Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Здесь представлен метод скрининга липидных структур с помощью мечения стабильными изотопами с использованием времени их удержания, подвижности и фрагментации.

Abstract

Липиды очень разнообразны, и небольшие изменения в структуре и составе липидов могут оказывать глубокое влияние на важнейшие биологические функции. Мечение стабильными изотопами (SIL) дает ряд преимуществ для изучения распределения, мобилизации и метаболизма липидов, а также синтеза липидов de novo . Для успешной реализации методики SIL необходимо устранить интерференции от эндогенных молекул. В настоящей работе мы описываем высокопроизводительный аналитический протокол для скрининга липидов SIL из биологических образцов; Будут показаны примеры идентификации липидов de novo во время развития яичников комаров. Использование комплементарной жидкостной хроматографии, спектрометрии подвижности захваченных ионов и масс-спектрометрии позволяет отделить и распределить липиды из одного образца за одно сканирование (<1 ч). Описанный подход использует преимущества последних разработок в области сбора, зависящего от данных, и сбора, независимого от данных, с использованием параллельного накопления в ловушке мобильности с последующей последовательной фрагментацией и диссоциацией, вызванной столкновением. Измерение SIL на уровне цепи жирных кислот выявляет изменения в динамике липидов во время развития яичников комаров. Структуры липидов de novo надежно присваиваются на основе времени их удержания, подвижности и характера фрагментации.

Introduction

При анализе липидных данных мечение стабильными изотопами (SIL) является эффективным методом оценки метаболических путей в живых организмах. В этом методе атомы внутри анализируемого вещества заменяются стабильными изотопами, содержащими 13C или 2H. Эти изотопы в дальнейшем включаются в предшественники, которые позже встраиваются в жирные кислоты, обозначая области, в которых они находятся. С помощью этих изотопов можно идентифицировать распределение и метаболизм липидов, так как они будут контрастировать на немаркированном фоне1. Обычные масс-спектрометрические платформы не способны различать сигнал, поступающий от эндоге....

Protocol

1. Подготовка образцов

  1. Вскрытие насекомых
    1. Препарируйте яичники комаров Aedes aegypti в возрасте 7 дней в буферизованном фосфатом солевом растворе с помощью микроигл.
    2. Соберите восемь яичников из фосфатно-солевого буферного раствора с помощью микроигл и храните в .......

Representative Results

Мечение стабильных изотопов облегчает визуализацию триглицеридов в исследованиях динамики липидов самок яичников комаров. В области 2D-подвижности триглицерид 48:1 отображается в области с определенным временем удержания по отношению к подвижности 1/K0. Интенсивность триглицерид?.......

Discussion

При оценке использования этого протокола важно убедиться, что параметры DIA-PASEF и MS/MS применимы к рассматриваемым триглицеридам. В частности, окна мобильности и ширина окон должны соответствовать схеме триглицеридов. Это можно определить с помощью предыдущего прогона с помощью метода DDA.......

Acknowledgements

Авторы хотели бы выразить признательность доктору Сезару Рамиресу за его вклад в разработку метода. Это исследование финансировалось грантами NIAID R21AI167849 FGN, проект 22-21244S от Чешского научного фонда, Чешская Республика до Миннесоты.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Accucore C30 columThermo Fisher Scientific27826-252130
Bruker Compass Data AnalysisBruker Daltonics Inc2363525870Version 5.2
d-Glucose-13C6Sigma-Aldrich 389374
eppendorf tubesFisher Scientific14-282-300
EquiSplash LipidomixAvanti Polar Lipids330731-1EA
glass vialsThermo Fisher Scientific11-417-236
heavy water (2H2O)Sigma-Aldrich 1.13366
polypropylene pestlesFisher ScientificBAF199230001
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatographShimadzuL20234651907
silanized glass insertsThermo Fisher Scientific03-251-826
Sucrose-13C12Sigma-Aldrich 605417
timsTOFBruker Daltonics Inc1.84443E+11
Tuning Mix Calibration StandardAgilent Technologies36

References

  1. Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).
  2. Tose, L. V., et al.

Explore More Articles

210

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved