Application de cartographie et de Enhancer-trap expression flippase dans larvaire et adulte Drosophile SNC

Résumé

Nous décrivons une flippase induite intersectionnelle Gal80/Gal4 répression (FINGR) méthode, permettant tissu-spécifique FLP pour déterminer les profils d'expression GAL80. Partout où Gal4 et le chevauchement FLP, Gal4 expression est activée (GAL80 flippé) ou désactiver (GAL80 basculé dans). La méthode FINGR est polyvalente pour l'analyse clonale et la cartographie des circuits neuronaux.

Résumé

La méthode binaire Gal4 / UAS est puissant pour le gène et la manipulation de circuits neuronaux chez la drosophile. Pour la plupart des études neurobiologiques, cependant, l'expression de Gal4 est rarement tissu-spécifique suffisante pour permettre la corrélation précise du circuit avec affichage de comportement. Pour surmonter cet obstacle majeur, nous avons récemment développé la méthode FINGR pour parvenir à une plus restrictive Gal4 expression dans le tissu d'intérêt. La méthode FINGR a trois composantes: 1) le système traditionnel Gal4/UAS; 2) un ensemble de FLP / FRT médiée GAL80 outils de conversion, et 3) enhancer-trap FLP (HE-FLP). Gal4 est utilisé pour définir les circuits primaires de neurones d'intérêt. Parure du Gal4 avec un SAMU-effectrices, telles que SAMU-MJD78Q ou SAMU-Shi ^ts, régule l'activité neuronale, qui est à son tour, se manifeste par des modifications dans le comportement voler. Avec un supplément de SAMU-rapporteur comme UAS-GFP, le circuit neuronal impliqué dans le comportement spécifique peut être simultanément mappé pour l'analyse morphologique. Pour Gal4 lignes avec une expression large, Gal4 expression peut être restreinte en utilisant deux complémentaires GAL80-conversion outils: baignoire ^P> GAL80> ('flip out ») et le bain à ^P> arrêter> GAL80 (« flip »). Enfin, les enquêteurs peuvent se tourner GAL80 allumé ou éteint, respectivement, avec l'aide de tissu-spécifique HE-FLP. Dans le flip-en mode, GAL80 va réprimer l'expression de Gal4 où Gal4 et HE-FLP se croisent. Dans le mode flip-out, GAL80 soulagera Gal4 la répression dans les cellules qui se chevauchent Gal4 et FLP. Les deux approches permettent la restriction du nombre de cellules dans le circuit de Gal4-défini, mais dans une tendance inverse. La méthode FINGR est compatible avec la vaste collection de Gal4 lignes dans la communauté voler et extrêmement polyvalent pour l'analyse clonale traditionnelle et pour la cartographie du circuit neuronal. Dans ce protocole, nous démontrons la cartographie des profils d'expression FLP dans certaines HE-FLPx2 lignes et l'efficacité de la méthode dans les cellules photoréceptrices FINGR. Le principe de la méthode FINGR devraient également être applicables à d'autres organismes modèles génétique dans lequel Gal4/UAS, GAL80 et FLP / FRT sont utilisés.

Protocole

1. Souches de drosophile

1. Gal4 conducteur:
   GMR-Gal4, qui exprime Gal4 de cellules photoréceptrices.
2. Lignes SAMU
   SAMU-MJD78Q (ou UAS-polyQ), ce qui provoque la dégénérescence neuronale dans les cellules exprimant Gal4.
   UAS-GFP, qui exprime la GFP dans les cellules exprimant Gal4.
3. Lignes FLP
   ey-FLP, qui exprime FLP dans les photorécepteurs et en sous-ensembles de régions cérébrales.
   HE-FLPx2 lignes, qui sont enhancer-trap lignes contenant deux copies du FLP (FLP-IRES-FLP). Nous avons généré ~ 1000 HE-FLP lignes (Bohm et al., 2010), dont l'expression schémas ne sont pas encore caractérisés. Ici, nous décrivons la caractérisation du profil d'expression de sélectionner HE-FLPx2 chez la mouche système central larvaire et adulte nerveux central (SNC).
4. Reporter FLP
   yw, actine ^P> CD2> Gal4; UAS-GFP (Pignoni & Zipursky, 1997), qui relève du modèle d'expression de l'ET-FLPx2 travers actine ^P> Gal4; UAS-GFP sur FLP-médiée excision par recombinaison des> CD2.
5. Deux complémentaires GAL80-conversion des outils
   Baignoire ^P> GAL80> (Gordon & Scott, 2009), la construction flip-out, qui exprime de manière constitutive GAL80 dans tous les tissus piloté par un promoteur de la tubuline forte. Sur FLP médiée recombinaison> GAL80 est retournée sortir et GAL80 expression est terminée seulement en ET-FLPx2 exprimant tissus.
   Baignoire ^P> arrêter> GAL80 (Bohm et al., 2010), le flip-de construire, qui n'exprime pas GAL80 dans des conditions normales. GAL80 expression est allumé par le promoteur de la tubuline seulement dans l'ET-FLPx2 exprimant des tissus dans lesquels FLP éjecté arrêter> et des culbutes dans GAL80.
6. Mouches pour tester l'activité FLP dans les yeux composés
   GMR-Gal4, UAS-polyQ; baignoire ^P> arrêter> GAL80 (Bohm et al, 2010.), Qui a dégénéré et les yeux dépigmentées. En exprimant FLP cellules photoréceptrices, l'expression polyQ est éteint suivantes GAL80 flip-in.
   GMR-Gal4, UAS-polyQ; (. Bohm et al, 2010) baignoire ^P> GAL80>, qui a les yeux normaux. En exprimant FLP cellules photoréceptrices, l'expression polyQ est allumé suivantes GAL80 flip-out.

2. Réactifs

Tampon phosphate salin (PBS, 1X), pH 7,4.
4% de paraformaldéhyde (PFA), dilué dans du PBS de 16% PFA, EM grade (Cat # 15710, sciences de la microscopie électronique, Hatfield, PA)
PBT, 1XPBS contenant 0,1% de Triton X-100 (Sigma)
Anti-Elav (MAB, 9F8A9; études développementales hybridomes Banque, Université de l'Iowa), les taches de tous les neurones de la drosophile.
Anti-Repo (mAb 8D12; Developmental Studies hybridomes Banque, Université de l'Iowa) taches cellules gliales chez la drosophile.
Alexa 594 poulets contre les anticorps de souris secondaire (Invitrogen)

3. Cartographie du modèle d'expression des lignes FLPx2 enhancer-trap (* étapes critiques)

1. Recueillir les femelles vierges de la yw, actine ^P> CD2> Gal4; UAS-GFP en ligne et croix pour les hommes de chaque HE-FLPx2 lignes. Le premier sert un journaliste GFP pour l'expression tissulaire de l'ET-FLP.
2. * Disséquer errance 3 _ème stade F1 larves, conservent le SNC (par exemple, le cerveau et la moelle nerveuse ventrale, VNC) et la paroi du corps, fixer pendant 1 heure à 4% PFA sur la glace, laver 3x avec PBS glacé suivie par lave 3X avec PBT.
   Dissection
   1. Retirer errance 3 ^ème stade F1 larves et les placer dans un plat propre Sylgard (35 mm x 10 mm boîte de Petri remplie de 2 grammes de Sylgard - mélangés selon les instructions de fabrication).
      1. Enlevez les débris alimentaires avec le pinceau
   2. Remplir le plat avec glacée 1XPBS et le placer sur la glace pour anesthésier les larves
   3. Tenir les crochets d'une larve de la bouche avec une paire de pinces et de saisir la cuticule à proximité de la spiracle étendre antérieure avec une autre paire de pinces et le zeste de la cuticule vers l'extrémité postérieure. Le CNS sera joint à la bouche des crochets avec les glandes salivaires, l'intestin, et les disques imaginaux.
   4. Retirer l'excès de tissus et de disques imaginaux entourant le SNC.
   5. Transférer la SNC en PBS-remplie 3 bien plat en pyrex.
      1. Un siliconé P200 pointe de la pipette peut être utilisé pour éviter le dessèchement des tissus.
   6. Fix pendant 1 heure dans 200 ul de 4% PFA sur la glace.
      1. Assurez-vous que le SNC est complètement immergé dans la PFA.
         1. Si le SNC flotteurs, ce qui suggère généralement que le SNC n'est pas correctement nettoyée par les tissus environnants.
   7. Laver 3x avec PBS glacé suivie de lavages 3X avec PBT.
3. * Disséquer le SNC de mouches F1 adulte.
   1. Anesthésier les mouches avec du CO ₂ ou le lieu des mouches contenue dans un flacon vide sur la glace pendant 10 minutes.
   2. Placez adulte vole dans un plat en verre rempli de EtOH à 95% sur la glace pendant 30 sec.
   3. Transférer les mouches adultes dans un plat en verre remplis 1XPBS sur la glace.
      1. Lavez 3X avec glacée 1X PBS pour éliminer EtOH résiduelles
   4. Placez une mouche dans une Sylga 35mmvaisselle ème rempli glacée PBS 1X
   5. Placez la face ventrale vers le haut et insérez un stylo petit insecte (broches minutiens 0,1 mm) à mi-chemin à travers l'abdomen.
      1. En utilisant une paire de pinces tenir la base des jambes et retirer les jambes avec une autre paire de pinces.
   6. Enlever la cuticule tête
      1. Tout en saisissant la trompe avec une paire de pinces, placer un autre sous l'oeil et le zeste de la cuticule vers la ligne médiane dorsale de la tête de la mouche.
      2. Prenez l'autre œil et retirer la cuticule qui restent de l'autre côté.
      3. En utilisant une pince forte et / ou d'une aiguille de tungstène aiguisé, enlever le tissu entourant le cerveau trachéale
         1. Un mauvais nettoyage de la trachée se traduira par une forte auto-fluorescence, obstruant expression de la GFP, et permettre au cerveau de flotter lors de la fixation
   7. Dissection VNC
      1. Enlever la cuticule thoraciques
         1. À partir de l'extrémité postérieure du thorax, placer deux pinces de chaque côté de l'preepisternum 3 ^e (ie, en saisissant la base des pattes postérieures).
         2. Séparez doucement les cuticules loin de la ligne médiane ventrale, répétez cela jusqu'à ce que vous atteigniez la base du cou.
         3. Écartez doucement les deux moitiés de la cuticule thoraciques exposer la VNC
      2. Retirer ensuite l'abdomen du thorax. Tout en utilisant une paire de pinces pour tenir le thorax à la base la deuxième étape, utiliser une autre paire de pinces pour attraper l'abdomen près du premier sternite abdominal et tirez hors de l'abdomen.
      3. Pour enlever la VNC du tissu environnant thoracique. Tenez la région humérale avec une paire de forceps et avec une autre paire de pinces à la déchirure douce loin la majorité de la carcasse thoracique.
      4. A ce stade il doit y avoir un anneau de tissu conjonctif entourant le connectif cervical (cou). En utilisant deux pinces lacrymogènes en dehors de l'anneau.
      5. Retirez tout excès de tissu entourant le thorax VNC
   8. Transfert du cerveau et VNC pour 9-même en pyrex plat contenant du PBS 1X sur la glace
      1. Un siliconé P200 pointe de la pipette peut être utilisé pour éviter le dessèchement des tissus
4. * Correction du SNC adulte pendant 1 heure à 4% PFA sur la glace et lave-glace 3X avec du PBS froid et 3X avec PBT.
5. Incuber la préparation pour adultes du SNC ou la CNS larvaire et paroi du corps à 4 ° C pendant la nuit avec des anticorps soit neurones (anti-Elav, 01h10) ou des cellules gliales (anti-Repo. 1:10). Laver la préparation 5X avec PBT.
6. Incuber à la préparation des adultes ou larves avec Alexa 594 poulets contre la souris anticorps secondaire (1:100) à température ambiante pendant 2 heures, et laver la préparation avec du PBS.
7. Montez le SNC larvaire ou adulte sur une diapositive. Afin de préserver la forme naturelle de la SNC, utiliser un anneau en plastique en forme de O (Label Renforcement Clair, Avery Dennison, Office Products, Brea, CA) sur la lame comme un pont mini-pour suspendre la lamelle.
8. Examinez la préparation de modèles d'expression de GFP et Elav (ou Repo) sous un microscope à fluorescence.

4. L'application de deux complémentaires GAL80-convertissant les outils de la répression dans les photorécepteurs Gal4

1. Retournement GAL80 par l'intermédiaire baignoire ^P> GAL80> (figure 5A).
   1. Recueillir les mâles de la GMR-Gal4, UAS-polyQ; baignoire ^P> GAL80 ligne>. Notez que les yeux composés sont normales dans ces mouches.
   2. S'accoupler avec ey-FLP vierges.
   3. Recueillir les mouches F1 et d'examiner le phénotype des yeux.
2. Retournement GAL80 en via baignoire ^P> arrêter> GAL80 (figure 5B).
   1. Recueillir GMR-Gal4, UAS-polyQ; baignoire ^P> arrêter> GAL80 mouches mâles et examiner le phénotype des yeux. Remarque dégénérés et les yeux dépigmentées dans ces mouches par rapport aux souches de type sauvage (Canton-S)
   2. S'accoupler avec ey-FLP vierges;
   3. Recueillir les mouches F1 et d'examiner le phénotype des yeux.
3. Sélectionnez HE-FLPx2 lignes avec une expression dans les cellules photoréceptrices

Étapes 4.1 et 4.2 peuvent être répétées en utilisant ET-FLPx2 lignes qui expriment FLP dans un sous de cellules photoréceptrices. Alternativement, soit le GMR-Gal4, UAS-polyQ; baignoire ^P> arrêter> GAL80 mouches ou GMR-Gal4, UAS-polyQ; baignoire ^P> GAL80> mouches peuvent être croisées pour chaque HE-FLPx2 lignes à l'écran des lignes qui expriment FLP dans les cellules photoréceptrices. Valuable HE-FLPx2 lignes sont celles qui ne FLP exprimer dans un sous-ensemble ou cellules photoréceptrices unique (figure 6).

5. Les résultats représentatifs

Le profil d'expression d'un particulier HE-FLPx2 ligne peut être facilement examiné et documenté dans les larves F1 ou mouches adultes issus du croisement entre yw, actine ^P> CD2> Gal4; UAS-GFP vierges et HE-FLPx2 hommes (figure 1) . Typiquement, trois à cinq répétitions des animaux F1 sont disséqués et examinés pour déterminer la reproductibilité du modèle de l'expression du FLP (Bohm et al., 2010). Figure 2 montre le profil d'expression de FLP ET-173A FLPx2 ligne dans le SNC larvaire et adulte. Le modèle FLP peut encore être analysées à l'aide d'un marqueur neuronal ou gliales (Figure 3 & 4).

Les résultats présentés dans la figure 7 illustrent l'efficacité de GAL80 flip-dans et flip-out des systèmes dans la répression intersectionnelle de Gal4 suivantes FLP médiée recombinaison. La baignoire ^P> arrêter> GAL80 de construire ne semble pas avoir toute expression qui fuient des GAL80 (basé sur la dégénérescence uniforme et dépigmentation des photorécepteurs), et pourtant il est efficace à 100% dans le retournement GAL80 avec l'aide de eyFLP pour réprimer GMR- Gal4 et restaurer l'œil aux apparences normales (figure 7A). Au contraire, baignoire ^P> GAL80> entièrement réprime GMR-Gal4 avant l'introduction de eyFLP. Après GAL80 flip-out, GMR-Gal4 disques SAMU-polyQ d'expression, conduisant à dégénérer et les yeux dépigmentée (Fig. 7B). Dans cet exemple, nous avons utilisé une FLP pan-photorecetor au Plan «circuits» le photorécepteur, mais n'a pas examiné les conséquences comportementales. En utilisant des approches similaires avec behaviorally pertinentes Gal4 lignes, nous avons cartographié une partie du CCAP-Gal4 circuit de régulation d'expansion dans l'aile des mouches adultes (Bohm et al., 2010). Nous croyons que la méthode FINGR seront précieuses pour aider notre compréhension de la base neuronales du comportement.

Figure 1. . Examiner le schéma d'expression d'une HE-FLPx2 ligne Le profil d'expression FLP (ovales bleu) à partir d'une ligne de HE-FLPx2 peut être déterminé en traversant une HE-FLPx2 mâle (en haut à gauche) avec une actine ^P> CD2> Gal4; SAMU- GFP vierge (en haut à droite). Ubiquitous actine ^P> Gal4 expression dans la femelle parentale est entravée par l'insertion de la FRT (triangles gris) séquence CD2 flanqué. Dans la descendance F1, FLP accise de la séquence du CD2, permettant d'actine ^P> Gal4 de conduire UAS-GFP expression.

Figure 2. Modèle de l'expression d'une ligne de HE-FLPx2 dans le système larvaire et adulte nerveux central. Ces images montrent le SNC (moelle nerveuses du cerveau et ventrale, VNC) disséqué de la progéniture produite à partir de l'accouplement yw, actine ^P> CD2> Gal4; UAS-GFP aux parents de l'ET-173A FLPx2 ligne. En recombinant les> CD2> cassette, FLP active actine ^P> GAL4 expression (l'expression conséquente de UAS-GFP). Ainsi, le modèle GFP rapports FLP cellules exprimant. Le panneau A montre le schéma d'expression alors que les larves de FLP panneau B montre le profil d'expression des adultes en 173A ligne.

Figure 3. Caractérisation des types de cellules qui expriment flippase dans ET-FLPx2 Line # 688A. Un, Une image composite d'une larve fixée F1 3 ^ème stade teinté d'anti-REPO d'un croisement entre ET-FLPx2 ligne # 688A et une ligne GFP rapports flippase. BD, un fort grossissement (Zeiss Plan-Apochromat 63x huile) vue prise de l'extrémité postérieure d'un VNC à partir d'un 3 ^ème stade des larves.

Figure 4. Caractérisation des types de cellules dans le corps de champignons de l'ET-FLPx2 Ligne n ° 150. AC, Une image à fort grossissement (63x immersion dans l'huile) du corps de champignons à partir d'une larve fixée F1 au 3ème stade teinté d'anti-REPO.

Figure 5. Illustration de GAL80 Stratégies de prise de contrôle et Flip-out. A. Dans la stratégie de flip-out, la tubuline promoteur axée GAL80 (baignoire ^P> GAL80>) est constitutivement actif, résultant dans la répression de la GMR-Gal4 et un phénotype oculaire de type sauvage (yeux rouges). Cette répression est éliminé par l'introduction de FLP (violet), qui sera retourner GAL80 sortir (au milieu, rouge) et permettre GMR-Gal4 de conduire SAMU-polyQ expression. Il en résulte une dégénérescence des cellules photoréceptrices (illustré par des points blancs dans l'œil). B. Dans la réciproque de la stratégie précédente, la tubuline promoteur axée GAL80 expression est interrompu par FRT (triangles gris) flanqué "stop" codon. En l'absence de GAL80, GMR-Gal4 se lie à la SAMU-polyQ provoquant une dégénérescence neuronale dans les photorécepteurs (illustré par des points blancs dans l'œil). En franchissant les GMR-Gal4, UAS-polyQ; baignoire ^P> arrêter> GAL80 mâles avec des femelles vierges qui expriment FLP dans les cellules photoréceptrices, FLP (violet) va catalyser la recombinaison à des sites FRT, excisant le "stop" codon (milieu, rouge), permettant ainsi GAL80 expression et répression de la GMR-Gal4. Cette réserve la neurodégénérescence dans les cellules photoréceptrices (illustrée par le manque de white points dans l'œil).

Figure 6. L'application de la méthode de retournement FINGR GAL80 à l'aide de l'ET-FLPx2 Line # 688A descendance F1 d'un croisement entre ET-FLPx2 ligne # 688A vierge pour GMR-Gal4, UAS-polyQ;. TubP> GAL80 masculins. L'absence de pigment dans le milieu de l'oeil représente l'expression ommatidies FLP en ligne # 688A. Dans ce domaine GAL80 suppression de GMR-Gal4 été soulagé permettant Gal4 de conduire SAMU-polyQ.

Figure 7. L'application de la méthode de retournement FINGR GAL80 dans ou hors de croiser Gal4 dans les photorécepteurs. A. La baignoire ^P> arrêter> GAL80 flip-dans le système restreint GAL4 expression dans une manière FLP-dépendante. En GMR-Gal4, UAS-polyQ; baignoire ^P> arrêter> GAL80 mouches, les cellules photoréceptrices sont dégénérées et dépigmentées (mouche à gauche). Après l'introduction de eyFLP, GAL80 est exprimée dans les cellules photoréceptrices, résultant en une répression complète de la GMR-Gal4, qui à son tour éteint la polyQ expression et produit des mouches aux yeux normaux (mouche de droite). B. La baignoire ^P> GAL80> Flip -out système fonctionne de la manière opposée comme la baignoire ^P> arrêter> GAL80 flip-dans le système. Baignoire ^P> GAL80> constitutivement réprime GAL4 et supprime l'expression de polyQ (à gauche volée, avec des yeux normaux). Après l'introduction de eyFLP, GAL80 est retournée à partir de cellules photoréceptrices, soulageant la suppression de la GMR-Gal4 et en tournant sur la polyQ expression. Cela conduit à mouches avec dégénèrent et les yeux dépigmentées (mouche de droite).

Discussion

Le système Gal4/UAS a été largement et utilisé avec succès par Drosophilists pour diverses études biologiques (Marque & Perrimon, 1993; Duffy, 2002). À ce jour, la communauté mouche a généré des milliers de promoteur à moteur et enhancer-trap Gal4 lignes. Une des grandes forces de la méthode FINGR est qu'il est compatible avec le système Gal4/UAS, ce qui permet d'élargir considérablement la puissance de Gal4 dans des études chez la drosophile.

Une application importante de la méthode FINGR est de circuits neuronaux sous-jacents d'affiner le comportement travers Gal4/Gal80 intersection. Ces comportements peuvent inclure, mais ne sont pas limités à, l'apprentissage et la mémoire, la parade nuptiale, le sommeil et le rythme circadien. La méthode FINGR peut également être utilisé pour cartographier les neurones essentiels qui sont sujettes à la neurodégénérescence dans la modélisation des maladies neurodégénératives humaines comme la maladie d'Alzheimer, la sclérose latérale amyotrophique (SLA), et les maladies de Parkinson. De même, des foyers de neurones ou circuits neuronaux cruciale pour la cocaïne médiation, l'alcool et la toxicomanie d'autres pourraient être cartographiés à l'aide de la méthode FINGR. Il convient de noter que Gal4s conditionnelle (Osterwalder et al, 2001;.. Roman et al, 2001) pourrait être utilisé avec la méthode FINGR afin d'obtenir le contrôle temporel des circuits neuronaux et les comportements. Modification de la GAL80-conversion d'outils en utilisant un GAL80 sensibles à la température ^(TS GAL80, McGuire et al., 2003) peut produire baignoire ^P> arrêter> GAL80 ^ts ou baignoire ^P> GAL80 ^ts>, ajoutant flexibilités supplémentaires temporelle dans la manipulation du circuit. Au-delà du système nerveux, la méthode FINGR est également applicable à restreindre Gal4 expression dans des sous-ensembles de cellules si c'est l'aile ou la jambe.

Les lignes HE-FLPx2 sera une ressource précieuse pour tous les biologistes s'intéressent à la drosophile FRT / FLP-analyse clonale (Xu & Rubin, 1993), y compris MARCM (Lee & Luo, 1999). Il est également prévu que certaines HE-FLPx2 lignes peuvent remplacer heatshock-FLP pour produire des clones reproductibles et répétés des analyses morphologiques et comportementales. Comme enhancer-trap Gal4 lignes, la plupart des HE-FLPx2 lignes sont peu susceptibles d'être exprimé spécifiquement dans les cellules de son intérêt. La plupart des lignes vont exprimer FLP dans les cellules d'intérêt et dans d'autres cellules ou de tissus ainsi. Cependant, le manque de "spécificité tissulaire» des deux Gal4 et ET-FLPx2 ne sera pas une préoccupation majeure pour la méthode FINGR aussi longtemps que leur zone de chevauchement est souhaitable pour une expérience particulière. FINGR est conçue pour transformer deux «grands» systèmes en un raffiné.

Les méthodes illustrées dans ces protocoles sont plutôt standard et doit être reproductible. Les principales étapes mises en garde qui requièrent son attention sont la sélection et l'utilisation du fixateur. Fixateurs autres que l'IFP doit être évitée car ils vont étancher signal de la GFP. Nous avons également noté que le plat de dissection ne doit pas être utilisé pour la fixation au PFA afin d'éviter la possibilité que l'expression FLP ne sera pas fiable rapportés par la GFP.