOT: RPE'nin sıkı bağlantıları ve çekirdekleri artık sırasıyla tamamen etiketlenmiş ve boyanmıştır.
5. Arka vizör kapaklarını mikroskop slaytlarına monte edin.
   1. Bir mikroskop slaytını fare kimliğiyle etiketleyin. Arka vizör adaptörünü, koroidal tarafı aşağı bakacak şekilde diseksiyon mikroskobu altındaki bir mikroskop slaydına aktarın. Kurumasını önlemek için arka vizör adaptörüne 1x PBS damla ekleyin (Ek Şekil 12).
   2. Arka vizör adaptörünü, kardinal yönlere (yani kuzey, doğu, güney ve batı) karşılık gelen dört kadran verecek dört noktada 11 numaralı bir neşter bıçağı kullanarak kesin. Arka vizör adaptörünün çevresinden doku ile fazla 1x PBS dab. Arka vizör adaptörünü bir deve kılı fırçası ve ince uçlu forseps ile hafifçe düzleştirin (Ek Şekil 12).
      NOT: Elde edilen ürün artık RPE düz montajı olarak bilinir.
   3. RPE düz montajına bir damla montaj ortamı ekleyin ve üzerine bir kapak kayması yerleştirin. Kapak kapağını kapatmak için şeffaf tırnak cilası uygulayın ve kapalı bir çekmecede RT'de en az 30 dakika kurumasını bekleyin. Slaytları bir slayt taşıyıcı kutusuna yerleştirin ve kutuyu 4 °C buzdolabında saklayın.
      NOT: RPE düz montajına kabarcık bulaşmasını önlemeye dikkat edin. RPE düz montajları 2 haftalık bir zaman dilimi içinde görüntülenebilir.
6. RPE düz montajının optik sinirini çevreleyen dört kadrandan her birinin görüntüsünü, her numune için 20x büyütmede konfokal bir mikroskopta elde edin. RPE düz montaj görüntüsünün bir örneği Ek Şekil 13A'da bulunabilir.
   NOT: RPE düz montajının boyutsal farklılıklarını telafi etmek için birden fazla görüntünün alındığı ve istiflendiği RPE düz montajlarının z-stack görüntülemesinin yapılması gerekebilir.
7. Her RPE düz bağlama görüntüsündeki RPE hücrelerinin sıkı birleşimlerini izleyin. İzlenen RPE düz montaj görüntüsünün bir örneği Ek Şekil 13B'de bulunabilir.
   1. Fiji ImageJ programını açın. RPE düz bağlama görüntüsünü Fiji ImageJ görev çubuğuna sürükleyin. Görüntünün piksel cinsinden değil, mikrometre cinsinden kalibre edildiğini doğrulayın.
   2. Fırça genişliğini 3, saydamlığı 0 ve rengi kırmızı olarak ayarlamak için Fiji ImageJ görev çubuğundaki Bindirme Fırçası Aracı simgesine çift tıklayın. Overlay Brush Tool (Bindirme Fırçası Aracı) penceresindeki Close (Kapat) düğmesini tıklatın.
   3. Bindirme Fırçası Aracı simgesine tıklayın. Tamamen görüntünün içinde bulunan tüm RPE hücrelerinin dar birleşimlerini tıklatın ve sürükleyin.
      NOT: Bir izleme hatası yapılması durumunda, izleme hatasını görüntüden kaldırmak için Bindirme Fırçası Aracı simgesini çift tıklatın ve Kaplama Fırçası Aracı penceresindeki Geri Al kutusunu tıklatın.
   4. Fiji ImageJ görev çubuğundaki Dikdörtgen simgesini tıklatın. Resmin üzerine tıklayın ve görüntünün çevresini sürükleyin. İzlenen çizgileri korumak ve görüntüdeki mavi ve yeşil renkleri kaldırmak için Fiji ImageJ menü çubuğunda Düzenle > Temizle'yi tıklatın.
   5. İzleme görüntüsünü fare kimliği, kadran konumu (yani kuzey, güney, doğu veya batı) ve CP sonek etiketi ile uygun bir konuma kaydedin.
      NOT: Adım 3.7.4'ü tamamlamadan RPE izleme görüntüsünü kaydetmeyin.
8. Her örnek için RPE hücre alanlarını hesaplayın.
   1. Bilgisayar masaüstü ekranında bir klasör oluşturarak RPE alan analizinden dosyaları kaydetmek için bir konum belirleyin. Her RPE izleme görüntüsü için alt klasörler oluşturun ve alt klasörleri fare kimliğinin yanı sıra çeyrek konumuyla (yani kuzey, güney, doğu veya batı) etiketleyin.
   2. Hücre Profil Oluşturucu programı^29'u yükleyin ve açın. Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj (Ek Kodlama Dosyası 1) proje dosyasını indirin. Hücre Profili Oluşturucu program menü çubuğunda Dosya > Proje Aç'ı tıklatarak Ikeda_RPE Alanı Hesaplayıcısı.cpproj dosyasını açın.
   3. Bir RPE izleme görüntüsünü Görüntü içine sürükleyin > Hücre Profili Oluşturucu program penceresindeki Dosya ve Klasörleri Buraya Bırakın kutusu.
   4. RPE izleme görüntüsüne karşılık gelen Cell Profiler programına klasörün konumunu girin. Hücre Profil Oluşturucu program penceresinin sol alt köşesindeki Çıktı Ayarları düğmesine tıklayın ve klasörün konumunu Varsayılan Giriş Klasörü ve Varsayılan Çıktı Klasörü metin kutularına girin.
   5. Cell Profiler program penceresinin sol alt köşesindeki Görüntüleri Analiz Et düğmesine tıklayın. Analiz tamamlandıktan sonra, ekranda bir Analiz Tamamlandı penceresi görünecektir. Analiz Tamamlandı penceresindeki Tamam düğmesine tıklayın.
      NOT: Bu eylem bir csv dosyası ve jpeg görüntüsü oluşturur. CSV dosyası, izleme görüntüsü içindeki RPE hücrelerinin alanlarını içerir. jpeg görüntüsü, her RPE hücresinin bir sayı ile etiketleneceği RPE izleme görüntüsüne karşılık gelir (Ek Şekil 13C).
   6. RPE alanlarını csv dosyasından bir elektronik tabloya aktarın. Elektronik tabloyu fare kimliğiyle etiketleyin.
   7. CSV dosyasındaki her RPE alanının jpeg görüntüsündeki tam olarak izlenen bir RPE hücresine bağlandığını doğrulayarak verilerin kalite kontrol anketini gerçekleştirin. Elektronik tablodan, tam olarak izlenen RPE hücrelerine karşılık gelmeyen değerleri kaldırın.
   8. Hücre Profili Oluşturucu programına dönün. Dosya ve Klasörleri Buraya Bırak kutusunda RPE izleme görüntüsü adına sağ tıklayın ve görüntüyü Hücre Profili Oluşturucu programından kaldırmak için Listeyi Temizle'yi seçin.
   9. Örneğin kalan üç RPE izleme görüntüsünün RPE boyutlarını hesaplamak için 3.8.3-3.8.8 arasındaki adımları yineleyin.
9. Elektronik tablodaki her örnek için RPE hücre boyutu ortalamalarını ölçün.
10. Elektronik tablodaki her örnek için RPE hücre yoğunluklarını ölçün. RPE hücre yoğunluğunu hesaplamak için, kadran başına RPE hücrelerinin toplam sayısını, Hücre Profili Oluşturucu programı tarafından algılanan kadran başına RPE hücrelerinin toplam alanına bölün. RPE hücre yoğunluklarının ortalamasını numune başına dört kadrandan belirleyin.
11. Her örnek için RPE düz montajı başına çok çekirdekli RPE hücrelerinin sayısını ölçün. Numunenin dört çeyreğinde üçten fazla çekirdeğe sahip RPE hücrelerinin sayısını saymak için 1.15.1-1.15.3 adımlarında açıklandığı gibi Fiji ImageJ programındaki Hücre Sayacı uygulamasını kullanın.
12. Çalışmada gruplar arasında anlamlı farklılıklar olup olmadığını belirlemek için RPE hücre boyutu ve yoğunluk ortalamalarının yanı sıra çok çekirdekli RPE hücrelerinin sayısı üzerinde istatistiksel analiz yapın.

Sonuçlar

Bu makalede açıklanan RPE fenotipleme protokolünün tamamlanması, AMD'nin fare modellerinde yaygın olarak gözlenen yapısal RPE anormalliklerinin nicel bir analizini sağlar. Bu protokolün etkinliğini doğrulamak için, tavuk beta-aktin promotörü (Tmem135 TG)30 ve yaşlı C57BL / 6J fareleri^31,32 tarafından tahrik edilen WT Tmem135'i aşırı eksprese eden transgenik fareler de dahil olmak üzere RPE patolojileri göste...

Tartışmalar

Bu yazıda, fare modellerinin yapısal RPE patolojilerini değerlendirmek için bir fenotipleme protokolü tanıtıldı. Işık, transmisyon elektronu ve konfokal mikroskopi dahil olmak üzere çeşitli görüntüleme teknikleri için gözlerin işlenmesi için gerekli adımları ve bu görüntüleme yöntemleriyle gözlenen tipik patolojilerin nicelleştirilmesini tanımladık. RPE fenotipleme protokolümüzün etkinliğini, Tmem135 TG ve 24 aylık WT farelerini inceleyerek kanıtladık, çünkü bu fa...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2	PolyScientiifc R&D Company	S1619
100 Capacity Slide Box			Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol	MDS Warehouse	2292-CASE	Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks	Qosina	11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS)			Premade 1x PBS can be used in this protocol.
2.0 mL microtubes	Genesee Scientific	24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold	Electron Microscopy Sciences	70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends	Fisher Scientific	NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
95% Ethanol	MDS Warehouse	2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches)	VWR	56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle	VWR	23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle	Sigma-Aldrich	Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width	Roboz Surgical Instrument	RS-5211	Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush	Electron Microscopy Sciences	65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps	Fisher Scientific	05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand	Fisher Scientific	11-474-207
Cell Prolifer Program			Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender	VWR	10118-956
Computer
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-5MG
Distilled H20			Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55	Roboz Surgical Instrument	RS-4984	Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder	Electron Microscopy Sciences	71147-01
EPON 815 Resin	Electron Microscopy Sciences	14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye	Fisher Scientific	22050460	Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye.
Epredia Mounting Media	Fisher Scientific	22-110-610	Use for mounting H&E slides.
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source	Dolan-Jenner Industries	Mi-150	Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program			Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector	Thermo Scientific	14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32%	Electron Microscopy Sciences	16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker			Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels	Electron Microscopy Sciences	77564-05
Lead Citrate	Electron Microscopy Sciences	17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips	Thermo Fisher Scientific	22X22I24788001LS	Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin	VWR	100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5600	Known as micro-dissecting scissors in protocol.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
Mice			Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length	Roboz Surgical Instrument	RS-5913	Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum	SouthernBiotech	0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades	VWR	21909-380
Osmium Tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Pencil
Petri Dish	VWR	21909-380
Pipette Tips
Pipettes
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody	Thermo Fisher Scientific	402200
Propylene Oxide	Electron Microscopy Sciences	20412
Razor Blade	VWR	10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic	VWR	89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker	Staples	642736
Slide Rack for Staining	Grainger	49WF31
Squared Cover Glass Slips	Fisher Scientific	12-541B
Staining Dish with Cover	Grainger	49WF30	Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe	Thermo Scientific	S7510-50	Use only the syringe barrel.
Timer	Fisher	1464917
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Use for mounting RPE flat mounts.
Xylene	Fisher Scientific	22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope			This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching.
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope	Electron Microscopy Sciences	65575-02