Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 2

Резюме

Протокол Vaccinia заражения клеток HeLa и анализ хозяина и вирусных экспрессии генов. Часть 2 из 3.

Аннотация

Семья

протокол

Часть 1: синтеза кДНК из РНК

1. Перед использованием Амбион Amino Аллил MessageAmp II комплекта, добавьте рекомендуемый объем в размере 100% этанола, мыть буферов.
2. В трубке реакции ПЦР, добавьте между 100ng к 5 мкг тотальной РНК и 1 мкл Т7 олиго (дТ) грунт. Довести объем до 12μl с нуклеазы без воды.
3. Инкубируйте образцы при температуре 70 ° С в течение 10 мин в амплификаторе.
4. Удалить РНК образцов от 70 ° С и центрифуги кратко. Место на льду.
5. Подготовка ^1-й Strand Синтез мастер перемешать и хранить при комнатной температуре (с 10% превышения для пипетирования ошибка). (Таблица 1)
6. Аккуратно пипетки Mix Master или фильм перемешать, а затем центрифуги кратко.
7. Передача 8μl из Master Mix к каждой пробе РНК. Смешать с помощью пипетки вверх и вниз по 3-4 раза.
8. Инкубировать при 42 ° С в течение 2 часов в амплификаторе.
9. Центрифуга образцы на короткое время и место на льду. Сразу же переходите к следующему шагу синтеза двухцепочечной ДНК.
10. Подготовка ^2-й Strand Синтез мастер смеси на льду (с 10% превышения для пипетирования ошибка). (Табл. 2)
11. Аккуратно пипетки Mix Master или фильм перемешать, а затем центрифуги кратко.
12. Передача 80μl к каждому образцу и осторожно перемешать с помощью пипетки вверх-вниз 3-4 раза.
13. Инкубировать при 16 ° С в течение 2 часов в амплификаторе.
14. После 2 часов инкубации, приступить к кДНК очистке шаг или немедленно заморозить при -20 ° C.

Часть 2: двухцепочечной кДНК очистке

1. Удалить кДНК Чистый из холодильника и дайте ему, чтобы уравновесить до комнатной температуры в течение 30 минут перед использованием. Встряхните бутылку, чтобы полностью ресуспендирования магнитного кДНК обязательным бисер перед использованием.
2. Алиготе нуклеазы без воды в 1,5 мл трубки и инкубировать при 50-60 ° С в течение минимум 10 минут в течение предыдущего 2hr инкубации.
3. Добавить 180μl кДНК Чистая для каждого образца, и тщательно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Передача образцов для 96-луночного круглым дном тарелку.
4. Продолжайте смешивать образцы, осторожно покачивая пластину на орбитальном шейкере в течение 2 минут.
5. Перемещение пластины для магнитного стоять, чтобы захватить магнитных бус. Оставьте пластину на стенде в течение приблизительно 6 минут, или пока смесь не станет прозрачной и обязательным бисера гранулированный.
6. Тщательно аспирата супернатанта с вакуумным аспиратором, не нарушая магнитных бус. Кроме того, осторожно удалите супернатант с пипеткой и отбросить супернатант.
7. Удалите пластину из магнитного стенда.
8. Добавить 150 мкл кДНК промывочного буфера в каждую лунку и встряхните пластине в течение 1 минуты на орбитальном шейкере при умеренной скорости. Бисер НЕ разойдутся на этом этапе, в связи с низким поверхностным натяжением из промывочного буфера.
9. Перемещение пластины для магнитного стоять, чтобы захватить магнитных бус.
10. Тщательно аспирата супернатанта с вакуумным аспиратором, не нарушая магнитных бус. Кроме того, осторожно удалите супернатант с пипеткой и отбросить супернатант.
11. Удалите пластину из магнитного стенда.
12. Повторите мыть ^2-й раз с 150 мкл кДНК промывочного буфера.
13. После ^2-й вымыть, обсушить бисером встряхиванием пластины в течение 2 минут на орбитальном шейкере при максимальной скорости. Не пересушить!
14. Элюировать кДНК из бисера, добавив 18μl из разогретой нуклеазы без воды каждого образца.
15. Энергично встряхните пластине в течение 3 минут на орбитальном шейкере, а затем проверить, чтобы убедиться, магнитных шариков полностью рассеялись. Если нет, то продолжать дрожать.
16. После магнитных шариков полностью рассеяны, перемещать пластину магнитного стоять, чтобы захватить магнитных шариков.
17. Тщательно передачи элюировали кДНК (~ 16μl) для новой пластинкой ПЦР (или ПЦР).
18. Перейдем непосредственно к следующему шагу, или заморозить кДНК при температуре -20 ° C.

Часть 3: в пробирке транскрипции (ИВТ)

1. Подготовьте смесь IVT мастер при комнатной температуре. (Табл. 3)
2. Аккуратно пипетки Mix Master или фильм перемешать, и центрифуга кратко.
3. Добавить 24μl для каждого образца, и осторожно перемешать с помощью пипетки вверх-вниз 3-4 раза.
4. Инкубировать при 37 ° С в течение 14 часов в амплификаторе, затем, удерживая при 4 ° С до готовности для следующего шага.

Часть 4: Арна очистке после IVT

1. Vortex связывание РНК бисером кратко получить даже смесь перед использованием.
2. Подготовка Арна Связывание Смешать при комнатной температуре (табл. 4) Это может быть сделано загодя -. Подготовлены обязательным смесь можно хранить при комнатной температуре на срок до одной недели.
3. Хорошо перемешайте на вортексе.
4. Алиготе буфера Арна Элюирование в 1,5 мл трубки и инкубировать при 50-60 ° С в течение не менее 10 минут.
5. Добавить 70μl из Арна обязательным смесидля каждого образца и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз по 3-4 раза.
6. Передача образца от пластины ПЦР для 96-луночного круглым дном тарелку.
7. Добавить 50 мкл 100% изопропанола к каждому образцу и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх-вниз 3-4 раза.
8. Осторожно встряхните пластину на орбитальный шейкер, по крайней мере 2 минуты для тщательного перемешивания образцов.
9. Перемещение пластины для магнитного стоять, чтобы захватить магнитных бус. Оставьте пластину на стенде, пока смесь не станет прозрачной и обязательным бисера гранулированный.
10. Тщательно аспирата супернатанта с вакуумным аспиратором, не нарушая магнитных бус. Кроме того, осторожно удалите супернатант с пипеткой и отбросить супернатант.
11. Удалите пластину из магнитного стенда.
12. Добавить 100 мкл Арна промывочного раствора в каждую лунку и встряхните пластине в течение 1 минуты на орбитальном шейкере при умеренной скорости. Бусины могут не расходиться на этот шаг.
13. Перемещение пластины для магнитного стоять, чтобы захватить магнитных бус.
14. Тщательно аспирата супернатанта с вакуумным аспиратором, не нарушая магнитных бус. Кроме того, осторожно удалите супернатант с пипеткой и отбросить супернатант.
15. Удалите пластину из магнитного стенда.
16. Повторите мыть ^2-й раз с 100 мкл промывочного раствора Арна.
17. После ^2-й вымыть, обсушить бисером встряхиванием пластины в течение 1 минуты на орбитальном шейкере при максимальной скорости. Не пересушить образцы!
18. Элюировать Арна из бисера, добавив 40μl разогретой Элюирование Арна буфера для каждого образца.
19. Энергично встряхните пластину на орбитальном шейкере в течение 3 минут, а затем проверить, чтобы убедиться, магнитных шариков полностью рассеялись. Если нет, то продолжать дрожать.
20. После магнитных шариков полностью рассеяны, перемещать пластину магнитного стоять, чтобы захватить магнитных шариков. Супернатант содержит очищенный амино-аллил включены Арна.
21. Тщательно передачи элюировали Арна к новой пластинкой ПЦР (или ПЦР).
22. (Необязательный шаг) Проверьте концентрацию РНК образцов путем измерения 1.5μl на NanoDrop спектрофотометр.
23. Сразу же продолжать на следующий шаг, и не храните Арна при температуре -80 ° C.

Таблица 1: ^1-й кДНК Strand Синтез Master Mix

Реагент	Сумма за 1 реакция
10X первый буфер Strand	2 мкл
дНТФ Mix	4 мкл
Ингибитор рибонуклеазы	1 мкл
Массив сценарий	1 мкл

Таблица 2: ^2-й кДНК Strand Синтез Master Mix

Реагент	Сумма за 1 реакция
Нуклеазы свободной воды	63 мкл
Второй 10X буфера Strand	10 мкл
дНТФ Mix	4 мкл
ДНК-полимераза	2 мкл
РНКазы Н	1 мкл

Таблица 3: IVT Master Mix

Реагент	Сумма за 1 реакция
aaUTP решение (75 мм)	2 мкл
АТФ, CTP, GTP смеси (25 мМ)	12 мкл
T7 UTP решение (75 мм)	2 мкл
T7 10X буфера реакции	4 мкл
T7 ферментов Mix	4 мкл

Таблица 4: Связывание Арна Mix

Реагент	Сумма за 1 реакция
Связывание РНК бисер *	10 мкл
Бусы ресуспендирования Решение *	4 мкл
100% изопропанола **	6 мкл
Арна Связывание Концентрат буфера	50 мкл

* Смешать связывание РНК бисер с борта решение ресуспендирования в первую очередь.
** Добавьте изопропанола и хорошо перемешать перед добавлением Арна обязательным концентрат буфера.

Обсуждение

Критические Шаги

Второй тур усиления не рекомендуется в качестве смещения в массиве данных не наблюдалось. Смешивание тщательно на каждом шагу ферментативной ^(1-й и ^2-й цепи кДНК синтеза, IVT) имеет решающее значение для получения хороших урожаев усиления, как и?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit	Reagent	Applied Biosystems	AM1753	For 20 reactions
Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit	Reagent	Applied Biosystems	AM1821	For 100 reactions, in a 96-well format
NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer	Other	NanoDrop	ND-1000	Or equivalent spectrophotometer