Larvaların ve Yetişkin Enhancer-trap Flippase İfade Haritalama ve Uygulama Drosophila MSS

Özet

Biz, doku-spesifik FLP Gal80 ifade kalıplarını belirlemek için izin bir Flippase indüklenen intersectional Gal80/Gal4 baskı (FINGR) yöntemi açıklanmaktadır. Her yerde Gal4 ve FLP örtüşme, Gal4 ifade açık (Gal80 yukarı ve aşağı döndürülebiliyor) veya kapalı (Gal80 içinde döndürülebiliyorlar,). FINGR yöntem klonal analizi ve nöral devre haritalama için çok yönlüdür.

Özet

Gal4 / UAS ikili yöntemi Drosophila gen ve nöral devreleri manipülasyon için güçlü. En nörobiyolojik çalışmalar için, ancak, Gal4 ifade nadiren davranışsal okuma ile devre arasında kesin bir ilişki için yetecek kadar doku-spesifik. Bu büyük bir engel aşmak için, son zamanlarda ilgi doku daha kısıtlayıcı bir Gal4 ifade elde etmek için FINGR yöntem geliştirdi. 2) FLP / FRT-aracılı Gal80 dönüştürme araçları kümesi; geleneksel Gal4/UAS sistemi 1) ve 3) arttırıcı-trap FLP (ET-FLP): FINGR yöntemi üç bileşeni vardır. Gal4 ilgi primer nöral devreleri tanımlamak için kullanılır. Gal4 Sebze UAS-efektör UAS-MJD78Q veya UAS-Shi ^ts gibi, sinek davranış değişiklikleri ile kendini gösteren nöronal aktivitenin, düzenler. UAS-GFP, belirli bir davranış katılan nöral devre gibi bir ek ile UAS-muhabiri aynı zamanda morfolojik analizi için eşlenebilir. Küvet ^P> Gal80> ('çevirmek') ve küvet ^P>> Gal80 ('çevirmek') durdurmak: Gal4 hatları için geniş bir ifade ile, Gal4 ifade birbirini tamamlayan iki Gal80-dönüştürme araçları ile sınırlı olabilir Son olarak, doku-spesifik ET-FLP yardımıyla araştırmacılar, sırasıyla, Gal80 açmak ya da kapatabilirsiniz. Kapak modu, Gal80 Gal4 ve ET-FLP kesiştiği yerde Gal4 ifade bastırmak. Flip-out modunda, Gal80 Gal4 ve FLP örtüşme hücrelerinde Gal4 baskı rahatlatmak olacaktır. Her iki yaklaşım Gal4 tanımlanmış devre hücrelerinin sayısını kısıtlama sağlar, ancak ters bir desen. FINGR yöntemi Gal4 sinek topluluk hatları ve geleneksel klonal analizi ve nöral devre haritalama için çok yönlü geniş bir koleksiyon ile uyumludur. Bu protokol, FLP ekspresyonu haritalama seçin ET-FLPx2 hatları ve fotoreseptör hücrelerinin FINGR yöntemin etkinliğini göstermektedir. FINGR yönteminin prensibi de Gal4/UAS, Gal80 ve FLP / FRT kullanıldığı diğer genetik model organizmalar için geçerli olmalıdır.

Protokol

1. Drosophila suşları

1. Gal4 sürücü:
   Fotoreseptör hücrelerinin Gal4 ifade GMR-Gal4.
2. UAS hatları
   Gal4-ifade hücreleri, sinir dejenerasyonu neden UAS MJD78Q (veya UAS-polyQ).
   Gal4-ifade hücreler, GFP ifade UAS-GFP.
3. FLP hatları
   fotoreseptör ve beyin bölgelerinin altkümelerini FLP ifade ey-FLP.
   FLP iki kopya (FLP-IRES-FLP) içeren arttırıcı-trap hatları ET-FLPx2 hatları. Biz ekspresyonu karakterize henüz ~ 1.000 ET-FLP hatları (Bohm ve ark, 2010) yarattı. Burada, larva ve yetişkin bir sinek merkezi sinir sistemi (MSS) ET-FLPx2 seçin ifade deseninin karakterizasyonu açıklar.
4. FLP muhabir
   yw, aktin ^P> CD2> Gal4; UAS-GFP (Pignoni & Zipursky, 1997) ile ET-FLPx2 ifade deseni raporları aktin ^P> Gal4> CD2 FLP aracılı recombinational eksizyon üzerine UAS-GFP.
5. İki tamamlayıcı Gal80 dönüştürme araçları
   Küvet ^P> Gal80> (Gordon ve Scott, 2009), yapısal olarak güçlü bir tubulin organizatörü tarafından yönlendirilen tüm dokulara Gal80 ifade flip-out bir yapım. FLP aracılı rekombinasyon üzerine> Gal80 kalkan ve sadece Gal80 ifade sonlandırılır ET-FLPx2 ifade dokular.
   Küvet ^P>> Gal80 (Bohm ve ark, 2010), durdurmak, normal şartlar altında Gal80 ifade etmez inşa çevirin . Sadece tubulin organizatörü tarafından ifade Gal80 açık ET-FLPx2 ifade FLP> durdurmak çevirir ve Gal80 döndürür dokular.
6. Bileşik göz FLP aktivitesi test için Sinekler
   GMR-Gal4 UAS-polyQ; tub ^P>> dejenere Gal80 (Bohm ve ark, 2010), ve depigmented gözleri durdurun. FLP-ifade fotoreseptör hücrelerinin, polyQ ifade Gal80 flip-aşağıdaki kapalı olan.
   GMR-Gal4, UAS-polyQ (Bohm ve ark, 2010) tub ^P> Gal80>, normal gözleri vardır. FLP-ifade fotoreseptör hücrelerinin, polyQ ifade Gal80 flip-out aşağıdaki açıktır.

2. Reaktifler

Fosfat tamponlu salin (PBS, 1X), pH: 7.4.
PFA, EM dereceli (Cat # 15.710, Elektronik Mikroskopi Bilimler, Hatfield, PA) PBS içinde seyreltilmesi% 16% 4 paraformaldehid (PFA),
PBT,% 0.1 Triton-X 100 (Sigma) içeren 1XPBS
Anti-Elav (mAb, 9F8A9 Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası, Iowa Üniversitesi), lekeleri Drosophila bütün nöronlar.
Anti-Repo (mAb 8D12 Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası, Iowa Üniversitesi) Drosophila lekeleri glial hücreleri.
Alexa 594 tavuk, fare sekonder antikoru karşı (Invitrogen)

3. Arttırıcı-trap FLPx2 hatları ifade desen Haritalama (* kritik adımlar)

1. Yw bakireler kadın toplayın aktin ^P> CD2> Gal4; UAS-GFP hattı ve erkekler için ayrı ayrı ET-FLPx2 hatları çapraz. Eski doku ET-FLP ifade GFP muhabir olarak hizmet vermektedir.
2. * _3. instar F1 larvaları dolaşıp parçalara ayır, 3X buz gibi soğuk PBS ile yıkama, buz üzerinde% 4 PFA 1 saat düzeltmek, CNS (yani beyin ve ventral sinir kablosu, VNC) ve vücut duvarı korumak izledi PBT 3X yıkar.
   Diseksiyon
   1. ^3. instar F1 larvaları dolaşıp çıkarın ve temiz bir Sylgard çanak (35 mm 2 gram Sylgard ile dolu x 10 mm petri - karma talimatları üretimi göre) içine yerleştirin.
      1. Fırça ile yemek artıkları çıkarın
   2. Larvaları uyutmak için buz üzerinde buz 1XPBS ve yeri ile çanak doldurun
   3. Forseps bir çift ile bir larva ağzında kanca tutun ve başka bir çift ile forseps uzanan ön hava deliği yakın ve arka sonuna doğru manikür soyma manikür kapmak. MSS, tükürük bezleri, gut, ve hayali diskler ile birlikte kanca ağız eklenecektir.
   4. Aşırı doku ve MSS çevreleyen hayali diskleri çıkarın.
   5. MSS bir PBS dolu 3 kabına aktarın.
      1. A silikonlu P200 pipet doku kurumasını önlemek için de kullanılabilir.
   6. 1 saat buz üzerinde% 4 PFA 200 ul saptamak için.
      1. MSS tamamen PFA batmış olduğundan emin olun.
         1. MSS yüzer ise, bu genellikle MSS çevreleyen doku temizlenir olmadığını göstermektedir.
   7. PBT 3X yıkar takip 3X buz gibi soğuk PBS ile yıkayın.
3. * Yetişkin F1 sineklerin MSS parçalara ayır.
   1. CO ₂ ile sinek anestezisi ya da 10 dakika boyunca buz üzerinde boş bir flakon içindeki sinekler yerde .
   2. Yeri yetişkin için 30 saniye boyunca buz üzerinde% 95 EtOH dolu cam tabak içine uçuyor.
   3. Yetişkin sinekler, cam tabak buz dolu bir 1XPBS içine aktarın.
      1. Artık EtOH kaldırmak için 1X PBS ile buz 3X yıkayın
   4. 35mm Sylga içine bir sinek yerleştirinrd çanak buz 1X PBS ile dolu
   5. Ventral yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve karın yoluyla (minutiens pimler 0,1 mm) yarı yolda küçük bir böcek kalem eklemek.
      1. Forseps bir çifti kullanılarak bacakların tabanı tutun ve forseps başka bir çift bacakları kaldırmak.
   6. Baş manikür çıkarın
      1. Forseps bir çift burnumun kapma, göz altında ve sinek kafası dorsal orta hat doğru manikür kabuğu başka bir yerde.
      2. Diğer göz tut ve diğer tarafta kalan manikür çıkarın.
      3. Keskin forseps ve / veya bilenmiş tungsten iğne kullanarak, beyni çevreleyen trakeal doku çıkarmak
         1. Trakea yanlış temizlik GFP ifade engelleyen, güçlü bir oto-floresan sonucu, beyin sabitleme sırasında float izin
   7. VNC Diseksiyon
      1. Torasik manikür çıkarın
         1. ^3. preepisternum her iki tarafında iki forseps (yani, arka ayakları taban kapma), toraks arka sonunda başlayarak.
         2. Yavaşça, manikür ventral orta hat çizgisi uzak ayrı bir boyun baz ulaşana kadar bu adımı tekrarlayın.
         3. Yavaşça VNC açığa torasik manikür iki yarısı yayıldı
      2. Sonraki toraks karın çıkarın. Ikinci ayağı dibinde toraks tutmak için bir çift forseps kullanarak iken, 1. karın sternite yakın karın kapmak için başka bir çift forseps kullanımı ve karın çekin.
      3. Çevredeki göğüs dokusundan VNC kaldırmak için. Forseps bir çift ve uzakta, forseps nazik gözyaşı torasik karkas çoğunluğu başka bir çift ile humerus alanda tutun.
      4. Bu noktada, servikal bağ (boyun) çevreleyen bağ dokusunun bir halka olması gerekir. Iki forseps kullanma dışında halka gözyaşı.
      5. VNC çevresindeki herhangi bir aşırı torasik dokular temizlenir
   8. Buz üzerinde 1X PBS içeren 9 iyi Pyrex çanak Transfer beyin ve VNC
      1. A silikonlu P200 pipet doku kurumasını önlemek için kullanılabilir
4. * 1 saat buz üzerinde% 4 PFA yetişkin MSS saptamak ve buz gibi soğuk PBS ve 3X PBT ile 3X yıkayın.
5. 4 yetişkin MSS hazırlanması veya larva merkezi sinir sistemi ve vücut duvarı ° C'de karşı antikor (anti-Elav, 1:10) ya nöron veya glia (anti-Repo. 1:10) bir gecede. PBT 5X hazırlık yıkayın.
6. Alexa 594 tavuk 2 saat oda sıcaklığında fare sekonder antikoru (1:100) karşı olan erişkin veya larva hazırlanması ile inkübe ve hazırlık PBS ile yıkayın.
7. Mount bir slayt larva veya yetişkin MSS. CNS doğal şeklini korumak için, kapak kayma askıya için bir mini-köprü olarak slayt O-şeklinde bir plastik halka (Sil Takviye Etiket, Avery Dennison, Ofis Ürünleri, Brea, CA) kullanın.
8. GFP ve Elav (ya da Repo) bir floresan mikroskop altında ifade kalıpları için hazırlık inceleyin.

4. Fotoreseptörlerin baskı Gal4 iki tamamlayıcı Gal80-dönüştürücü araçlar uygulama

1. Küvet aracılığıyla ^P Gal80 çevirme> Gal80> (Şekil 5A).
   1. Tub ^P> Gal80> hat; GMR-Gal4, UAS-polyQ erkek toplayın. Bileşik gözler bu sineklerin normal olduğunu unutmayın.
   2. Ey-FLP bakireler çiftleşirler.
   3. F1 sinekleri toplayın ve göz fenotip inceleyin.
2. Yoluyla küvet Gal80 Flipping ^P>> Gal80 (Şekil 5B) dur.
   1. GMR-Gal4, UAS-polyQ toplamak; tub ^P>> Gal80 erkek sineklerin durdurmak ve göz fenotip incelemek. Not dejenere ve bu sinekler depigmente gözleri vahşi tip suşlar (Kanton-S)
   2. Ey-FLP bakireler ile Mate;
   3. F1 sinekleri toplayın ve göz fenotip inceleyin.
3. Select ET-FLPx2 fotoreseptör hücrelerinin ifade hatlar

4.1 ve 4.2 Adımlar ET-FLPx2 çizgiler kullanılarak tekrar edilebilir olduğunu ifade FLP fotoreseptör hücrelerinin bir alt kümesi. Alternatif olarak, ya GMR-Gal4 UAS-polyQ tub ^P> durdurmak> Gal80 sinekleri ya da GMR-Gal4 UAS-polyQ tub ^P> Gal80> sinekler hatları için bireysel ET-FLPx2 hatları ekrana geçilebilir ifade fotoreseptör hücrelerinin FLP. Değerli ET-FLPx2 hatları olan ekspres FLP sadece bir alt kümesi veya tek fotoreseptör hücrelerinin (Şekil 6).

5. Temsilcisi sonuçları

ET-FLPx2 belirli bir hattı ifade desen kolayca incelenir ve yw, aktin ^P arasında çapraz türetilmiştir F1 larvaları veya yetişkin uçar belgelenmelidir> CD2> Gal4; UAS-GFP bakireler ve ET-FLPx2 erkek (Şekil 1) . Tipik olarak, 04:57 disseke ve FLP ifade deseni (Bohm ve ark, 2010) tekrarlanabilirlik belirlemek için incelenir F1 hayvanların çoğaltır. Şekil 2, larva ve yetişkin MSS ET-FLPx2 hattı 173A FLP ifade deseni gösterir . FLP desen daha fazla nöron veya glial işaretleyici (Şekil 3 ve 4) kullanılarak analiz edilebilir.

Şekil 7 de gösterilen sonuçlar Gal80 flip-etkinliğini göstermek ve Gal4 aşağıdaki FLP aracılı rekombinasyon intersectional baskı sistemleri çevirmek. Küvet ^P> durdurmak> Gal80 inşa Gal80 sızdıran herhangi bir ifade (fotoreseptör üniforması dejenerasyon ve depigmentasyon dayalı) sahip değildir ve henüz eyFLP yardımı ile bastırmak için Gal80 saygısız% 100 etkili GMR- Gal4 ve normal görünümleri (Şekil 7A) için göz geri. Aksine, küvet ^P> Gal80> tam eyFLP giriş öncesinde GMR-Gal4 bastırmıştır. GMR-Gal4 sürücüler UAS-polyQ ifade depigmente gözleri dejenere (Şekil 7B) ve önde gelen, Gal80, flip-out ardından. Bu örnekte, fotoreseptör 'devreleri' harita için bir pan-Fotoreseptör FLP ancak davranışsal sonuçları incelemek vermedi. Davranışsal ilgili Gal4 hatları ile benzer yaklaşımlar kullanarak, erişkin sinek kanadı genişleme (Bohm ve ark, 2010) düzenleyen iki yöntem-Gal4 devre bir parçası eşlenen. Biz FINGR yöntemi davranış nöronal temelini anlamamıza yardım değerli olacağına inanıyoruz.

Şekil 1. ET-FLPx2 hattı ifade deseni incelenmesi ET-FLPx2 hattan FLP ifade deseni (mavi oval), ET-FLPx2 erkek (sol üst) bir ^aktin P> CD2> Gal4 geçerek belirlenebilir; UAS GFP bakire (sağ üstte). Ubiquitous Aktin ^P> ebeveyn kadın Gal4 ifade FRT (siyah üçgenler) çevrili CD2 dizisi ekleme tarafından engellenmektedir. F1 döl, FLP tüketim CD2 dizisi, Aktin ^P> Gal4 UAS-GFP ifade sürmek için izin.

Şekil 2. Larva ve yetişkin merkezi sinir sisteminde bir ET-FLPx2 hattı İfade desen. Bu görüntüler çiftleşme yw, aktin ^P üretilen yavrular disseke santral sinir sistemi (beyin ve ventral sinir kablosu, VNC) tasvir> CD2> Gal4; ET-FLPx2 173A hattı UAS-GFP ebeveynler. > CD2> kaset dışarı yeniden birleştirilmesini, FLP aktin ^P> GAL4 ifade (UAS-GFP sonucu ifade) harekete geçirir. Bu nedenle, GFP desen FLP-ifade hücreleri raporlar. Paneli B hattı 173A yetişkin ifade desen gösterir ise Paneli larva FLP ifade desenini gösterir.

Şekil 3. ET-FLPx2 Hattı # 688A flippase ifade hücre tiplerinin karakterizasyonu, anti-REPO ET-FLPx2 hattı # 688A ve GFP Flippase raporlama hattı arasında bir haç ile boyanmış bir sabit F1 ^3. instar larva kompozit görüntü. ^3. instar larvaları VNC arka ucunda alınan BD, yüksek büyütme (Zeiss Plan-Apochromat 63x yağ) görünümü.

Şekil 4. ET-FLPx2 Hattı mantar bünyesinde hücre tiplerinin karakterizasyonu # 150 AC, anti-REPO ile boyanmış bir sabit F1 3. instar larva mantar vücut yüksek büyütmede (63x immersiyon yağı).

Şekil 5. Flip-ve Flip-Gal80 Stratejileri İllüstrasyon. A., flip-out strateji tubulin organizatörü odaklı Gal80 (Küvet ^P> Gal80>), GMR-Gal4 baskı ve vahşi bir tip göz fenotip (kırmızı göz), yapısal olarak aktif . Bu baskı Gal80 (orta, kırmızı) çevirin ve GMR-Gal4 UAS-polyQ ifade sürücü sağlayacaktır FLP (mor), giriş kaldırılır. Bu fotoreseptör hücre dejenerasyonu (gözün beyaz noktalar ile gösterilmiştir) B. Önceki stratejinin karşılıklı tubulin Gal80 ifade organizatörü-odaklı "dur" kodon çevrili FRT (siyah üçgen) tarafından kesilir. Gal80 yokluğunda, GMR-Gal4 fotoreseptörlerde nöronal dejenerasyon (gözün beyaz noktalar ile gösterilmiştir) neden UAS-polyQ bağlanır. GMR-Gal4, UAS-polyQ geçerek; tub ^P>> GAL80 erkek fotoreseptör hücrelerinin FLP ifade bakire kadın, FLP (mor), "dur" kodon (orta eksize FRT siteleri rekombinasyon katalize durdurmak, kırmızı), böylece Gal80 ifade ve GMR-Gal4 bastırılması için izin verir. Bu fotoreseptör hücrelerinin (w eksikliği gösterilmiştir nörodejenerasyon tutargöz hite nokta).

Şekil 6. ET-FLPx2 Line # 688A kullanılarak Gal80 saygısız FINGR yöntemin uygulama ET-FLPx2 çizgisi arasında çapraz GMR-Gal4, UAS-polyQ # 688A bakire F1 döl; tubP> GAL80 erkek. Göz ommatidia ortasında pigment eksikliği # 688A hattı FLP ifade temsil eder. Bu alanda Gal4 UAS-polyQ sürücü sağlayan GMR-Gal4 Gal80 bastırma rahatladım.

Şekil 7. Içinde ya da dışında fotoreseptörlerde Gal4 kesiştiği Gal80 saygısız FINGR yöntemin uygulama. A. küvet ^P>> Gal80 flip-sistem FLP-bağımlı bir şekilde ifade GAL4 kısıtlayan durdurmak . GMR-Gal4, UAS-polyQ tub ^P> durdurmak> GAL80 sinekler, fotoreseptör hücrelerinin dejenere ve pigmentini kaybetmiş olan (sol sinek). EyFLP tanıtımı takiben, Gal80 sırayla ifade polyQ kapanır ve normal gözlerde sinek üreten (sağ sinek), GMR-Gal4, tam baskı, fotoreseptör hücrelerinin ifade edilir. B. küvet ^P> Gal80> Kapak -out sistemi, küvet gibi ters moda ^{çalışır P>} ​​durdurmak> Gal80 flip-sistem . Küvet ^P> Gal80> yapısal GAL4 bastıran ve polyQ ifadesi (normal göz ile, sinek sol) bastırır. Gal80 eyFLP tanıtımı takiben, GMR-Gal4 bastırma giderici ve ifade polyQ dönüm fotoreseptör hücrelerinin çevrilmiş. Bu dejenere ve depigmente göz (sağ sinek) sinekler yol açar.

Tartışmalar

Gal4/UAS sistemi çeşitli biyolojik çalışmalar için Drosophilists (Duffy, 2002 Marka & Perrimon, 1993) tarafından kullanılan yaygın ve başarılı olmuştur. Bugüne kadar, sinek toplum organizatörü odaklı ve arttırıcı-trap Gal4 hatları binlerce üretti. FINGR yöntemin önemli bir gücü mümkün Drosophila çalışmaları Gal4 gücünü önemli ölçüde genişletmek için, Gal4/UAS sistem ile uyumlu olduğunu.

FINGR yöntemin önemli bir uygulama Gal4/Gal80 kesiştiği yoluyla davranışın altında yatan ince ayar sinir devreleri. Bu davranışlar içerebilir, ancak öğrenme ve hafıza, kur, uyku, ve sirkadiyen ritim, bunlarla sınırlı değildir. Ayrıca, Alzheimer gibi insan nörodejeneratif hastalıklar, Amyotrofik lateral skleroz (ALS), Parkinson hastalığı modelleme nörodejenerasyon eğilimli olan kritik nöronların haritaya FINGR yöntemi kullanılabilir. Benzer şekilde, aracılık kokain, alkol ve diğer madde bağımlılığı için çok önemli nöronların veya nöral devreleri odakları FINGR yöntemi kullanılarak eşleştirilmiş olabilir. FINGR yöntemi ile sinir devreleri ve davranışları zamansal kontrol kazanmak için olabilir; koşullu Gal4s (Roman ve ark, 2001 Osterwalder ve ark, 2001) dikkat edilmelidir. Gal80 dönüştürme araçları Modifikasyonu ısıya duyarlı Gal80 (Gal80 ^ts, McGuire ve ark, 2003) kullanarak üretebilir küvet durdurmak ^P>> Gal80 ^ts ya da küvet ^P> Gal80 ^ts> devre manipülasyon daha zamansal esneklikler ekleyerek. Sinir sisteminin ötesinde, FINGR yöntemi, kanat veya bacak olup olmadığını hücre altkümelerini Gal4 ifade kısıtlayan için de geçerlidir.

ET-FLPx2 hatları MARCM (Lee ve Luo, 1999) de dahil olmak üzere FRT / FLP tabanlı klonal analiz (Xu ve Rubin, 1993), ilgilenen tüm Drosophila biyologlar için değerli bir kaynak olacaktır. Aynı zamanda bazı ET-FLPx2 hatları, tekrarlanabilir klonlar üretmek için ve tekrarlanan morfolojik ve davranışsal analizleri için heatshock FLP yerine bekleniyor. Arttırıcı-trap Gal4 hatları gibi, en ET-FLPx2 hatları faiz hücreler özellikle ifade edilmesi olası değildir. Çoğu hatları ilgi hücreler VE yanı sıra diğer hücreleri veya dokuları FLP ifade edecektir. Ancak, hem de Gal4 ve ET-FLPx2 'doku özgüllüğü eksikliği sürece kendi örtüşen bölge belirli bir deney için arzu edilir FINGR yöntemi için önemli bir endişe olmaz. FINGR iki 'geniş' sistemleri rafine bir birine çevirmek için tasarlanmıştır.

Bu protokollerin gösterilen yöntemler oldukça standart ve tekrarlanabilir olmalıdır. Kişinin dikkatini gerektiren önemli bir uyarıcı adımları fiksatif seçimi ve kullanımı. GFP sinyal söndürmeye çünkü PFA daha başka Fiksatifler kaçınılmalıdır. Ayrıca PFA FLP ifade GFP tarafından güvenilir olmaz olasılığını önlemek için fiksasyon diseksiyon çanak gerektiğini kaydetti var.