JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Protokol
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. 3 Bölüm 2

Özet

Aile

Protokol

Bölüm 1: RNA cDNA sentezi

  1. Ambion Amino Allyl MessageAmp II kiti kullanmadan önce, yıkama tamponlar Önerilen miktar,% 100 etanol ekleyin.
  2. PCR reaksiyonu tüp, T7 oligo (dT) astar toplam RNA ve 1μl 5μg 100ng arasında ekleyin. Nükleaz içermeyen su ile 12μl hacim kazandırın.
  3. 70 numune inkübe ° C bir termalcycler 10 dk.
  4. 70 ° C ve santrifüj kısaca RNA örnekleri çıkarın. Buz üzerine yerleştirin.
  5. 1. Strand Sentez ana karışımı hazırlayın ve oda sıcaklığında tutmak (% 10 hata pipetleme tutarı düşmek) (Tablo 1)
  6. Pipet Master Mix veya fiske yavaşça karıştırmak ve ardından kısa bir süre santrifüj.
  7. Her RNA örnek Master Mix 8μl aktarın. 3-4 kez yukarı aşağı pipetleme karıştırın.
  8. PCR 2 saat için 42 ° C'de inkübe edin.
  9. Santrifüj örnekleri kısaca yer ve buz üzerinde. Hemen dsDNA sentez sonraki adıma geçin.
  10. Buz üzerinde 2. Strand Sentez master miks (% 10 hata pipetleme tutarı düşmek) (Tablo 2) hazırlayın
  11. Pipet Master Mix veya fiske yavaşça karıştırmak ve ardından kısa bir süre santrifüj.
  12. Her bir örnek 80μl aktarın ve hafifçe aşağı yukarı 3-4 kez pipetleme karıştırın.
  13. PCR 2 saat 16 ° C'de inkübe edin.
  14. 2 saat inkübasyondan sonra, cDNA temiz-up adım ile devam ya da -20 ° C'de hemen dondurmak

Bölüm 2: Çift zincirli cDNA clean-up

  1. CDNA Saf buzdolabından çıkarın ve kullanmadan önce 30 dakika boyunca oda sıcaklığında gelmesini sağlar. Tam olarak kullanmadan önce, manyetik cDNA bağlayıcı boncuklar tekrar süspansiyon için şişeyi iyice çalkalayınız.
  2. 1.5mL tüp ve inkübe 50-60 ° C önceki 2saat inkübasyon sırasında en az 10 dakika içine kısım nükleaz içermeyen su.
  3. Her bir numune için cDNA Saf 180μl ekleyin ve iyice yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. 96-iyi yuvarlak alt plaka örnekleri aktarın.
  4. Orbital çalkalayıcı plaka en az 2 dakika boyunca hafifçe sallayarak örneklerini karıştırmak için devam edin.
  5. Manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşıyın. Yaklaşık 6 dakika boyunca stand plaka bırakın veya karışımı şeffaf hale gelir ve bağlayıcı boncuklar pelet kadar.
  6. Manyetik boncuk rahatsız etmeden dikkatlice bir vakum aspiratör ile süpernatant aspire. Alternatif olarak, bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatant kaldırmak ve supernatant atın.
  7. Manyetik stand plaka çıkarın.
  8. Her iyi 150μl cDNA Yıkama Tampon ekleyin ve 1 dakika boyunca orta hızda orbital çalkalayıcı plaka sallamak. Boncuk yıkama tamponu düşük yüzey gerilimi nedeniyle, bu aşamada dağıtmak ETMEYECEKTIR.
  9. Manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşıyın.
  10. Manyetik boncuk rahatsız etmeden dikkatlice bir vakum aspiratör ile süpernatant aspire. Alternatif olarak, bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatant kaldırmak ve supernatant atın.
  11. Manyetik stand plaka çıkarın.
  12. Yıkama 150μl cDNA Yıkama Tampon ile 2. kez tekrarlayın.
  13. 2. yıkamadan sonra, maksimum hızda 2 dakika orbital çalkalayıcı plaka sallayarak boncuk kurulayın. Overdry değil!
  14. 18μl her numune için, önceden ısıtılmış nükleaz ücretsiz su ekleyerek boncuk cDNA elute.
  15. Orbital çalkalayıcı 3 dakika plaka şiddetle titremesi, daha sonra manyetik boncuklar tamamen dağılmış olduğundan emin olmak için kontrol edin. Aksi takdirde, sarsmaya devam ediyor.
  16. Manyetik boncuklar tamamen dağınık sonra, manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşımak.
  17. Dikkatlice yıkandı, cDNA (~ 16μl) yeni bir PCR plaka (ya da PCR tüpleri) aktarmak.
  18. Doğrudan bir sonraki adıma geçin, ya da -20 ° C'de cDNA dondurmak

Bölüm 3: in vitro Transkripsiyon (IVT)

  1. IVT ana karışımı oda sıcaklığında (Tablo 3) hazırlayın
  2. Master Mix veya karıştırmak için fiske yavaşça pipet, ve kısaca santrifüj.
  3. Her bir örnek 24μl ekleyin ve hafifçe aşağı yukarı 3-4 kez pipetleme karıştırın.
  4. Bir termalcycler 14 saat için 37 ° C'de inkübe, daha sonra bir sonraki adıma ° C kadar hazır 4 tutun.

Bölüm 4: Arna clean-up IVT sonra

  1. Vortex RNA bağlayıcı boncuk kısaca kullanmadan önce düzgün bir karışım elde etmek için.
  2. Oda sıcaklığında Arna Cilt Mix hazırlayın (Tablo 4) Bu vaktinden önce yapılabilir. Hazırlanan bağlayıcı karışım, oda sıcaklığında bir haftaya kadar saklanabilir .
  3. Vorteks ile iyice karıştırın.
  4. 1.5mL tüp ve en az 10 dakika boyunca 50-60 ° C'de inkübe içine kısım Arna Elüsyon Tampon.
  5. Arna bağlayıcı karışımı 70μl ekleyinher bir örnek ve aşağı yukarı 3-4 kez pipetleme iyice karıştırın.
  6. PCR plaka 96-iyi yuvarlak alt plaka örnekleri aktarın.
  7. Her numune için% 100 izopropanol 50μl 3-4 kez yukarı aşağı pipetleme ekleyin ve iyice karıştırın.
  8. Yavaşça örnekleri iyice karıştırmak için en az 2 dakika süreyle orbital çalkalayıcı plaka sallayın.
  9. Manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşıyın. Karışımı şeffaf hale gelir ve bağlayıcı boncuklar pelet kadar stand plaka bırakın.
  10. Manyetik boncuk rahatsız etmeden dikkatlice bir vakum aspiratör ile süpernatant aspire. Alternatif olarak, bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatant kaldırmak ve supernatant atın.
  11. Manyetik stand plaka çıkarın.
  12. Her iyi 100μl Arna Yıkama Çözeltisi ekleyin ve 1 dakika boyunca orta hızda orbital çalkalayıcı plaka sallamak. Boncuk tam bu aşamada dağıtmayın.
  13. Manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşıyın.
  14. Manyetik boncuk rahatsız etmeden dikkatlice bir vakum aspiratör ile süpernatant aspire. Alternatif olarak, bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatant kaldırmak ve supernatant atın.
  15. Manyetik stand plaka çıkarın.
  16. Yıkama 100μl Arna Yıkama Çözümü ile 2. kez tekrarlayın.
  17. 2. yıkamadan sonra, maksimum hızda 1 dakika orbital çalkalayıcı plaka sallayarak boncuk kurulayın. Örnekleri overdry etmeyin!
  18. Her numune için 40μl önceden ısıtılmış Arna Elüsyon Tampon ekleyerek boncuk Arna Zehir.
  19. 3 dakika orbital çalkalayıcı plaka şiddetle titremesi, daha sonra manyetik boncuklar tamamen dağılmış olduğundan emin olmak için kontrol edin. Aksi takdirde, sarsmaya devam ediyor.
  20. Manyetik boncuklar tamamen dağınık sonra, manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşımak. Süpernatant temizlenmiş amino alil dahil Arna içerir.
  21. Yeni bir PCR plaka (ya da PCR tüpleri) dikkatlice yıkandı, Arna aktarın.
  22. (Opsiyonel adım) NanoDrop spektrofotometre 1.5μl ölçerek örneklerinin RNA konsantrasyonu kontrol edin.
  23. Hemen bir sonraki adıma üzerine devam eder, ya da -80 Arna saklamak ° C

Tablo 1: cDNA 1. Strand Sentez Master Mix

Reaktif 1 reaksiyon için Tutarı
10X İlk Strand Tampon 2 ul
dNTP Mix 4 ul
Ribonükleaz İnhibitörü 1 ul
Dizi Komut 1 ul

Tablo 2: cDNA 2. Strand Sentez Master Mix

Reaktif 1 reaksiyon için Tutarı
Nükleazlar ücretsiz su 63 ul
10X İkinci Strand Tampon 10 ul
dNTP Mix 4 ul
DNA Polimeraz 2 ul
RNaz H 1 ul

Tablo 3: IVT Master Mix

Reaktif 1 reaksiyon için Tutarı
aaUTP çözümü (75 mM) 2 ul
CTP, ATP, GTP mix (25 mM) 12 ul
T7 UTP çözümü (75 mM) 2 ul
T7 10X Reaksiyon Tamponu 4 ul
T7 Enzim Mix 4 ul

Tablo 4: Arna Bağlama Mix

Reaktif 1 reaksiyon için Tutarı
RNA Cilt Boncuk * 10 ul
Boncuk Tekrar Süspansiyonu Çözüm * 4 ul
% 100 izopropanol ** 6 ul
Arna Cilt Tampon Konsantre 50 ul

* İlk RNA bağlayıcı boncuk boncuk tabanda çözümü ile karıştırın.
** Izopropanol Arna bağlayıcı tampon konsantre eklemeden önce ekleyin ve iyice karıştırın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Kritik Adımlar

Dizi veri önyargıları gözlenmiştir olarak ikinci bir tur amplifikasyon tavsiye edilmez. (1. ve 2. iplikçik cDNA sentezi, IVT) enzimatik her adım dikkatle Karıştırma her enzimatik adım inkübasyon uygun sıcaklık, iyi amplifikasyon verimi elde etmek için kritik öneme sahiptir. IVT sırasında 2-3 derece bir hava hibridizasyon fırın veya su banyosu hibridizasyon gibi küçük amplifiye ürün verimi önemli ölçüde etkileyebilir bile sapmal...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

Whitehead Enstitüsü'nden Fellows Fonları

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kitReagentApplied BiosystemsAM1753For 20 reactions
Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kitReagentApplied BiosystemsAM1821For 100 reactions, in a 96-well format
NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometerOtherNanoDropND-1000Or equivalent spectrophotometer

Referanslar

  1. Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
  2. Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
  3. Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
  4. Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
  5. Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
  6. Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
  7. Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
  8. Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

H cresel BiyolojiMikrobiyolojimm nolojiSay 26Vacciniavir senfeksiyonHeLaTRIzol reaktiftoplam RNA Mikroarrayamplifikasyonamino alilRNAAmbion Amino Allyl MessageAmpIIgen ekspresyonu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır