Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מוצגת כאן שיטה לסינון מבני שומנים באמצעות תיוג איזוטופים יציבים באמצעות זמן השמירה, הניידות והפיצול שלהם.

Abstract

שומנים הם מגוונים מאוד, ושינויים קטנים במבנה השומנים ובהרכבם יכולים להיות בעלי השפעות עמוקות על תפקודים ביולוגיים קריטיים. תיוג איזוטופים יציבים (SIL) מציע מספר יתרונות לחקר פיזור השומנים, ניודיזציה ומטבוליזם, כמו גם סינתזת שומנים דה נובו . היישום המוצלח של טכניקת SIL דורש הסרת הפרעות ממולקולות אנדוגניות. בעבודה הנוכחית אנו מתארים פרוטוקול אנליטי בתפוקה גבוהה לבדיקת שומנים SIL מדגימות ביולוגיות; יוצגו דוגמאות לזיהוי שומנים דה נובו במהלך התפתחות שחלות יתושים. השימוש בכרומטוגרפיה נוזלית משלימה, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסה מאפשר הפרדה והקצאת שומנים מדגימה בודדת בסריקה אחת (<1 שעות). הגישה המתוארת מנצלת את ההתפתחויות האחרונות ברכישה תלוית נתונים ורכישה בלתי תלויה בנתונים, תוך שימוש בצבירה מקבילית במלכודת הניידות ואחריה פיצול רציף ודיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות. מדידת SIL ברמת שרשרת חומצות השומן מגלה שינויים בדינמיקה של שומנים במהלך התפתחות השחלה של יתושים. מבני השומנים דה נובו מוקצים בביטחון בהתבסס על זמן השמירה שלהם, ניידות ודפוס הפיצול שלהם.

Introduction

בעת ניתוח נתוני שומנים, תיוג איזוטופים יציבים (SIL) הוא שיטה יעילה להערכת מסלולים מטבוליים באורגניזמים חיים. בשיטה זו, אטומים בתוך אנליט מוחלפים על ידי איזוטופים יציבים המכילים 13C או 2H. איזוטופים אלה משולבים עוד יותר בקודמנים, אשר מוטמעים מאוחר יותר בתוך חומצות השומן, ומסמנים את האזורים שבהם הם שוכנים. עם איזוטופים אלה, ניתן לזהות את התפלגות ומטבוליזם של שומנים, כפי שהם יהיו בניגוד לרקע ללא תווית1. פלטפורמות ספקטרומטריית מסות נפוצות אינן מסוגלות להבחין בין האות המגיע ממולקולות אנדוגניות2. ההצלחה של SIL דורשת שימוש בכלים אנליטיים ברזולוציה גבוהה במיוחד. כרומטוגרפיה נוזלית המצומדת לספקטרומטריית נייד....

Protocol

1. הכנת מדגם

  1. נתיחת חרקים
    1. לנתח שחלות יתוש Aedes aegypti כאשר הם בני 7 ימים בתמיסת מלח חוצצת פוספט באמצעות מיקרו-מחטים.
    2. לאסוף שמונה שחלות מתמיסת מלח חוצצת פוספט באמצעות מיקרו-מחטים ולאחסן בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל בטמפרטורה של -80°C.
    3. לאסוף שחלות בשכפולים ביו.......

Representative Results

תיוג האיזוטופ היציב מאפשר הדמיה של טריגליצרידים במחקרי דינמיקת שומנים של שחלות יתושים נקבות. בתחום הניידות הדו-ממדית, הטריגליצרידים 48:1 מוצגים באזור עם זמן שמירה ספציפי ביחס לניידות 1/K0. את עוצמת הטריגליצרידים ניתן לדמיין על ידי קו כחול כהה יותר. כתמים אחרים מייצגים טריגליצרידים נוס?.......

Discussion

בעת הערכת השימוש בפרוטוקול זה, חיוני לוודא שהפרמטרים DIA-PASEF ו- MS/MS ישימים לטריגליצרידים המדוברים. באופן ספציפי, חלונות ניידות רוחב החלון צריך לעקוב אחר דפוס של טריגליצרידים. ניתן לקבוע זאת באמצעות הפעלה קודמת בשיטת DDA. בעת מעקב אחר הטריגליצרידים בתקן הפנימי, החלונות להגדרת DIA צריכים לכסות את.......

Acknowledgements

המחברים אוהבים להכיר בתרומתו של ד"ר סזאר רמירז במהלך פיתוחי השיטה הראשוניים. מחקר זה מומן על ידי מענקי NIAID R21AI167849 FGN, פרויקט 22-21244S מקרן המדע הצ'כית, צ'כיה למינסוטה.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Accucore C30 columThermo Fisher Scientific27826-252130
Bruker Compass Data AnalysisBruker Daltonics Inc2363525870Version 5.2
d-Glucose-13C6Sigma-Aldrich 389374
eppendorf tubesFisher Scientific14-282-300
EquiSplash LipidomixAvanti Polar Lipids330731-1EA
glass vialsThermo Fisher Scientific11-417-236
heavy water (2H2O)Sigma-Aldrich 1.13366
polypropylene pestlesFisher ScientificBAF199230001
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatographShimadzuL20234651907
silanized glass insertsThermo Fisher Scientific03-251-826
Sucrose-13C12Sigma-Aldrich 605417
timsTOFBruker Daltonics Inc1.84443E+11
Tuning Mix Calibration StandardAgilent Technologies36

References

  1. Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).
  2. Tose, L. V., et al.

Explore More Articles

210

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved