Infection virus de la vaccine et l'analyse temporelle de l'expression des gènes de virus: Partie 2

Résumé

Protocole pour la vaccine infection de cellules HeLa et l'analyse de l'hôte et l'expression des gènes viraux.

Résumé

La famille

Protocole

Partie 1: synthèse de l'ADNc de l'ARN

1. Avant d'utiliser le Ambion Amino Allyl MessageAmp II kit, ajouter la quantité recommandée d'éthanol à 100% pour les tampons de lavage.
2. Dans le tube de réaction PCR, ajouter entre 100 ng d'ARN total de 5 ug et 1 microlitre de T7 oligo (dT) primer. Porter le volume à 12μl avec une eau sans nucléase.
3. Incuber les échantillons à 70 ° C pendant 10 min dans un thermocycleur.
4. Retirer les échantillons d'ARN à partir de 70 ° C et centrifuger brièvement. Placez-le sur la glace.
5. Préparer le 1 ^er volet de synthèse master mix et de conserver à température ambiante (avec excédent de 10% pour le pipetage d'erreur). (Tableau 1)
6. Mélanger délicatement la pipette ou feuilleter Maître de mélanger, puis centrifuger brièvement.
7. Transfert de l'8μl Master Mix pour chaque échantillon d'ARN. Mélanger par aspiration et refoulement 3-4 fois.
8. Incuber à 42 ° C pendant 2 heures dans un thermocycleur.
9. Centrifuger les échantillons brièvement et placer sur la glace. Procéder immédiatement à l'étape suivante de la synthèse des ADN double brin.
10. Préparer le 2 ^ème volet maîtrise de synthèse mélange sur la glace (avec excédent de 10% pour le pipetage d'erreur). (Tableau 2)
11. Mélanger délicatement la pipette ou feuilleter Maître de mélanger, puis centrifuger brièvement.
12. Transfert 80μl à chaque échantillon et mélanger délicatement par aspiration et refoulement 3-4 fois.
13. Incuber à 16 ° C pendant 2 heures dans un thermocycleur.
14. Après l'incubation de 2 heures, procéder à l'ADNc de nettoyage étape ou congeler immédiatement à -20 ° C.

Partie 2: l'ADNc double brin de nettoyage

1. Retirez la pure ADNc du réfrigérateur et le laisser se stabiliser à la température ambiante pendant 30 minutes avant utilisation. Agitez la bouteille pour bien remettre en suspension les perles magnétiques ADNc contraignante avant l'utilisation.
2. Aliquoter eau sans nucléase dans un tube de 1,5 ml et incuber à 50-60 ° C pendant au moins 10 minutes pendant l'incubation précédentes 2hr.
3. Ajouter 180μl de Pure ADNc de chaque échantillon, et bien mélanger par pipetage de haut en bas. Transférer les échantillons à un 96-même à fond rond assiette.
4. Continuer à mélanger les échantillons en agitant la plaque sur un agitateur orbital pendant au moins 2 minutes.
5. Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. Laisser la plaque sur le stand pendant environ 6 minutes ou jusqu'à ce que le mélange devient transparent et les perles à caractère contraignant ont granulés.
6. Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant.
7. Retirer la plaque du socle magnétique.
8. Ajouter 150μl de tampon de lavage d'ADNc dans chaque puits et agiter la plaque pendant 1 minute sur l'agitateur orbital à vitesse modérée. Perles va se dispersent pas à cette étape, en raison de la faible tension de surface du tampon de lavage.
9. Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques.
10. Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant.
11. Retirer la plaque du socle magnétique.
12. Répéter le lavage une 2 ^ème fois avec 150μl de tampon de lavage d'ADNc.
13. Après le lavage 2 ^ème, sécher les perles en secouant la plaque pendant 2 minutes sur l'agitateur orbital à la vitesse maximale. Ne pas trop sécher!
14. Éluer l'ADNc à partir des billes en ajoutant 18μl de l'préchauffé eau sans nucléase à chaque échantillon.
15. Secouez vigoureusement la plaque pendant 3 minutes sur l'agitateur orbital, puis vérifiez que les billes magnétiques sont totalement dispersés. Sinon, continuez secouant.
16. Une fois que les billes magnétiques ont complètement dispersé, déplacer la plaque d'un support magnétique pour capturer les billes magnétiques.
17. Soigneusement transfert de l'ADNc élué (~ 16μl) d'une nouvelle plaque PCR (ou tubes PCR).
18. Passez directement à l'étape suivante, ou geler l'ADNc à -20 ° C.

Partie 3: transcription in vitro (IVT)

1. Préparer le mélange maître IVT à température ambiante. (Tableau 3)
2. Délicatement la pipette du Master Mix ou à cran de se mélanger, et centrifuger brièvement.
3. Ajouter 24μl de chaque échantillon, et mélanger délicatement par aspiration et refoulement 3-4 fois.
4. Incuber à 37 ° C pendant 14 heures dans un thermocycleur, puis maintenez à 4 ° C jusqu'au moment de l'étape suivante.

Partie 4: ARNa nettoyage après IVT

1. Vortex les perles liaison à l'ARN brièvement pour obtenir un mélange homogène avant utilisation.
2. Préparer le ARNa Mix reliure à température ambiante (tableau 4) Cela peut être fait à l'avance -. Le mélange préparé contraignantes peuvent être stockés à température ambiante pendant jusqu'à une semaine.
3. Mélangez bien au vortex.
4. Aliquoter le tampon d'élution ARNa dans un tube de 1,5 ml et incuber à 50-60 ° C pendant au moins 10 minutes.
5. Ajouter 70μl de l'ARNa mélange de liantà chaque échantillon et bien mélanger par pipetage haut et en bas de 3-4 fois.
6. Transférer les échantillons de la plaque PCR de 96 puits à fond rond assiette.
7. Ajouter 50 pl de 100% d'isopropanol à chaque échantillon et bien mélanger par pipetage haut et en bas de 3-4 fois.
8. Secouez doucement la plaque sur un agitateur orbital pendant au moins 2 minutes pour bien mélanger les échantillons.
9. Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. Laisser la plaque sur le stand jusqu'à ce que le mélange devient transparent et les perles à caractère contraignant ont granulés.
10. Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant.
11. Retirer la plaque du socle magnétique.
12. Ajouter 100 ul Solution Laver ARNa dans chaque puits et agiter la plaque pendant 1 minute sur l'agitateur orbital à vitesse modérée. Perles peut pas entièrement se dispersent à cette étape.
13. Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques.
14. Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant.
15. Retirer la plaque du socle magnétique.
16. Répétez le laver une fois 2 ^ème avec 100 ul Solution Laver ARNa.
17. Après le lavage 2 ^ème, sécher les perles en secouant la plaque pendant 1 minute sur l'agitateur orbital à la vitesse maximale. Ne pas trop sécher les échantillons!
18. Eluer la ARNa des billes en ajoutant 40μl de tampon d'élution préchauffé ARNa à chaque échantillon.
19. Secouez vigoureusement la plaque sur l'agitateur orbital pendant 3 minutes, puis vérifiez que les billes magnétiques sont totalement dispersés. Sinon, continuez secouant.
20. Une fois que les billes magnétiques ont complètement dispersé, déplacer la plaque d'un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. Le surnageant contient les ARNa nettoyé aminés allyle incorporé.
21. Soigneusement transférer le ARNa élué à une nouvelle plaque PCR (ou tubes PCR).
22. (Étape facultative) Vérifiez la concentration en ARN des échantillons en mesurant 1.5μl sur un spectrophotomètre NanoDrop.
23. Immédiatement continuer sur la prochaine étape, ou de stocker l'ARNa à -80 ° C.

Tableau 1: Volet 1 ^er ADNc Synthèse Mix Master

Réactifs	Montant pour une réaction
Tampon 10X First Strand	2 pl
dNTP Mix	4 pl
Inhibiteur de la ribonucléase	1 pl
Script tableau	1 pl

Tableau 2: ADNc 2 ^ème volet Maître Synthèse Mix

Réactifs	Montant pour une réaction
Eau sans nucléase	63 ul
Tampon 10X deuxième brin	10 ul
dNTP Mix	4 pl
ADN polymérase	2 pl
RNase H	1 pl

Tableau 3: IVT Mix Master

Réactifs	Montant pour une réaction
aaUTP solution (75 mM)	2 pl
ATP, CTP, GTP mélange (25 mM)	12 ul
T7 UTP solution (75 mM)	2 pl
Tampon de réaction 10X T7	4 pl
T7 Enzyme Mix	4 pl

Tableau 4: Mélanger ARNa reliure

Réactifs	Montant pour une réaction
Perles liaison à l'ARN *	10 ul
* Remise en suspension de billes Solution	4 pl
100% d'isopropanol **	6 pl
Concentré ARNa Binding Buffer	50 ul

* Mélanger les perles liaison à l'ARN avec la solution resuspension premier talon.
** Ajouter l'isopropanol et bien mélanger avant d'ajouter le concentré de tampon de liaison ARNa.

Discussion

Étapes critiques

Un second tour de l'amplification n'est pas conseillé que des biais dans les données array ont été observées. Mélanger soigneusement à chaque étape enzymatique (1 ^er et 2 ^ème synthèse brin d'ADNc, IVT) est essentielle à l'obtention de rendements d'amplification bon, tout comme l'incubation de chaque étape enzymatique à la température appropriée. Un cycleur PCR avec couvercle chauffant réglable est préféré - les ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit	Reagent	Applied Biosystems	AM1753	For 20 reactions
Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit	Reagent	Applied Biosystems	AM1821	For 100 reactions, in a 96-well format
NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer	Other	NanoDrop	ND-1000	Or equivalent spectrophotometer