Mapeamento e Aplicação de Enhancer-trap Expressão Flippase em larval e Adultos Drosophila CNS

Resumo

Nós descrevemos um Flippase induzida interseccional Gal80/Gal4 repressão método (FINGR), permitindo que o tecido específico FLP para determinar Gal80 padrões de expressão. Onde quer que Gal4 e sobreposição FLP, Gal4 expressão é ligado (Gal80 virado para fora) ou desligado (Gal80 capotou in). O método FINGR é versátil para análise clonal e mapeamento do circuito neural.

Resumo

O método binário Gal4 / UAS é poderoso para o gene e manipulação de circuitos neurais em Drosophila. Para a maioria dos estudos neurobiológicos, no entanto, raramente é Gal4 expressão tecido-específica o suficiente para permitir a correlação precisa do circuito com leituras comportamentais. Para superar este obstáculo, que recentemente desenvolveu o método FINGR para alcançar um mais restritivo Gal4 expressão no tecido de interesse. O método FINGR tem três componentes: 1) o sistema Gal4/UAS tradicionais; 2) um conjunto de FLP / FRT mediada Gal80 ferramentas de conversão, e 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 é usado para definir o circuito primário neural de interesse. Comparação do Gal4 com um UAS-efetoras, tais como UAS-MJD78Q ou UAS-Shi ^ts, regula a atividade neuronal, que por sua vez é manifestada por alterações no comportamento da mosca. Com um adicional de UAS-repórter, como UAS-GFP, o circuito neural envolvido no comportamento específico pode ser mapeada simultaneamente para análise morfológica. Para Gal4 linhas com a expressão ampla, Gal4 expressão pode ser restringida por meio de dois complementares Gal80 conversora de ferramentas: banheira ^P> Gal80> ("flip out") e banheira ^P> parar> Gal80 ('flip em'). Finalmente, os investigadores podem transformar Gal80 ligado ou desligado, respectivamente, com a ajuda de tecidos específicos ET-FLP. No flip-in modo, Gal80 vai reprimir Gal4 expressão onde Gal4 e ET-FLP se cruzam. No modo de flip-out, Gal80 irá aliviar Gal4 repressão nas células em que se sobrepõem Gal4 e FLP. Ambas as abordagens permitem à restrição do número de células no circuito Gal4-definido, mas em um padrão inverso. O método FINGR é compatível com a vasta coleção de Gal4 linhas na comunidade voar e altamente versátil para a análise clonal tradicionais e para o mapeamento do circuito neural. Neste protocolo, demonstramos o mapeamento dos padrões de expressão FLP em selecionar ET-FLPx2 linhas ea eficácia do método FINGR em células fotorreceptoras. O princípio do método FINGR também deve ser aplicável a outros organismos modelo genético em que Gal4/UAS, Gal80 e FLP / FRT são usados.

Protocolo

1. Drosophila cepas

1. Gal4 driver:
   GMR-Gal4, que expressa Gal4 em células fotorreceptoras.
2. UAS linhas
   UAS-MJD78Q (ou UAS-polyQ), que causa degeneração neural em Gal4 células que expressam.
   UAS-GFP, que expressa GFP em Gal4 células que expressam.
3. Linhas de FLP
   ey-FLP, que expressa FLP em fotorreceptores e em subconjuntos de regiões do cérebro.
   ET-FLPx2 linhas, que são enhancer trap-linhas contendo duas cópias da FLP (FLP-IRES-FLP). Temos gerado ~ 1000 ET-FLP linhas (Bohm et al., 2010), cuja expressão padrões ainda estão para ser caracterizado. Aqui, descrevemos a caracterização do padrão de expressão de ET-selecionar FLPx2 na larva e adulto voar sistema nervoso central (SNC).
4. Repórter FLP
   yw, actina ^P> CD2> Gal4; UAS-GFP (Pignoni & Zipursky, 1997), que relata o padrão de expressão de ET-FLPx2 através de actina ^P> Gal4; UAS-GFP sobre FLP mediada por excisão de recombinational> CD2.
5. Dois complementares Gal80 conversora de ferramentas
   Banheira ^P> Gal80> (Gordon & Scott, 2009), a construção de flip-out, que constitutivamente expressa Gal80 em todos os tecidos dirigido por um promotor de tubulina forte. Após a FLP mediada recombinação,> Gal80 está virado para fora e Gal80 expressão é terminada apenas em ET-FLPx2 expressando tecidos.
   Banheira ^P> parar> Gal80 (Bohm et al., 2010), o flip-em construção, que não expressa Gal80 em condições normais. Gal80 expressão é ativada pelo promotor tubulina apenas em ET-FLPx2 expressar-tecidos em que FLP enlouquece parar> e vira em Gal80.
6. Moscas para testar a atividade FLP no olho composto
   GMR-Gal4, UAS-polyQ; banheira ^P> parar> Gal80 (Bohm et al, 2010.), Que degeneram e os olhos despigmentados. Em FLP-expressando células fotorreceptoras, expressão polyQ é desligado após Gal80 flip-in.
   GMR-Gal4, UAS-polyQ; (. Bohm et al, 2010) tub ^P> Gal80>, que tem olhos normais. Em FLP-expressando células fotorreceptoras, expressão polyQ está ligado seguintes Gal80 flip-out.

2. Reagentes

Tampão fosfato (PBS, 1X), pH 7.4.
Paraformaldeído a 4% (PFA), diluído em PBS de 16% PFA, EM grau (Cat # 15710, Ciências Microscopia Eletrônica, Hatfield, PA)
PBT, 1XPBS contendo 0,1% Triton-X 100 (Sigma)
Anti-Elav (mAb, 9F8A9; Developmental Estudos Hibridoma Bank, da Universidade de Iowa), manchas todos os neurônios em Drosophila.
Anti-Repo (mAb 8D12; Developmental Estudos Hibridoma Bank, University of Iowa) manchas células gliais em Drosophila.
Alexa frango 594 contra anticorpo secundário do mouse (Invitrogen)

3. Mapeamento do padrão de expressão de linhas enhancer-trap FLPx2 (* passos críticos)

1. Coletar fêmeas virgens do yw, actina ^P> CD2> Gal4; linha UAS-GFP e cruzar com os homens de cada ET-FLPx2 linhas. O primeiro serve como um repórter GFP para a expressão tecido de ET-FLP.
2. * Dissecar vagando 3 _º instar as larvas F1, manter o sistema nervoso central (isto é, o cérebro eo cordão nervoso ventral, VNC) e da parede do corpo, correção para uma hora em PFA 4% sobre o gelo, lave 3X com PBS gelado seguido por lava 3X com PBT.
   Dissecação
   1. Remover vagando 3 ^º instar as larvas F1 e coloque-os em um prato limpo Sylgard (35 mm x 10 mm placa de petri preenchida com 2 gramas de Sylgard - misturado de acordo para a fabricação de instruções).
      1. Remover restos de comida com pincel
   2. Encha o prato com gelado 1XPBS e colocar no gelo para anestesiar as larvas
   3. Segure os ganchos na boca de uma larva com uma pinça e pegar a cutícula perto do espiráculo estendendo anterior com outro par de fórceps e descascar a cutícula para o fim posterior. O SNC será anexado a ganchos na boca, juntamente com as glândulas salivares, intestino e discos imaginais.
   4. Retire o excesso de tecido e discos imaginal em torno do CNS.
   5. Transferência do SNC em um PBS-cheia 3 pirex bem.
      1. A siliconada P200 ponteira pode ser usada para evitar a secagem do tecido.
   6. Correção para uma hora em 200 mL de PFA 4% sobre o gelo.
      1. Garantir que o CNS é completamente submersas na PFA.
         1. Se o SNC flutua, isso normalmente sugere que o CNS não é devidamente limpo a partir do tecido circundante.
   7. Lavar 3X com PBS gelado seguido por lavagens 3X com PBT.
3. * Dissecar o SNC de moscas F1 adulto.
   1. Anestesiar as moscas com CO ₂ ou colocar as moscas contido dentro de um frasco vazio no gelo por 10 minutos.
   2. Adulto lugar voa em um prato de vidro de 95% EtOH repletas de gelo por 30 seg.
   3. Transferência de moscas em um prato de vidro cheio 1XPBS no gelo.
      1. Lavar 3X com gelado 1X PBS para remover EtOH residual
   4. Coloque uma mosca em uma Sylga 35 milímetrosrd prato cheio de PBS 1X gelada
   5. Coloque o lado ventral para cima e coloque uma caneta pequeno inseto (pinos minutiens 0,1 mm) no meio do abdômen.
      1. Usando um par de fórceps segure a base das pernas e retire as pernas com um par de fórceps.
   6. Remover a cutícula cabeça
      1. Enquanto agarrando a tromba com um par de fórceps, coloque outra por baixo do olho e descascar a cutícula para a linha dorsal da cabeça voar.
      2. Agarre o outro olho e remover a cutícula restantes do outro lado.
      3. Utilizando uma pinça afiada e / ou agulha de tungstênio afiada, remover o tecido traqueal que envolvem o cérebro
         1. Limpeza inadequada da traquéia vai resultar em forte auto-fluorescência, obstruindo expressão GFP, e permitir que o cérebro a flutuar durante a fixação
   7. Dissecação VNC
      1. Remover a cutícula torácica
         1. A partir do final posterior do tórax, coloque duas pinças em cada lado do preepisternum 3 ^º (isto é, agarrando a base das pernas).
         2. Separar delicadamente a cutícula longe da linha média ventral, repita isso até chegar na base do pescoço.
         3. Puxe as duas metades da cutícula torácica expondo o VNC
      2. Em seguida remova o abdômen do tórax. Enquanto estiver usando uma pinça para segurar o tórax, na base da segunda mão, use um outro par de pinças para agarrar o abdômen perto do primeiro esternito abdominal e puxe o abdômen fora.
      3. Para remover o VNC do tecido circundante torácica. Manter a área umeral com um par de fórceps e com outro par de fórceps lágrima suave longe da maioria da carcaça torácica.
      4. Neste ponto, deve haver um anel de tecido conjuntivo em torno do conjuntivo cervical (pescoço). Utilizando duas pinças de rasgar o anel de distância.
      5. Remova qualquer excesso de tecido torácica em torno do VNC
   8. Transferência do cérebro e da VNC a 9 bem-pirex contendo 1X PBS sobre o gelo
      1. A siliconada P200 ponteira pode ser usada para evitar a secagem do tecido
4. * Fix do SNC adulto por 1 hora em PFA 4% sobre o gelo e lave 3X com PBS gelado e 3X com PBT.
5. Incubar a preparação do SNC adulto ou do SNC larval e parede do corpo a 4 ° C durante a noite com anticorpos para ambos os neurônios (anti-Elav, 1:10) ou glia (anti-Repo. 1:10). Lave a preparação de 5X com PBT.
6. Incube com a preparação de adultos ou larvas com Alexa frango 594 contra rato anticorpo secundário (1:100) em temperatura ambiente durante 2 horas, e lavar a preparação com PBS.
7. Monte o CNS larval ou adultos em um slide. Para preservar a forma natural do SNC, use um anel de plástico em forma de O (Label claro reforço, Avery Dennison, Produtos Office, Brea, CA) no slide como um mini-ponte para suspender a lamínula.
8. Examinar a preparação para os padrões de boas práticas agrícolas e Elav (ou Repo) expressão sob um microscópio fluorescente.

4. A aplicação de dois complementares Gal80 conversora de ferramentas na repressão Gal4 em fotorreceptores

1. Gal80 lançando para fora através de banheira ^P> Gal80> (Figura 5A).
   1. Coletar os machos da GMR-Gal4, UAS-polyQ; banheira ^P> Gal80 line>. Note-se que os olhos compostos são normais nestas moscas.
   2. Acasalar com ey FLP-virgens.
   3. Coletar as moscas F1 e examinar o fenótipo dos olhos.
2. Flipping Gal80 em via banheira ^P> parar> Gal80 (Figura 5B).
   1. Coletar GMR-Gal4, UAS-polyQ; banheira ^P> parar> Gal80 machos e examinar o fenótipo dos olhos. Observe a degenerar e olhos despigmentados nestas moscas em comparação com cepas do tipo selvagem (Canton-S)
   2. Acasalar com ey FLP-virgens;
   3. Coletar as moscas F1 e examinar o fenótipo dos olhos.
3. Selecione ET-FLPx2 linhas com expressão em células fotorreceptoras

Passos 4.1 e 4.2 pode ser repetido usando ET-FLPx2 linhas que expressam FLP em um subconjunto de células fotorreceptoras. Em alternativa, seja a GMR-Gal4, UAS-polyQ; banheira ^P> parar> Gal80 moscas ou a GMR-Gal4, UAS-polyQ; banheira ^P> Gal80> moscas podem ser cruzados para indivíduo ET-FLPx2 linhas para triagem de linhas que expressam FLP em células fotorreceptoras. Valiosa ET-FLPx2 linhas são aqueles que só FLP expressa em um subconjunto ou células fotorreceptoras único (Figura 6).

5. Resultados representativos

O padrão de expressão de uma linha de ET-FLPx2 específico pode ser facilmente analisado e documentado na F1 larvas ou adultos moscas derivada do cruzamento entre yw, actina ^P> CD2> Gal4; UAS-GFP virgens e ET-FLPx2 do sexo masculino (Figura 1) . Normalmente, três a cinco repetições dos animais F1 são dissecados e examinados para determinar a reprodutibilidade do padrão de expressão FLP (Bohm et al., 2010). A Figura 2 mostra o padrão de expressão de FLP em ET-173A FLPx2 line no SNC larval e adulto. O padrão de FLP pode ser ainda analisados ​​usando um marcador neuronal ou glial (Figura 3 e 4).

Os resultados mostrados na Figura 7 ilustram a eficácia da Gal80 flip-e flip-out sistemas na repressão interseccional de Gal4 recombinação FLP mediada seguinte. A banheira ^P> parar> Gal80 construção não parece ter qualquer expressão de leaky Gal80 (baseado na degeneração uniforme e despigmentação de fotorreceptores), e ainda é 100% eficaz em lançar Gal80 com a ajuda de eyFLP para reprimir GMR- Gal4 e restaurar o olho às aparências normal (Fig. 7A). Pelo contrário, banheira ^P> Gal80> totalmente reprime GMR-Gal4 antes da introdução de eyFLP. Seguintes Gal80 flip-out, GMR-Gal4 drives expressão UAS-polyQ, levando à degeneração e olhos despigmentados (Fig. 7B). Neste exemplo, usamos um FLP photorecetor pan-mapear "circuitos" do fotoreceptor, mas não examinar as conseqüências comportamentais. Usando abordagens semelhantes com comportamentalmente relevantes Gal4 linhas, mapeamos parte do circuito-Gal4 CCAP regulam expansão asa nas moscas adultas (Bohm et al., 2010). Acreditamos que o método FINGR será valioso em ajudar a nossa compreensão da base neuronal de comportamento.

Figura 1. . Examinar o padrão de expressão de uma linha de ET-FLPx2 O padrão de expressão FLP (ovais azuis) de uma linha de ET-FLPx2 pode ser determinada pela passagem de uma ET-FLPx2 do sexo masculino (superior esquerdo) com um actina ^P> CD2> Gal4; UAS- GFP virgem (canto superior direito). Onipresente Actina ^P> expressão Gal4 na fêmea parental é prejudicada pela inserção do (triângulos cinza) FRT seqüência CD2 flanqueado. Na progênie F1, FLP será imposto a seqüência CD2, permitindo Actina ^P> Gal4 dirigir UAS-GFP expressão.

Figura 2. Padrão de expressão de uma linha de ET-FLPx2 na larvas e adultos do sistema nervoso central. Estas imagens retratam o SNC (cérebro e medula nervosa ventral, VNC) dissecada da prole produzida a partir de acasalamento yw, actina ^P> CD2> Gal4; UAS-GFP pais para o ET-FLPx2 173A linha. Ao recombinar a> CD2 cassete>, FLP ativa actina expressão ^P> GAL4 (a expressão conseqüente da UAS-GFP). Assim, o padrão de GFP relatórios FLP células que expressam. Um painel mostra o padrão de expressão larval FLP enquanto painel B mostra o padrão de expressão de adultos em linha 173A.

Figura 3. Caracterização de tipos de células que expressam flippase em ET-FLPx2 Line # 688A. A, A imagem composta de uma fixa de 3 ^ª F1 larva instar corados com anti-REPO de um cruzamento entre ET-FLPx2 linha # 688A e uma linha hierárquica Flippase GFP. BD, A alta ampliação view (Zeiss Plano Apochromat-63x de petróleo) retirados da extremidade posterior de um VNC a partir de uma 3 ^ª larvas.

Figura 4. Caracterização de tipos de células dentro do corpo cogumelo de ET-FLPx2 Line # 150. AC, Uma imagem de alta ampliação (63x imersão em óleo) do corpo de um cogumelo 3 F1 fixo larva instar corados com anti-REPO.

Figura 5. Ilustração de Gal80 Estratégias Flip-no e Flip-out. A. Na estratégia de flip-out, tubulina promotor-driven Gal80 (Tub ^P> Gal80>) é constitutivamente ativo, resultando na repressão da GMR-Gal4 e um fenótipo do tipo selvagem olhos (olho vermelho). Esta repressão é removida pela introdução de FLP (púrpura), que vai virar Gal80 out (do meio, vermelho) e permitir GMR-Gal4 dirigir-UAS polyQ expressão. Isso resulta em degeneração das células fotorreceptoras (ilustrado por pontos brancos no olho). B. No inverso da estratégia anterior, tubulina promotor-driven Gal80 expressão é interrompido por FRT (cinza triângulo) ladeado codon "stop". Na ausência de Gal80, GMR-Gal4 liga-se a UAS-polyQ causando degeneração neuronal em fotorreceptores (ilustrado por pontos brancos no olho). Ao cruzar a GMR-Gal4, UAS-polyQ; banheira ^P> parar> GAL80 machos com fêmeas virgens, que expressam FLP nas células fotorreceptoras, FLP (púrpura) vai catalisar a recombinação nos locais FRT, excisão do "stop" códon (médio, vermelho), permitindo assim Gal80 expressão e repressão da GMR-Gal4. Este reserva-se o neurodegeneração em células fotorreceptoras (ilustrado pela falta de white pontos no olho).

Figura 6. A aplicação do método FINGR em lançar Gal80 por meio ET-FLPx2 Line # 688A progênie F1 de um cruzamento entre ET-FLPx2 linha # virgem 688A a GMR-Gal4, UAS-polyQ;. TubP> GAL80 masculino. A falta de pigmento no meio do olho representa omatídeos expressão FLP em linha # 688A. Nesta área Gal80 supressão da GMR-Gal4 ficou aliviada permitindo que o Gal4 dirigir-UAS polyQ.

Figura 7. A aplicação do método FINGR em lançar Gal80 dentro ou para fora para cruzar Gal4 em fotorreceptores. A. A banheira ^P> parar> Gal80 sistema de flip-nos restringe GAL4 expressão de uma forma FLP-dependente. Em GMR-Gal4, UAS-polyQ; banheira ^P> parar> GAL80 moscas, células fotorreceptoras são degenerados e despigmentadas (fly esquerda). Após a introdução da eyFLP, Gal80 é expressa em células fotorreceptoras, resultando em repressão cheio de GMR-Gal4, que por sua vez desliga o polyQ expressão e produz moscas com olhos normais (voar para a direita). B. A banheira ^P> Gal80> Flip -out sistema funciona de maneira oposta como a banheira ^P> parar> Gal80 flip-no sistema. Banheira ^P> Gal80> constitutivamente reprime GAL4 e suprime a expressão de polyQ (esquerda voar, com os olhos normal). Após a introdução da eyFLP, Gal80 está virado para fora a partir de células fotorreceptoras, aliviando a supressão da GMR-Gal4 e ligar o polyQ expressão. Isto leva a degenerar e voa com os olhos despigmentados (voar para a direita).

Discussão

O sistema Gal4/UAS tem sido amplamente utilizada com sucesso por Drosophilists para vários estudos biológicos (Brand & Perrimon, 1993; Duffy, 2002). Até à data, a comunidade mosca tem gerado milhares de promotor-driven e enhancer-trap Gal4 linhas. Uma das principais contribuições do método FINGR é que ele é compatível com o sistema Gal4/UAS, tornando possível expandir significativamente o poder de Gal4 em Drosophila estudos.

Uma aplicação importante do método é FINGR circuitos neurais subjacentes afinar comportamento através Gal4/Gal80 cruzamento. Esses comportamentos podem incluir, mas não estão limitados a, aprendizado e memória, namoro, sono e ritmo circadiano. O método FINGR também pode ser usado para mapear os neurônios críticos que são propensas a neurodegeneração na modelagem humana doenças neurodegenerativas, como Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica (ALS), e doenças de Parkinson. Da mesma forma, focos de neurônios ou circuitos neurais crucial para mediar a cocaína, álcool e dependência de outra substância poderia ser mapeados usando o método FINGR. Note-se que Gal4s condicional (Osterwalder et al, 2001;.. Roman et al, 2001) poderia ser usado com o método FINGR, a fim de obter o controle temporal de circuitos neurais e comportamentos. Modificação do Gal80 conversora de ferramentas usando uma Gal80 sensíveis à temperatura ^(ts Gal80, McGuire et al., 2003) pode produzir banheira ^P> parar> Gal80 ^ts ou banheira ^P> Gal80 ^ts>, acrescentando ainda mais flexibilidade temporal na manipulação de circuito. Além do sistema nervoso, o método FINGR é igualmente aplicável a restrição Gal4 expressão em subconjuntos de células se é a asa ou a perna.

As linhas de ET-FLPx2 será um recurso valioso para todos os biólogos interessados ​​em Drosophila FRT / FLP análise baseada clonal (Xu & Rubin, 1993), incluindo MARCM (Lee & Luo, 1999). Espera-se também que algumas linhas de ET-FLPx2 pode substituir heatshock FLP-para a produção de clones reprodutível e de repetidas análises morfológicas e comportamentais. Como linhas Gal4 enhancer-armadilha, a maioria dos ET-FLPx2 linhas não são susceptíveis de ser expresso especificamente nas células do seu interesse. A maioria das linhas vai expressar FLP nas células de interesse e em outras células ou tecidos também. No entanto, a falta de "especificidade do tecido de ambas as Gal4 e ET-FLPx2 não vai ser uma grande preocupação para o método FINGR enquanto a sua região de sobreposição é desejável para uma experiência particular. FINGR é projetado para ligar dois 'grandes' sistemas em um refinado.

Os métodos ilustrados nestes protocolos são bastante padrão e deve ser reprodutível. Os principais passos de advertência que exigem atenção de alguém são a seleção e uso do fixador. Fixadores que não PFA devem ser evitados, porque eles vão saciar sinal de boas práticas agrícolas. Temos também observou que o prato dissecção não deve ser usado para fixação com PFA para evitar a possibilidade de que a expressão FLP não será confiável relatado por GFP.