Axenic Delia antiqua'nın Yarı Fermente Steril Diyetlerle Yetiştirilmesi

Özet

Yarı fermente steril diyetlerle axenic Delia antiqua yetiştirmek için basit bir prosedür tarif edilmiştir. PCR kullanılarak her bir aksenik D. antiqua instarında sadece bir Wolbachia suşu tespit edildi.

Özet

Aksenik böcekler, steril ortam kullanılarak steril yapay yetiştirme sistemlerinden elde edilir. Küçük boyutları, kısa büyüme döngüleri ve düşük yem gereksinimleri ile karakterize edilen bu böcekler, mikroorganizmalar ve konakçılar arasındaki ilişkiyi incelemek için idealdir. Bağırsak mikrobiyotası, böcek konakçılarının fizyolojik özelliklerini önemli ölçüde etkiler ve aksenik böceklere spesifik suşların sokulması, bağırsak mikrobiyal fonksiyonlarını doğrulamak için bir yöntem sağlar. Diptera, Anthomyiidae familyası ve Delia cinsinde tehdit edici bir haşere olan Delia antiqua, öncelikle soğan, sarımsak, pırasa ve Liliaceae familyasının diğer sebzeleriyle beslenir. Larvaları ampullerle beslenerek tüm bitkilerin çürümesine, solmasına ve hatta ölümüne neden olur. Aksenik larvaları yetiştirerek, bağırsak mikroflorasının D. antiqua'nın büyümesi ve gelişmesi üzerindeki etkilerini gözlemlemek için takip çalışmaları yapılabilir. İlişkili mikropların antibiyotik eliminasyonunu içeren yöntemden farklı olarak, bu makale aksenik D. antiqua'nın yükseltilmesi için düşük maliyetli ve yüksek verimli bir yaklaşım sunmaktadır. D. antiqua yumurtalarının yüzey sterilizasyonundan sonra, larvaları yetiştirmek için yarı fermente steril diyetler kullanıldı ve D. antiqua'nın aksenik durumu, kültüre bağımlı ve kültürden bağımsız deneylerle doğrulandı. Sonuç olarak, böcek yumurtası sterilizasyonu ve larva kültürü için steril diyetlerin hazırlanmasının kombinasyonu, aksenik D. antiqua elde etmek için etkili ve basit bir yöntemin geliştirilmesini sağlamıştır. Bu yöntem, böcek-mikroflora etkileşimlerini incelemek için güçlü bir yaklaşım sağlar.

Giriş

Canlı mikroorganizma veya parazitlerin tespit edilemediği hayvanlar olarak tanımlanan aksenik hayvanlar, konakçı-mikroorganizma etkileşimlerini incelemek için değerli deneysel modellerdir ^1,2. En büyük omurgasız grubu olan böcekler, mikroorganizmalarla simbiyotik ilişkiler kurabilir³. Aksenik böcekler, simbiyotik sistemlerde konakçı-simbiyont etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir⁴. Örneğin, Nishide ve ^ark.5, kötü kokulu solucan Plautia stali için pratik bir steril yetiştirme prosedürü oluşturarak, model simbiyotik sistemlerde konakçı-simbiyont etkileşimlerinin güvenilir ve titiz bir şekilde analiz edilmesini sağlamıştır. Aksenik böcekler, yumurta aşamasını sterilize ederek ve larvalara ve yetişkinlere steril gıda sağlayarak üretilebilir ^6,7. Aksenik böcekler büyük önem taşır ve biyolojik araştırmalarda yaygın olarak kullanılır. Örneğin, Somerville ve ^ark.8 tarafından yapılan bir araştırma, Enterobacter cloacae ile aşılanmış elmas sırtlı güvelerin transgenik erkeklerin adaptasyonunu geliştirdiğini göstermiştir.

Delia antiqua Meigen, dünya çapında soğan ve diğer Liliaceae mahsullerinin ekonomik açıdan önemli bir zararlısıdır ve larvaları soğan ve diğer Liliaceae mahsullerinin soğanlarına zarar verir⁹. D. antiqua esas olarak ılıman iklimlerde bulunur ve Amerika, Avrupa ve Asya'nın soğan yetiştirme alanlarında yaygındır. Uygun şekilde kontrol edilmezse soğan (Allium cepa L.), sarımsak (Allium sativum L.), arpacık soğanı (Allium fistulosum L.) ve pırasada (Alliumchoenoprasum L.) %50 ile %100 arasında değişen ürün kayıplarına neden ^{olabilir10,11}. Larvalar bitkilerin toprak altı kısımlarında beslenir ve bu beslenme fidelerin solmasına ve sonunda ölmesine neden olur. Ek olarak, hasarlı bitkiler patojenlerin girmesine izin vererek ampul çürümesine^{neden olabilir 12}. Bitkiler larvalar tarafından tamamen tüketilmese bile verdikleri zararlar soğan bitkilerini pazarlanamaz hale getirmekte ve ekonomik kayıplara neden olmaktadır.

Böcekler bağırsak mikrobiyotası ile yakından ilişkilidir ve çoğu böcek bağırsağı, konakçı tarafından sağlanan besinlerle gelişen çeşitli simbiyotik bakteriler içerir^13,14. Jing ve ^ark.15, bağırsak simbiyotik topluluğunun birincil işlevinin temel besinleri sağlamak olduğunu, ardından sindirim ve detoksifikasyon ile ilgili işlevlerin geldiğini göstermiştir. Bazı durumlarda, bağırsak bakterileri haşere yönetimi amacıyla mikrobiyal bir kaynak görevi görebilir. Sonuç olarak, bireysel bağırsak bakterilerinin performanslarını ve D. antiqua'nın vücudundaki spesifik işlevlerini incelemek arzu edilir. Bu nedenle, aksenik larvaların hazırlanması, spesifik bakteri suşları ve böcekler arasındaki etkileşimleri incelemek için özellikle önemlidir¹⁶. Şu anda, böcek bağırsak bakterilerini ortadan kaldırmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntem, ilişkili mikropları yok etmek için bir antibiyotik kombinasyonunun kullanılmasıdır 17,18,19. Sadece mikrobiyal sayıları azaltabilen tek başına antibiyotik kullanmanın aksine, böceklerin aksenik yetiştirilmesi, mikroorganizmaların bileşimi ve miktarı üzerinde kontrol sağlayarak bağırsak mikrobiyota işlevselliğinin daha doğru bir şekilde doğrulanmasını sağlar.

Bu nedenle, bu makale axenic D. antiqua'nın hazırlanması ve yetiştirilmesi için bir protokol sunmaktadır. Aksenik larva yemi, yarı fermente gıdalarla birlikte doğal diyetlerin yüksek sıcaklıkta sterilizasyonu kullanılarak elde edilir. Yumurtalar, aksenik yumurtalar elde etmek için deneysel bir protokol izlenerek sterilize edilir ve son olarak, aksenik larvalar aksenik yumurtalardan kültürlenir. Aksenik yetiştirme sistemi, deney için sadece bir nesil boyunca gerçekleştirildi. Bu, böcekler ve bağırsak mikrobiyotası arasındaki etkileşimi incelemek için kolaylık sağlayacaktır.

Protokol

D. antiqua , Fanzhen, Taian sahasından elde edilir.

1. Steril diyetlerin hazırlanması

1. Yeşil soğanların dış katmanlarını soyun ve yeşil yaprakları atın. Yeşil soğanların beyaz kısmını saklayın (Şekil 1A) ve steril suyla yıkayın, durulama işlemini üç kez tekrarlayın. Yeşil soğanların beyaz kısmını, daha sonra kullanmak üzere %75 EtOH çözeltisi (adım 2.5'te bahsedilmiştir) ile sterilize edilmiş makas ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak 1-2 cm'lik doğranmış parçalar halinde kesin.
2. 50 gr doğranmış yeşil soğanı tartın ve bir mutfak robotuna koyun (Malzeme Tablosuna bakın). 50 mL sterilize su ekleyin ve her biri 2 dakika boyunca beş kez öğütün. Doğranmış yeşil soğanların tamamı macun kıvamına gelene kadar topraklanmalıdır (Şekil 2A).
3. D. antiqua'nın 10 adet 3^{. instar} larvasını 10 mL 1x PBS içeren 10 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarmak için cımbız kullanın ve bir larva öğütme sıvısı elde etmek için bunları tek kullanımlık bir öğütme tokmağı (Malzeme Tablosuna bakınız) ile yaklaşık 5 dakika öğütün.
4. Macun kıvamındaki yeşil soğan sıvısını ve larva öğütme sıvısını 500 mL'lik temiz bir erlene dökün (Malzeme Tablosuna bakın). Erlen ağzını iki kat şeffaf sızdırmazlık filmi ile sarın ve ardından şişeyi 25 °C'de ve 180 rpm'de 12 saat fermantasyon için çalkalayan bir inkübatöre (Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin (Şekil 2B).
5. Makasla 10 cm kenarlı (steriliteye gerek yok) yedi kat kare gazlı bez kesin ve basit bir filtre cihazı oluşturmak için bunları bir araya getirin. Fermente yeşil soğan sıvısını yavaşça gazlı bezin üzerine dökün ve filtrelenmiş sıvıyı 500 mL'lik yeni bir erlene sıkın. Kalan yeşil soğan kalıntısını daha sonra kullanmak üzere kalay folyoya gazlı bez üzerine sarın.
6. Bir vakum pompası (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bir Buchner hunisi kullanarak önceki adımda elde edilen süzüntüyü süzün. Deiyonize su ile ıslatılmış filtre kağıdını Buchner hunisine koyun ve ardından süzüntüyü dökün ve farklı filtre kağıdı ile üç kez emme filtrasyonu gerçekleştirin. Son süzüntüyü 500 mL'lik erlende toplayın.
7. 0,22 μM'lik bir filtre şişesi ve bir vakum pompası kullanarak başka bir filtreleme gerçekleştirin. Daha fazla kullanım için emme filtresi şişesinin kapağını ultra temiz bir tezgaha vidalayın (Malzeme Tablosuna bakın). Bu noktada fermente yeşil soğan kalıntısı ve süzüntü elde edilir (Şekil 2C).
   NOT: Bu adımdan elde edilen filtrelenmiş sıvı steril olacaktır. (0.22 μM filtre şişesi, filtratı sterilize etmek için steril bir vakumlu filtrasyon sistemidir).
8. Fermente edilmemiş yeşil soğan kalıntısı elde etmek ve süzmek için önceki adımları tekrarlayın. Buradaki fark, fermantasyona gerek olmamasıdır.
9. 10 mL'lik bir santrifüj tüpünde 0.24 g kolin klorür ve 0.56 g L-askorbik asidi ( Malzeme Tablosuna bakınız) tartın. 3 mL deiyonize su ekleyin ve tamamen eriyene kadar kuvvetlice çalkalayın. Ultra temiz tezgahta, yeni bir 5 mL şırınga kullanın ve çözeltiyi sterilize etmek için üç adet 0.22 μM şırınga filtresi takın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve daha sonra kullanmak üzere steril bir 10 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.
   NOT: Kolin klorür, böceklerin büyümesi için gerekli bir nörotransmiterdir, L-askorbik asit ise koruyucu görevi görür.
10. 2 g agar tozu ve 6 g TSB'yi tartın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bunları 500 mL'lik bir erlene dökün. Daha sonra kültür ortamını hazırlamak için 100 mL deiyonize su ekleyin. Cam çubuğu deiyonize suyla duruladıktan sonra, karışımı iyice karışana kadar karıştırmak için kullanın. Ardından, iki kat şeffaf sızdırmazlık filmi kullanarak erleni kapatın.
11. Fermente edilmiş yeşil soğanları ve fermente edilmemiş yeşil soğanları (adım 1.5 ve adım 1.8'de bahsedilmiştir) alüminyum folyoya sarın ve kültür ortamıyla birlikte 121 °C'de 20 dakika boyunca bir otoklavda sterilize edin.
12. Ultra temiz tezgahta, sterilize edilmiş kolin klorür, L-askorbik asit ve steril süzüntüyü iyice karıştırmak için hafifçe döndürerek kültür ortamına dökün. Son olarak, fermente edilmiş ve fermente edilmemiş yeşil soğanları ekleyin ve steril diyetleri elde etmek için elle kuvvetlice çalkalayın. Diyetleri 50 mL'lik santrifüj tüplerine (steril; 0.22 μM PVDF hidrofobik membranlı havalandırma kapağı) dökün (Malzeme Tablosuna bakın) bir açıyla (Şekil 2D).
    NOT: Sterilizasyondan sonra, yeşil soğan veya diğer bileşenler eklenirken hızlı soğumayı ve katılaşmayı önlemek için kültür ortamının sıcaklığı 65-80 °C arasında tutulmalıdır. Ayrıca, her tüpe yaklaşık 10-15 mL diyet dökün. Diyetler katılaştıktan sonra, hemen kullanılmayacaksa tüpleri buzdolabında 4 °C'de saklayın.

2. Aksenik yumurtaların toplanması

1. D. antiqua için laboratuvar yetiştirme sistemi
   1. 25 °C'lik dahili LED aydınlatmalı bir kuluçka makinesine (24 saat döngü, aydınlığın karanlığa oranı 16:8'dir) bir yetiştirme kafesi yerleştirerek erkek ve dişi yetişkinlerin çiftleşmelerini ve yumurtlamalarını sağlayın. Su sebilini (Şekil 1B) suyla doldurun ve yetişkinlere su sağlamak için nemli pamuk yünü ile kapatın.
   2. 94 mm x 16 mm'lik bir Petri kabı kapağına dört adet 35 mm x 12 mm Petri kabı tabanı yerleştirin. Pamuk yününü iyonize suyla ıslatın ve ardından Petri kabının iki dibine nemli pamuk yünü yerleştirin ve pamuk yününün üzerine bir çorba kaşığı sakaroz ekleyin.
   3. Diğer iki Petri kabının tabanını, yetişkin böcekler için besin görevi gören iki yemek kaşığı sakaroz ve maya özü ile doldurun (bkz. Malzeme Tablosu).
      NOT: Adım 2.1.2 ve adım 2.1.3'te bahsedilen sükroz ve maya ekstraktının sterilize edilmesine gerek yoktur.
   4. Yumurtaları toplamak için sinek kafesinin içine nemli kum ve bir parça köksüz, soyulmuş sarımsak (Şekil 1D) içeren 94 mm x 16 mm'lik bir Petri kabı tabanı koyun. Dişi, sarımsak kokusundan etkilenecek ve etrafına yumurta bırakacaktır.
2. Yumurtaların toplanması
   1. Yukarıda bahsedilen kum ve sarımsak içeren 94 mm x 16 mm petri kabı olan yumurtlama cihazını (adım 2.14) kafesten çıkarın. Kumu sarımsakla birlikte 500 mL'lik bir behere dökün ve kalan yumurtaları sarımsaktan behere akıtmak için musluk suyu kullanın. Bu noktada, yumurtalar suda yüzüyor.
   2. 100 gözenekli bir elek alın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve musluk suyuyla nemlendirin. Daha sonra beherden yüzen yumurtaları içeren suyu elek üzerine dökün. Yumurtalar elek üzerinde kalacaktır.
   3. Yumurtalar elek üzerinde doğal olarak kuruduktan sonra, yumurtaları bir Petri kabına nazikçe süpürmek için bir fırça kullanın.
3. İlk gün, yumurtaları dezenfeksiyon veya sterilizasyon olmadan toplamak için yumurtlama cihazını yıkayın. İkinci gün öğleden sonra saat dörtte yumurtaları tekrar yıkayın ve temiz suyla eleyerek toplayın.
   NOT: Yumurtaların ikinci günde toplanması, sonraki aşamalarda tutarlı bir büyüme hızı sağlamak içindir. Öğleden sonra saat dört, D. antiqua için yumurtlama zirvesidir. Bu nedenle, bu zamanda yumurtaları toplamak idealdir.
4. Toplanan yumurtaları ultra temiz tezgahta steril bir hücre eleceğine (Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin (Şekil 3A).
5. Çözeltiyi yumurta sterilizasyonu için hazırlayın
   1. 5 mL% 5.2 NaClO alın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve sterilize edilmiş 250 mL konik bir şişeye aktarın. Toplam hacmi 100 mL yapmak için 95 mL sterilize su ekleyin, bu da %0.26 NaClO çözeltisi elde edilmesini sağlar.
   2. % 75 EtOH çözeltisi hazırlamak için,% 99.7 EtOH'nin 75 mL'sini alın ve sterilize edilmiş 250 mL'lik bir erlene aktarın. Toplam hacmi 100 mL yapmak için 25 mL sterilize su ekleyin,% 75 EtOH çözeltisi elde edilir.
6. Bir Petri kabına 30 mL NaClO dökün ve başka bir Petri kabına 30 mL EtOH dökün. Adım 2.4'te bahsedilen yumurtaları içeren hücre süzgecini NaClO içeren kabın içine yerleştirin. % 0.26 NaClO çözeltisinde 0.5 dakika bekletin. Daha sonra eleği EtOH içeren kaba aktarın ve% 75 EtOH çözeltisinde 0,5 dakika daha bekletin.
7. Bu işlemi her 0,5 dakikada bir% 0.26 NaClO ve% 75 EtOH arasında dönüşümlü olarak üç kez tekrarlayın. Bundan sonra, aksenik yumurtalar elde edilecektir. Bu noktada, yumurtaları içeren elek EtOH'ye batırılmalıdır.
   NOT: Tam sterilizasyon sağlamak için, NaClO ve EtOH'yi aspire etmek ve yumurtaları dağıtmak için 1 mL'lik bir pipet kullanın. Durulama işlemini birkaç kez tekrarlayın. Bu adım, yumurtaların yüzeyini artık bakteri ve yabancı maddelerden daha fazla temizleyerek temiz ve steril bir yüzey sağlayacaktır.

3. Aksenik larvaların yetiştirilmesi

1. Sterilize edilmiş yumurtaları aktarmak için, 1 mL'lik bir pipetin uç ucunu kesmek için alkol lambası ile sterilize edilmiş bir makas kullanın (Şekil 3B). Kesilen pipetin uç açıklığının yumurtaların çapından (yaklaşık 2 mm) daha büyük olduğundan emin olun. Daha sonra, yumurtaları EtOH çözeltisinden (çözelti ile birlikte yumurtalar) (Şekil 3C) steril diyetleri içeren bir santrifüj tüpüne aktarmak için pipeti kullanın ve her tüp yaklaşık 20-50 yumurta içermelidir (Şekil 3D). Tüm yumurtalar transfer edilene kadar bu işlemi tekrarlayın.
   NOT: Aktarım sırasında yumurtaların kırılmasını önlemek için pipet ucunun çapı mümkün olduğunca büyük olmalıdır, bu da ölümlerine yol açabilir.
2. Tüpteki fazla etanolü çıkarmak için bir pipet kullanın. Santrifüj tüpünü kendinden sızdırmaz bir torbanın içine kapaklarla kapalı olarak yerleştirin ve hava sirkülasyonu sağlamak için torbanın ağzına bir parça pamuk yerleştirin. Son olarak, gözlem ve uygulama için torbayı 25 °C'lik bir inkübatörün içine yerleştirin (bağıl nem: %50-%70; fotoperiyot: 16 saat aydınlık: 8 saat karanlık).
3. Yaklaşık üç gün sonra, diyetlerdeki aksenik yumurtalar çatlamaya başlar (Şekil 4A). Yumurtadan çıkan larvalar aktif olacak ve steril diyetlerin yüzeyi artık pürüzsüz olmayacaktır. Larvalar diyetlerle beslenmeye başlayacaktır.
4. Larvaları 2^{. instar} larvaları aşamasına ulaşana kadar gözlemlemeye devam edin. Bu dönemde büyüme ve gelişmelerini izlemeye devam edin.
5. 9-12 gün sonra yumurtaların %80'inden fazlası 3^{. instar} larvaya dönüşmüştür (Şekil 4B). Bu, larvaların başarılı bir şekilde büyümesini ve gelişmesini gösterir.

4. Aksenik larvaların kültüre bağlı tahlillerle doğrulanması

1. Santrifüj tüpünden rastgele üç aksenik 3^{. instar} larvası seçin.
2. Larvaları temizlik için% 75 alkol içeren 94 mm x 16 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Bundan sonra, daha fazla durulama için steril su içeren bir kaba aktarın.
3. Larvaları kavramak için% 75 EtOH çözeltisi ile sterilize edilmiş dezenfekte edilmiş bir diseksiyon forseps kullanın (baş ve kuyruk Şekil 5A'da gösterilmiştir). Baş ve kuyruk uçlarını çıkarmak için diseksiyon makası kullanın (Şekil 5B). Larvaların kuyruğunu forseps ile tutun ve kuyruktan başa hafifçe sıkmak ve iç organları çıkarmak için başka bir forseps kullanın ( Şekil 5C'de gösterilen sonuç). İç organları deiyonize suya yerleştirin ve forseps ile yağ dokusuna bastırarak bağırsağı nazikçe çekin ve çıkarılan iç organı (Şekil 5D) daha fazla kullanım için steril suya koyun.
4. Bağırsağı steril bir 1.5 mL santrifüj tüpüne yerleştirin, 500 μL sterilize edilmiş 1x PBS tamponu ekleyin ve bağırsak dokusunu homojen bir şekilde öğütmek için tek kullanımlık bir havaneli kullanın.
5. 100 μL homojenat alın ve besleyici bir agar ortamına ekleyin. Agar plakasını çizmek için L şeklinde bir yayıcı kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın).
6. Petri kabını 28 °C'de biyokimyasal bir inkübatöre yerleştirin ve kolonilerin büyümesini gözlemlemek için 72 saat inkübe edin.

5. Aksenik larvaların kültürden bağımsız deneylerle doğrulanması

1. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir DNA ekstraksiyon kiti (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak aksenik larvaların bağırsak dokusundan toplam DNA'yı çıkarın.
2. Bir UV spektrofotometresi kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün.
3. Evrensel bakteriyel 16S rRNA primerleri (1492R: 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3', 27F: 5'- AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3') kullanarak PCR reaksiyonu gerçekleştirin. Toplam reaksiyon hacmi 25 μL'dir ve 1 μL DNA şablonu, 0.5 μL ileri primer, 0.5 μL ters primer, 10.5 μL_ddH2Ove 12.5 μL 2x Taq PCR Master Mix'ten oluşur (bkz. PCR reaksiyon koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: 94 °C'de 3 dakika boyunca ilk denatürasyon; 30 sn boyunca 94 ° C'de 35 döngü denatürasyon, 30 s boyunca 55 ° C'de tavlama ve 90 s boyunca 72 ° C'de uzatma; 72 °C'de 10 dakika son uzatma. Daha fazla analiz için PCR ürünlerini 4 °C'de saklayın.
4. Evrensel mantar ITS primerleri (ITS1: 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3', ITS4: 5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3') kullanarak PCR reaksiyonu gerçekleştirin. Toplam reaksiyon hacmi 25 μL'dir ve 1 μL DNA şablonu, 0.5 μL ileri primer, 0.5 μL ters primer, 10.5 μL_ddH2Ove 12.5 μL 2x Taq PCR Master Mix'ten oluşur. PCR koşullarını 5 dakika boyunca 95 °C'ye ayarlayın; 30 saniye boyunca 95 °C, 1 dakika boyunca 55 °C ve 90 saniye boyunca 72 °C 35 döngü; ardından 10 dakika boyunca 72 °C. Daha fazla analiz için PCR ürünlerini 4 °C'de saklayın.
5. İki tip PCR ürününün her biriyle eşit şekilde karıştırmak için Süper Yeşil nükleik asit boyası kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve bunları 1x TAE tamponunda (50x TAE'den seyreltilmiş) %1'lik bir agaroz jel üzerinde elektroforez ile analiz edin. Referans olarak 3 μL DNA işaretleyici kullanın (Malzeme Tablosuna bakın).
6. Jeli gözlemlemek ve hedef parçayı bulmak için bir UV transillighter kullanın.

Sonuçlar

D. antiqua'nın yaşam evreleri Şekil 4'te gösterilmiştir. Tüm yaşam döngüsü yumurtalar, larvalar, pupa (Şekil 4C) ve yetişkinlerden (Şekil 4D) oluşur. Steril santrifüj tüplerinde yetiştirilirler ve görünümleri ve hayatta kalma oranları, aksenik olmayan koşullar altında yetiştirilen D. antiqua'dan ayırt edilemez. D. antiqua'nın her aşaması için büyüme ve gelişme süreleri

Tartışmalar

Böcekler oldukça karmaşık bir bağırsak mikrobiyotasına^20,21 sahiptir ve böcek-mikroorganizma etkileşimlerini incelemek için spesifik bağırsak mikrobiyal suşları ile aşılanmış aksenik böceklerin kullanılmasını gerektirir. Aksenik böceklerin hazırlanması bu tür araştırma çabaları için çok önemlidir. Antibiyotik tedavisi, bağırsak mikrobiyotasını ortadan kaldırmak için kullanılan bir yöntemdir. Örneğin, Jung ve Kim

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μM filter bottle	Thermo Scientific	450-0045
0.22 μM Syringe Filter	Biosharp	BS-QT-011
100-mesh sieve	Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory	No Catalog numbers
1x PBS solution	Solarbio	P1020
2x Taq PCR Master Mix	GENVIEW	GR1113-1ML
5.2% NaClO solution	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	80010428
500 mL Conical flask	Thermo Scientific	4103-0500
50 mL vented centrifuge tube	JET BIOFIL	BRT-011-050
50x TAE buffer	GENVIEW	GT1307
Agar powder	Ding Guo	DH010-1.1
Biochemical incubator	STIK	21040121500010
Cell sieve	SAINING	5022200
Choline chloride	Sangon Biotech	A600299-0100
ddH2O	Ding Guo	PER018-2
Disposable grinding pestle	JET BIOFIL	CSP-003-002
DNA extraction kit	Sangon Biotech	B518221-0050
DNA Marker	Sangon Biotech	B600335-0250
Ethanol absolute	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218
Filter paper	NEWSTAR	1087309025
Food processor	Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd.	WBL25B26
Illuminated  incubator	Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd.	A16110768
L-Ascorbic acid	Sangon Biotech	A610021-0100
L-shaped spreader	SAINING	6040000
Nutrient agar medium	Hope Bio	HB0109
Scissors	Bing Yu	BY-103	Purchase on Jingdong
Shock incubator	Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd.	2020000014
Sucrose	GENVIEW	CS326-500G
Super Green nucleic acid dye	Biosharp	BS355A
Super-clean table	Heal Force	AC130052
TSB	Hope Bio	HB4114
Vacuum pump	Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd.	22051031
Yeast extract	Thermo Scientific	LP0021B